基于水解探针法的快速检测地中海贫血中国型缺失型的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学检测技术领域，具体设及一种基于水解探针法的快速检测地中海 贫血中国型缺失型的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常 见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有a-地贫和0-地贫。中国人群中，a-地 贫的基因型常见的为缺失型一SE\-ai7和-a4^2。在日常检测中申请人发现中国型缺失 (G丫+(A丫 5 0)0,简写为DBT)在广西人群中有一定分布比例，而中国型缺失等位基因并 未在常规地贫检测试剂盒W内。为了避免中国型缺失罕见等位基因的漏筛，需要建立一种 可W快速诊断DBT等位基因的检测试剂盒。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血中 国型缺失型的试剂盒。采用该试剂盒可W实现单管单次反应完成DBT运种罕见缺失型地中 海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，W及较高的特异性。
[0004] 本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血中国型缺失型的试剂盒，包 括扩增引物和巧光探针，其特征在于： 阳005] 所述的扩增引物为：一对扩增0 -珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和 DBT-R，其中：
[0006] DBT-F:5' -GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3';
[0007]DBT-R:5'-ACCACATCCCTAACACAAC-3,；
[0008] 所述的巧光探针为特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的巧光探针DBT-Prob,具 体为：
[0009] DBT-Prob: 5' -ROX-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-B册-2-3，。
[0010] 上述试剂盒中的巧光探针中，ROX指簇基-X-罗丹明，B册-2是指巧光泽灭基团。
[0011] 本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血中国型缺失型的试剂盒，还 包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgClz和dNTP。具体地，酶液为 Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲 液；当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaqDNAPolymerase时，缓冲液则优选为 与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。
[0012] 采用上述试剂盒快速检测DBT的方法包括W下步骤： 阳01引 1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
[0014]。配制反应体系，具体为： 阳〇1引将引物DBT-F和DBT-R，巧光探针DBT-Prob,W及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、 水和DNA模板配制成反应体系；
[0016] 3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的巧 光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可W反映所检测模板数的多 少）；
[0017] 4)数据分析及结果判定：根据实时巧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果，当ROX通道有Cq值读数时，则表示该样本携带DBT等位基因；当ROX通道没有Cq值读 数时，则表示该样本不携带DBT等位基因。
[0018] 与现有技术相比，本发明的特点在于：
[0019] 1、本发明所述试剂盒可W实现单管单次反应完成DBT运种罕见缺失型地中海贫 血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，W及较高的特异性。
[0020] 2、本发明所述试剂盒应用于巧光水解探针法检测DBT等位基因时，无需开管操 作，极大限度地降低了实验室PCR产物污染的可能。
[0021] 3、采用巧光水解探针的实验方案比现有其他方法所需时间少，对设备要求不高。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；
[0023] 图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，W更好地理解本发明的内容，但 本发明并不限于W下实施例。
[0025] 实施例1:采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果 阳0%] 1、试剂盒的组成：
[0027] 扩增0 -珠蛋白基因簇中DBT等位基因征序列的引物DBT-F和DBT-R :
[0028] DBT-F:5,-GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3,（SEQ ID NO:1);
[0029]DBT-R:5,-ACCACATCCCTAACACAAC-3,（SEQ ID NO:2);
[0030] 特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的巧光探针DBT-Prob为：
[0031]DBT-Prob :5'-R0X-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-B册-2-3'（SEQ ID NO:3);
[0032] 其它组成成分：
[0033] GoldStar Taq DNA Polymerase、与GoldStar Taq DNA Polymerase配套的缓冲液 和dNTPs均购自康为世纪，MgClz购自Life Technology。
[0034] 按下述表I配制PCR反应体系：
[0035]表1 : (ml表不mmol/L U M表不Ji mol/L)
[0036]
[0037] 2、实施方法：
[0038] PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95°C预变性 10分钟，然后95°C 15秒，60°C退火60秒，40个循环，于60°C退火步骤末采集巧光信号。
[0039]样本处理：采用L油-Aid DNA mini extraction kid度i〇-V, Xiamen)试剂盒抽提 DM, W双蒸水稀释至20~20化g/ y L备用。DNA样本也可采用其他常规DNA提取方法提 取。
[0040] 样本检测：将1份用常规方法检测确定的已知基因型待检样本（简称1#样本）， W及1份正常基因型（aa/aa，N/N)样本（简称2#样本），根据上述反应体系和反应程 序，于巧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录Cq值。
[0041] 3、样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的DNA样本。
[0042] 4、数据分析及结果判定：根据实时巧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结 果。当ROX通道有Cq值读数时，则表示该样本携带DBT等位基因；当ROX通道没有Cq值读 数时，则表示该样本不携带DBT等位基因。
[0043] 经检测分析，1#样本的ROX通道有Cq值读数（扩增曲线如图1所示，Cq值读数由 表2所示），表示1#样本携带DBT等位基因；2#样本的ROX通道没有Cq值（谱图如图2所 示，Cq值读数由表3所示），表示2#样本不携带DBT等位基因。
[0044]表 2 :
[0045]
[0046]表 3 :
[0047]
[0048] 可见，采用本发明所述试剂盒进行DBT缺失型地中海贫血等位基因检测时，结果 准确；而且野生型样本无非特异性扩增Cq值，具有较高的特异性。
[0049] 实施例2:本发明所述试剂盒在随机基因型样本中的检测效果。
[0050] I、试剂盒的组成： 阳05U 同实施例1。
[0052] 2、实施方法： 阳05引 同实施例1。
[0054] 3、样本来源： 阳化5] 样本为14例随机样本（由钦州市妇幼保健院提供），W双蒸水稀释至20~20化邑， 作为待检样本），W及经Gap-PCR验证的1例野生型样本，1例DBT等位基因携带者。
[0056] 4、数据分析及结果判定：
[0057]根据实时巧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果。当ROX通道有Cq值读 数时，则表示该样本携带DBT等位基因；当ROX通道没有Cq值读数时，则表示该样本不携带 DBT等位基因。结果如下述表4所示。
[0058]表 4 :
[0059]
[0060] 注：样本类型中化g Ctrl=阴性对照，Pos Ctrl=阳性对照，化kn=未知样本类 型，检测结果中，N/A=无Cq值。
[0061] 结果显示，野生型样本与阳性样本检出Cq值与理论一致，随机样本中检出一例 DBT等位基因。
【主权项】
1. 基于水解探针法的快速检测地中海贫血中国型缺失型的试剂盒，包括扩增引物和荧 光探针，其特征在于： 所述的扩增引物为：一对扩增(6-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和 DBT-R，其中： DBT-F :5' -GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3' ； DBT-R :5' -ACCACATCCCTAACACAAC-3' ； 所述的荧光探针为特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob，具体 为： DBT-Prob :5'-R0X-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-BH Q-2-3'。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括缓冲液、酶液、 MgCljP dNTP。
【专利摘要】本发明公开了一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血中国型缺失型的试剂盒。该试剂盒包括一对扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R，其中：DBT-F：5’-GGGTGAGGAACAATTGAA？AC-3’；DBT-R：5’-ACCACATCCCTAACACAAC-3’；以及一条特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob：5ˊ-ROX-ACTATCA？CACCCTGCTTACCTCTGATGGA-BHQ-2-3’。本发明所述试剂盒可以实现单管单次反应完成DBT缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105154575
【申请号】CN201510701635
【发明人】庞婉容, 龙驹, 孙雷
【申请人】钦州市妇幼保健院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月26日