周氏啮小蜂热激蛋白Hsp70的cDNA全长序列及应用
【专利说明】周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70的cDNA全长序列及应用
[0001] 本发明得到：国家自然科学基金（31201730);天津市高等学校科技发展计划项目 (20110602);天津师范大学博±基金（52XB1003)及天津市动植物抗性重点实验室开放基金 的资助。
技术领域
[0002] 本发明属于分子生物技术领域，研究周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70的CDNA全长序列 和不同溫度下Hsp70表达的变化。
【背景技术】
[0003]热激蛋白化atshockprotein化sp)是一类在生物体内广泛存在的，对体内外 环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物 研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp70与 溫度胁迫应激性密切相关。溫度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的溫 度范围内生物体才能进行物质能量代谢W维持正常生理活动，超出溫度的耐受范围都会使 生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高溫或低溫刺激后，蛋白合成量会有 显著变化，用W增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含 量使生物体更好生存，可W认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。
[0004]周氏晒小蜂紐(旭ioiaYang是我国重要入侵物种美国白蛾巧 (化ury)的重要寄生性天敌，体长1.1-1. 5mm，群集内寄生于美国白蛾蛹中，是抑制 美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国白蛾外，还 可寄生于鱗翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蛹科、寄蛹科及銷 翅目的叶甲科和瓢甲科等。
[0005]通过野外释放C 可W达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境 下，C 的活力会受到多重因素的影响，其中，溫度作为一个主要生态因素，会影响C 的生命力。在合适的溫度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。本发明通过转录 组测序，报道了一个周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70的CDNA全长序列，该序列可为深入研究周 氏晒小蜂的溫度耐受性机制奠定基础。通过实时巧光定量PCR方法，研究不同溫度下白蛾 周氏晒小蜂化p70基因表达的变化，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏晒小蜂提供理论 基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是报道一个周氏晒小蜂热激蛋白基因Hsp70基因的cDNA全序列及 其对于溫度协迫的影响。
[0007] 本发明采用的技术方案是通过转录组测序获得周氏晒小蜂热激蛋白基因Hsp70 基因的全序列，在通过RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp70基因表达的变化。
[000引为此本发明公开了如下的技术内容： 周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70的核巧酸序列，该序列全长1083bp，含完整的开放阅读 框，具有SEQIDNO. 1所示的核巧酸序列。对应的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示；该序列 编码360个氨基酸，分子量为39. 9邸曰，等电点为6. 92。
[0009] 本发明进一步公开了周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70的核巧酸序列在用于检测防治 美国白蛾病方面的应用。所述防治美国白蛾指的是：Hsp70基因表达受溫度调控，通过检测 Hsp70基因的表达情况，可W得知周氏晒小蜂对于溫度胁迫的耐受情况，在低于周氏晒小蜂 承受极限溫度下释放小蜂，可W更好的起到防治美国白蛾的目的。通过实时巧光定量PCR 方法，研究不同溫度下白蛾周氏晒小蜂化p70基因表达的变化，研究结果可为科学利用天 敌昆虫周氏晒小蜂提供理论基础。
[0010] 周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70基因，其CDNA序列和编码氨基酸的序列如表1、表2所 /J、-O
本发明公开的周氏晒小蜂热激蛋白Hsp70的cDNA全长序列的优点在于： (1)本发明是在国内外首次公开周氏晒小蜂化p70基因的CDNA全序列，该序列可为深 入研究周氏晒小蜂的溫度耐受性机制奠定基础。
[0012] (1)在通过RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp70基因表达的变化，结果显示在 不同溫度条件下周氏晒小蜂体内的Hsp70基因的表达水平处于一个动态过程中，高溫和低 溫胁迫都使周氏晒小蜂体内Hsp70有一个高的表达量，在40°C和-7°C体内表达量最大。因 此本发明的提出研究了周氏晒小蜂适应外界环境的变化，避免受到胁迫因子对自身的伤害 的保护机制，对于防治美国白蛾有重大意义，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和 技术。
【附图说明】
[0013] 图1为周氏晒小蜂化p70在相同时间不同溫度胁迫下表达变化。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例说明本发明，运里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专 业人员按照本发明的精神可W对其进行改进和变化，所述的运些改进和变化都应视为在本 发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中 所述的提取白蛾周氏晒小蜂总RNA的提取，CDNA的合成，实时巧光定量RT-qPCR等方法都 是本领域成熟的技术，试剂盒TransSc;ript?RT、TransSta;rt?TopGreenqPCRSuperMix等 都可W从生产商家购买。
