一株二叔丁基对甲酚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株二叔下基对甲酪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安 全免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 2, 6-二叔下基对甲酪（BHT)，是一种油溶性的有机化合物。它主要在食品添加剂 中被用作为抗氧化剂（E编码为E321)，也在化妆品、药物、飞机燃料、橡胶、石油制品和标本 中有抗氧化作用。虽毒性较大，但其抗氧化能力较强，耐热及稳定性好，既没有特异臭，也 没有遇金属离子呈色反应等缺点，而且价格低廉，仅为抗氧化剂下基径基茵香酸（BHA)的 1/5~1/8,我国仍作为主要抗氧化剂使用。一般与BHA配合使用，并W巧樣酸或其他有机 酸为增效剂。我国规定可用于食用油脂、油炸食品、饼干、方便面、速煮米、果仁罐头、干鱼制 品和騰腊肉制品，最大使用量0. 2g/kg。
[0003] 目前检测二叔下基对甲酪的方法主要有气相色谱法（GC)、液相色谱法（HPLC)、分 光光度法、电化学测定法、气质联用法等方法，但是运些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较 贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的二叔下基对甲酪检测 方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时 对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异 性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株对二叔下基对甲酪具有较好特异性和检测灵敏度的单 克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用。
[0005] 本发明的技术方案，提供一株二叔下基对甲酪单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细 胞株制备的抗体对二叔下基对甲酪具有较好特异性和检测灵敏度，可W用来建立二叔下基 对甲酪的免疫学检测方法。
[0006] 一株二叔下基对甲酪单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为2B2,已保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期为2015年5 月19日，保藏编号为CGMCCNo. 10870。
[0007] 二叔下基对甲酪单克隆抗体，由所述保藏号为CGMCCNo. 10870的二叔下基对甲 酪单克隆抗体杂交瘤细胞株2B2所分泌产生。 阳00引本发明提供的2B2细胞株的制备基本步骤为： (1)完全抗原的合成：称取BHT类似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA)24. 8mg，碳 二亚胺（EDC) 38. 3mg，径基班巧酷亚胺（畑S) 23.Omg，用1血无水DMF溶解(称为A液)， 室溫揽拌反应地。称取牛血清白蛋白（BSA) 56mg溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中 (称为B液)。在室溫条件，逐滴将A液加入到B液中，室溫反应过夜，得到偶联物BHTA-BSA 混合液即为完全抗原，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收 扫描方法鉴定； (2) 小鼠的免疫：选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。二叔下基对甲酪完 全抗原BHTA-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次 免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之 间间隔21天。最后一次用二叔下基对甲酪完全抗原(不含佐剂)冲击免疫；通过间接化ISA 检测血清效价和抑制； (3) 细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤 细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接化ISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争 ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行= 次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株2B2 ; (4) 杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过化ISA法测定灵敏度和特异性。
[0009] 所述二叔下基对甲酪单克隆抗体的应用，用于食品安全中对二叔下基对甲酪的残 留检测。 阳010] 本发明的有益效果：本发明获得的抗二叔下基对甲酪单克隆抗体细胞株，对二叔 下基对甲酪有较好的检测灵敏度和特异性（ICw值为8. 9yg/L)。
[0011] 生物材料样品保藏：一株二叔下基对甲酪单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为 2B2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为单克隆细胞株，保藏 日期为2015年5月19日，保藏编号为CGMCCNo. 10870。
【附图说明】
[0012] 图1 2B2单克隆抗体的抑制标准曲线。
【具体实施方式】
[0013] 本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不能作为本发明的限定内 容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0014] 本发明通过将二叔下基对甲酪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养 基培养，通过间接化ISA和间接竞争化ISA筛选细胞上清，最终得到了对二叔下基对甲酪有 较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0015] 实施例1杂交瘤细胞株2B2的制备 (1)完全抗原的合成：称取BHT类似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA) 24. 8mg，EDC38. 3mg，N服23.Omg，用1血无水DMF溶解(称为A液)，室溫揽拌反应地。称取BSA56mg 溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中（称为B液)。在室溫条件，逐滴将A液加入到B液中， 室溫反应过夜，得到偶联物BHTA-BSA混合液即为完全抗原，通过透析分离完全抗原和未偶 联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
