一种寸三莲典型品系的分子鉴定方法及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及湘莲品种的分子鉴定方法，具体设及表型优良的寸=莲典型品系的分 子鉴定方法及所用的引物。
【背景技术】
[0002] 巧莲（NelumbonuciferaGa&rtn.)是我国的特色水生蔬菜之一，其果实-莲子可 供食用、药用，其花朵-荷花是中国十大名花之一，深受人们喜爱和广泛种植，其中湖南巧 莲品种"寸=莲"因其优良品质在清道光、光绪期间作为贡莲，更倍受人瞩目。寸=莲=颗 莲子正好一寸长，故称"寸=莲"，色白、营养，百克莲子的蛋白质含量比鸡蛋还高。作为"寸 =莲"的起源地，寸=莲一直作为当地重要的经济作物，在大面积推广种植。目前各"寸= 莲"种植户一般都是自行留种进行种植，种植户之间存在多种"寸=莲"品系或株系，且各品 系或株系之间品质存在较大的差异。"寸=莲"运种比较混乱的市场，给湘莲市场和湘莲品 牌带来了不利影响。因此很有必要对当前混乱的"寸=莲"品系或株系亲缘关系进行分子 检测分析，从分子水平上探索不同巧莲资源的遗传差异，并最终获得对表型优良、当地政府 主推的核屯、品系"341"及其亲缘关系很近的巧莲品种具较好识别作用的鉴定体系。
[0003] SRAP标记，相关序列扩增多态性（sequence-relatedamplifiedpolymo;rphism， SRAP)是一种基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与如iros博± 2001年 提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-basedamplifiedpolymo;rphismSBAP)。该标 记通过独特的引物设计对〇RF(openreading化ames)进行扩增，上游引物长17bp，5'端前 10个碱基为"填充"序列（fillersequence)，无任何特异组成，接着为CCGG序列，它们组 成核屯、序列及3'端3个选择性碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18bp，5'端前11 个碱基为"填充"序列，紧接着是AATT，它们组成核屯、序列及3'端3个选择性碱基，对内含 子区域、启动子区域进行特异扩增。因个体不同W及物种的内含子、启动子与间隔区长度不 等而产生多态性。该标记具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于 图谱构建、比较基因组学和遗传多样性分析。
[0004] 因此，本发明W前期研究确定田间种植表型优秀、编号为"341"号的寸S莲为核屯、 品系（已被湘潭县科技局鉴定认可），W"寸=莲"原产地的湖南湘潭区域内101份"寸= 莲"和21份太空莲等巧莲品种为对比材料，应用SRAP技术，进行了试验研究，得到用于鉴别 寸=莲典型品系的引物对、反应体系及其特异性扩增条带。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的是提供一种对寸=莲表型优良的典型品系的分子鉴定方法及其所 用的引物，给寸=莲运一湘莲品牌中优良品系的筛选和鉴定提供有力的依据和有效简便的 方法。
[0006] 一种寸S莲典型品系的分子鉴定方法，待检测品种的DNA利用W下引 物对进行PCR扩增，上游引物ME6 :5' -TGAGTCCAAACCGGACA-3'，下游引物EM2 : 5' -GACTGCGTACGAATTTGC-3';扩增出39化p的特异性条带则鉴定为寸S莲典型品系。
[0007] 上述PCR扩增反应体系为12. 5yL，其中d地2〇 7. 05yL，DNA模板2yL， bufferl. 25yLdNTPsl. 0yL上下游引物各 0. 5yLTaq酶 0. 2yL;PCR扩增程序为：94°C 预变性5min，之后共35个循环：94°C变性20s，54°C退火20s，72°C延伸30s;最后72°C延伸 7min〇