[001引实施例1 : 获得白蛾周氏晒小蜂Hsp70基因序列 实验材料取自室内传代培养的白蛾周氏晒小蜂(培养条件：于人工气候箱（PQX-350H) 中，溫度25°C，相对湿度60%~80%，无光黑暗)。取羽化后24h内的雌性周氏晒小蜂，于解剖 镜下切取触角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，AM7020)中；每200头雌性白蛾周氏晒小 蜂的触角胆存于一个1. 5mL离屯、管中，共捜集8管样品，并于-2(TC下低溫保存，样品制备 完成后送华大基因科技服务有限公司化ttp://www.genomics,cn/index)进行转录组测序。
[0016] 应用高通量测序平台IlluminaHiSeqTM2000对周氏晒小蜂触角样本进行转录组 测序，采用Trinity软件对每个读取序列片段进行聚类后拼接成unigene，再结合生物信 息学软件进行祀标序列cDNA全长的判定，进行Blast同源序列检索予W确认，得到化p70 基因cDNA序列和编码氨基酸的序列。
[0017] 实施例2: 总RNA的提取 选取30头左右白蛾周氏晒小蜂进行不同溫度处理，高溫处理（Ih)为28°C、32°C、36°C、 4〇°c和42°c;低溫处理（比）为irc、6°c、rc、-3°C、-7°C。处理后产物立即使用或保存 于-20°C冷冻。
[0018] (I)取30头左右白蛾周氏晒小蜂置于I. 5血的无菌离屯、管内，倒入液氮并迅速用 研磨棒进行充分研磨。将600yLTrizon溶液加入离屯、管，静置5min。
[0019] (2)将200yL氯仿加入离屯、管，剧烈振荡15s，静置3min。
[0020] (3) 4°C下1200化pm离屯、15min，将上层无色水相转入新无菌离屯、管中，加入 400yL异丙醇，-20°C下放置 20min，12000巧m离屯、lOmin。
[0021] (4)小屯、倒掉管中液体，保留沉淀，加入600yL75%乙醇洗涂沉淀。4°C下7500巧m 离屯、5min，再重复一次乙醇洗涂沉淀操作。
[0022] (5)小屯、弃去上清液，室溫干燥2min。将RNA沉淀溶于20yLRelutionBuffer中， 必要时可55°C-60°C水浴IOmin。
[0023] (6)所得沉淀即为白蛾周氏晒小峰总RNA，产物立即使用或冷冻保存于-70°C 实施例3 : cDNA的合成 W实施例2所述白蛾周氏晒小蜂总RNA作为模板。取一消毒的0.2mL离屯、管，加入W下反应体系（20JiL体系）：TotalRNA5JiL,orRandomPrimer(N9) (0.1Hg/JiDlyL， 2XTSReactionMixIOuL，TransScript?RT/RIEnzymeMixIuL，RNase-freeWater 3yL，混匀。
[0024] 反应条件为25°C水浴保溫10分钟，42°C水浴保溫30分钟，85°C高溫加热5分钟， W使离屯、管中存留的TransScript?RT失去活性。产物立即使用或保存于-20°C冷冻。
[002引 实施例4 : 巧光定量PCR反应体系和条件 (1) 引物设计：根据所得化p70基因的全长序列，使用Primer5软件设计适用于实时 巧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
(2) 实时巧光PCR:运用SYBRGreen嵌合巧光法进行RT-PCR分析。使用CF96XPCR仪 (Bio-Rad)进行PCR反应。W上述实施例3中合成的CDNA为模板，用上述（1)中所设计的 特异性引物，进行实时巧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管 的Ct值(即每个反应管内的巧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数）取平均数。 [0026]实时巧光PCR扩增体系设置如下：
实时巧光PCR扩增参数设置如下： 50°C120s； 95°C120s;95°CIs;60°C30s(40 个循环）； 白蛾周氏晒小蜂在不同溫度下Hsp70基因相对表达量计算： 当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用厂&&ET法计算各个溫度下化p7〇基因 的mRNA相对表达量，用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏新复极差法检验 不同处理间差异显著性。
[0027] 图1为不同溫度下周氏晒小蜂化p70基因的相对表达量。从图中看出无论是高溫 还是低溫都可W影响周氏晒小蜂体内的Hsp70的表达。在低溫胁迫的情况下，随着溫度的 不断降低，周氏晒小蜂体内的Hsp70的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7°C时达到最大 表达量；在高溫胁迫的情况下，随着溫度的不断升高，周氏晒小峰体内的Hsp70的相对表达 量也呈上升的趋势，但在4(TC时达到最大表达量。运对于W后在何种室外溫度下放飞白蛾 周氏晒小蜂防治美国白蛾具有重要意义。
【主权项】
1. 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp70的核苷酸序列，该序列全长1083bp，含完整的开放阅读 框，具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。2. 权利要求1所述的序列，其中所述核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所 示；该序列编码360个氨基酸，分子量为39. 9KDa，等电点为6. 92。3. 权利要求1所述周氏啮小蜂热激蛋白Hsp70的核苷酸序列在用于检测防治美国白蛾 方面的应用。4. 权利要求3所述的应用，其中所述防治美国白蛾指的是：Hsp70基因表达受温度调 控，通过检测Hsp70基因的表达情况，可以得知周氏啮小蜂对于温度胁迫的耐受情况，在低 于周氏啮小蜂承受极限温度下释放小蜂，可以更好的起到防治美国白蛾的目的。
【专利摘要】本发明公开了周氏啮小蜂热激蛋白Hsp70的cDNA全长序列及应用，该序列全长1083bp，含完整的开放阅读框，编码360个氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法，研究不同温度下白蛾周氏啮小蜂Hsp70基因表达的变化，结果表明，高温和低温胁迫都会诱导周氏啮小蜂Hsp70表达量增高，在40℃和-7℃时表达量最大。本发明可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂进行生态防治提供分子基础。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/12
【公开号】CN105296496
【申请号】CN201510837997
【发明人】李敏, 王凤竹, 张新玥, 李婷婷, 朱耿平, 刘强
【申请人】天津师范大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月26日