[0016] (2)动物免疫：选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取二叔下基对甲 酪完全抗原BHTA-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强 免之间间隔21天。S免后7天采血，使用间接竞争化ISA方法测定小鼠血清效价和抑制， 选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。
[0017] (3)细胞融合：在冲击免疫S天后，按照常规阳G(聚乙二醇，分子量为4000)方法 进行细胞融合，具体步骤如下： a、 无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数； b、 收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数； C、将脾细胞和SP2/0细胞按照1 : 5的计数比例混合，离屯、后用50%PEG融合，时间1min,之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离屯、后悬浮于含20%胎牛血清、2%的 50XHAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37°C、5% (?的培养箱中 培养。
[0018] (4)细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛 选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的IOOXHT的RPMI-1640过渡培养液 进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接化ISA筛选出阳 性细胞孔，第二步选用二叔下基对甲酪为标准品，用间接竞争化ISA对阳性细胞进行抑制 效果测定。选择对二叔下基对甲酪标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚 克隆，用同样的方法进行检测。重复=次，获得细胞株2B2。
[0019] (5)单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡 油ImL;7天后每只小鼠腹腔注射1XIO6杂交瘤细胞，从第屯天开始收集腹水，将腹水通过 辛酸-硫酸锭法纯化，获得的单抗置于-20°C保存。
[0020] 使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体二叔下基对甲酪的ICso为：8. 9yg/L，说明 对二叔下基对甲酪有很好的灵敏度，可用于二叔下基对甲酪免疫分析检测。 阳02U 实施例2抗体应用 将杂交瘤细胞株2B2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于二叔下基对甲酪的快速 检测，具体步骤如下： 曰、包被：将包被原BHTA-OVA用0. 05MpH9.6碳酸盐缓冲液从2嗦/mL开始倍比稀释， 10〇4 17孔，37°(：反应化； b、洗涂：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涂液洗涂3次，每次3min; C、封闭：拍干后，加入200yL/孔封闭液，37°C反应化，洗涂后烘干备用；t加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，IOOyL/ 孔，37°C反应Ih;充分洗涂后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG, 100yL/孔，37°C反应 比； e、 显色：将酶标板取出，充分洗涂后，每孔加入IOOiiL的TMB显色液，37°C避光反应 ISmin; f、 终止和测定：每孔加入50M1 2MH2SO4终止液W终止反应，然后用酶标仪测定各孔 的〇〇4日。值； 邑、结果判读：W〇〇45。值大于或等于阴性对照孔的2. 1倍（即P/N> 2. 1)所对应的血清 最高稀释倍数即为血清的化ISA效价； 11、标准曲线：配置0、1、2、5、10、20、50和100^旨/16册标准溶液，采用间接竞争化15八 绘制标准曲线，其ICs。为8. 9yg/L。 阳0巧溶液的配置： 碳酸盐缓冲液（CBS):称取NazCOs1.59g，NaHC〇3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合， 加双蒸水至约SOOmL混匀，调pH值至9. 6,加双蒸水定容至1000 mL, 4°C胆存备用； 憐酸盐缓冲液（PBS):8.00g化Cl，0.2gKCl，0.2gKH2P04,2.9gNa2HP04?12H20， 溶于800血纯水中，用化OH或肥1调抑到7. 2~7. 4,定容至1000血； PBST:含 0. 05% 吐溫 20 的PBS; TMB显色液：A液：胞2册〇4 ? 12&0 18. 43g，巧樣酸9. 33g，纯水定容至1000血；B液： 60mgTMB溶于100血乙二醇中；A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
[0023] 2B2单克隆抗体的交叉反应率如表1所示。
[0024] 表1. 2B2单克隆抗体的交叉反应率
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本 发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
【主权项】
1. 一株二叔丁基对甲酚单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为2B2,已保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 10870。2. 二叔丁基对甲酚单克隆抗体，其特征在于：由所述保藏号为CGMCCNo. 10870的二 叔丁基对甲酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2B2所分泌产生。3. 权利要求2所述的二叔丁基对甲酚单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全 中对二叔丁基对甲酚的残留检测。
【专利摘要】一株二叔丁基对甲酚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。本发明的二叔丁基对甲酚单克隆抗体杂交瘤细胞株2B2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.10870。二叔丁基对甲酚单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC？No.10870的杂交瘤细胞株2B2所分泌产生，此细胞株分泌的单克隆抗体，对二叔丁基对甲酚具有较好的特异性和检测灵敏度IC50值为8.9μg/L，可以用于食品安全中二叔丁基对甲酚的残留检测。CGMCC No.1087020150919
【IPC分类】C07K16/44, C12R1/91, C12N5/20, G01N33/577
【公开号】CN105296436
【申请号】CN201510798015
【发明人】刘丽强, 孙成, 胥传来, 匡华, 徐丽广, 马伟, 吴晓玲, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月19日