[0008] 本发明利用SRAP标记技术筛选到一对可w用于鉴定表型优良的寸s莲典型品系 的引物及其扩增的特异性条带，能够对当前混乱的寸=莲湘莲品种亲缘关系进行分子检测 分析，从分子水平上探索不同巧莲资源的遗传差异，并最终获得对表型优秀、编号为"341" 号的"寸=莲"核屯、品系及其亲缘关系很近的巧莲品种具较好识别作用的鉴定体系。
【附图说明】
[0009] 图1为本发明部分子莲样品DNA提取结果电泳图；
[0010] 图2为本发明引物对ME6+EM2扩增结果电泳图（部分样本）；
[0011] 图3为本发明引物对ME6+EM2扩增结果电泳图（部分样本）。
【具体实施方式】
[0012] W下结合【具体实施方式】旨在进一步说明本发明，而不会形成对本发明的限制。
[0013] 1.材料与方法
[0014] 1.1.1巧莲样品的采集
[0015]W湘莲"寸=莲"为主要研究对象，收集了湖南湘潭地区"寸=莲"品种资源102份 (其中含"341"号核屯、品系），其中排头乡29份，龙口乡16份，乌石镇14份，石鼓镇13份， 白石镇10份，中路铺镇10份，茶恩寺镇6份，石潭巧镇4份。另外采集了外地品种广昌莲 和議莲62号等外来引进品种21份作为对比。
[0016] 1. 1. 2巧莲样品的DNA提取
[0017] 取巧莲幼嫩叶片，液氮研磨粉碎后，应用下述方法提取样品的DNA:称取Ig样 品液氮研磨至粉碎，转移至1. 5ml的离屯、管中，再加入600yL经65°C预热过的2. 5 %的 CTAB，65°C水浴比，每隔lOmin颠倒混匀一次；加入体积比为25:24:1的酪/氯仿/异戊醇 600y以充分混匀，冰浴lOmin后，4°C、12000巧m平衡离屯、20min;取上清液至另一干净的离 屯、管中，加入500yL冰冷的异丙醇，轻轻混匀，放入4°C冰箱保存30min后，4°C、12000巧m 平衡离屯、5min;倒掉上清液，加入1ml的无水乙醇清洗DNA，离屯、Imin，倒掉乙醇，惊干后加 入50iiLd地2〇。提取结果用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 引 1.1. 3引物筛选
[0019] 为筛选出多态性好、扩增稳定的引物组合，利用田间表型鉴定出编号为341号（来 自于排头乡长山黄见德）的核屯、品系，进行SRAP标记技术用的共计225对引物的筛选。所 用引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系为12. 其中(1地2〇 7.05iiLDNA 模板 2yLbufferl. 25yLdNTPsl. 0yL上下游引物各 0. 5yLTaq酶 0. 2yL。PCR扩增 程序为：94°C预变性5min，之后共35个循环：94°C变性20s，54°C退火20s，72°C延伸30s。 最后72°C延伸7min。PCR产物通过8%的聚丙締酷胺凝胶电泳进行检测，进行引物的筛选。
[0020] 1. 1. 4"寸S莲"核屯、品系"341"分子标记的确定
[002U 利用筛选出的多态性好、扩增稳定的引物组合对所有样品进行PCR扩增，PCR反应 体系和反应程序同上。PCR产物通过8 %的聚丙締酷胺凝胶电泳进行检测，寻找能检测出核 屯、品系"341"的特异性柄;记。
[0022] 2结果与分析 阳02引 2. 1巧莲样品DNA的提取
[0024] 应用1. 1. 2所述的方法，能获得较好的样品DNA，结果见图1。 阳0巧]2. 2SRAP引物筛选
[0026] 筛选出了 16对多态性好、扩增稳定的引物ME1+EM3 ;ME3+EM10 ;ME4+EM5 ; ME5+EM1；ME5+EM7 ；ME6+EM2 ；ME6+EM4 ；ME8+EM2 ；ME8+EM6 ；ME8+EM12 ；ME11+EM12 ； ME12+EM4 ;ME14+EM3 ;ME14+EM7 ;ME14+EM10 ;ME15+EM9,具体引物序列见表 1。
[0027] 表1筛选出的引物序列
[0028]
[0029] 2. 3获得核屯、品系"341"的特异性分子标记
[0030] 利用筛选出的多态性较好引物组合进行SRAP分析。其中上游引物 ME6 (5 ' -3 'TGAGTCCAAACCGGACA)加下游引物EM2 (5 ' -3 'GACTGCGTACGAATTTGC)的引物组合 对341号有特异性扩增，扩增条带长度在390bp左右（图2和图3所示）。部分样品来源如 表2所示。试验结果还显示，该特异性分子标记除对核屯、品系"341"具有重复性很好的鉴 别作用外，还对供试的123份样品中其它的12份样品也扩增出了条带（样品来源见表3)。 溯源运些样品在田中的表型，发现它们的产量、花型、花色及对腐败病的抗性等都与"341" 相近，可认定与"341"号同属于表型优良的寸S莲同一典型品系。
[0031] 表2部分供试样品来源
[0032]
[0033] 表3具备341号相同特异性条带的样品
[0034]
[0035] 近年来，W分子标记为重点的植物分子生物学研究迅猛发展，为研究品种之间的 遗传差异提供了新的方法和手段，分子标记技术和DM指纹分析技术已广泛应用于农作物 的种质鉴定。SRAP技术也已被应用在莲的遗传研究上。本发明通过利用SRAP技术，首先筛 选得到了多组对寸=莲核屯、品系341号扩增稳定，多态性好的引物组合，再利用运些引物 通过同其他122份样品的比较，获得了ME6+EM2的特异性的分子标记引物，"341"号品系扩 增出一条约390bp大小的特异性条带。而其中能在供试的123份样品中也扩增出特异性条 带其它的12份样品在田中的表型都与"341"相近，运可能是由于运些品种和经表型鉴定 作为核屯、品系的341号有较近的亲缘关系所致。由于寸=莲主要在湖南湘潭地区种植，具 有较强的地域特性，品种之间遗传距离小，导致区分难度加大，本发明开发的ME6+EM2运组 分子标记，获得了特异性较高的扩增片段，可W作为品种鉴定的辅助手段，经重复试验，扩 增稳定，重复性好，可W区分亲缘关系较远的品种，较大限度的识别"寸=莲"的核屯、品系及 其亲缘关系较近的品种，为"寸=莲"表型优良的典型品系的分子鉴定提供有力的依据和有 效简便的方法。
【主权项】
1. 一种寸三莲典型品系的分子鉴定方法，其特征在于，籽莲待检测品种的DNA利用 以下引物对进行PCR扩增，上游引物ME6 :5' -TGAGTCCAAACCGGACA-3'，下游引物EM2 : 5' -GACTGCGTACGAATTTGC-3' ；扩增出390bp的特异性条带则鉴定为寸三莲典型品系。2. 根据权利要求1所述的寸三莲典型品系的分子鉴定方法，其特征在于，PCR扩增反应 体系为 12. 5yL，其中CldH2O7. 05yL，DNA模板 2yL，buffer1. 25yL，dNTPsI.OyL，上 下游引物各〇. 5yL，Taq酶0. 2yL;PCR扩增程序为：94°C预变性5min，之后共35个循环： 94°C变性 20s，54°C退火 20s，72°C延伸 30s;最后 72°C延伸 7min。3. 用于寸三莲典型品系的分子鉴定的引物，其特征在于，序列如下： 上游引物ME6 :5' -TGAGTCCAAACCGGACA-3'， 下游引物EM2 :5' -GACTGCGTACGAAITTGC-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种对寸三莲典型品系进行分子鉴定的方法及引物。籽莲待检测品种的DNA若利用筛选出的引物扩增出390bp的特异性条带则鉴定为表型优良的寸三莲典型品系。本发明利用SRAP标记技术筛选到一对可以用于筛选鉴定表型优良的寸三莲典型品系的引物及其扩增的特异性条带，能够对当前混乱的湘莲品种亲缘关系进行分子检测分析，从分子水平上探索不同籽莲资源的遗传差异，并最终获得对表型优良的寸三莲核心品系及其亲缘关系很近的籽莲品种具较好识别作用的鉴定体系。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105200141
【申请号】CN201510666808
【发明人】魏林, 梁志怀, 吕刚, 张屹, 马艳青, 陈玉荣, 胡雅辉
【申请人】湖南省植物保护研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月15日