一种天冬酰胺酶分泌能力提高的重组枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种天冬酰胺酶分泌能力提高的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶 工程领域。
【背景技术】
[0002] L-天冬酰胺酶（EC3. 5. 1. 1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤 其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物， 对骨髓细胞没有抑制作用。
[0003] L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwinia chrysanthemi、Β· subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅 L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi L-天 冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有 抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
[0004] L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中 的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可 以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳动物及植物被证实含 有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有 易培养，成本低等优点，成学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括 Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi 等，但野生菌株L-天冬酉先 胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天 冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。
[0005] 如何在食品安全菌株中表达L-天冬酰胺酶并提高L-天冬酰胺酶分泌能力，是目 前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述问题，以高效分泌信号肽菌株为基础，通过构建p43强启动子菌株， 实现天冬酰胺酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效表达，得到了天冬酰胺酶分泌 能力提尚的菌株。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种天冬酰胺酶分泌能力提高的重组枯草芽孢杆菌， 所述重组枯草芽孢杆菌以PP43NMK质粒为载体，表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶基 因；所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶基因的氨基酸序列是SEQ ID N0. 1。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶基因的核苷 酸序列是SEQ ID N0. 2。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶基因是连接 到PP43NMK质粒的Κρη I，Pst I酶切位点，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行表达。 [0010] 在本发明的一种实施方式中，所述天冬酰胺酶是L-天冬酰胺酶II。
[0011] 本发明还提供一种利用所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产天冬酰胺酶的方法。
[0012] 所述方法是将重组枯草芽孢杆菌种子液按照4 %的接种量转接于发酵培养基中， 37°C培养24h，然后发酵液离心，取上清即为胞外粗酶液，细胞破碎上清液即为胞内粗酶液。
[0013] 本发明还要求保护所述重组枯草芽孢杆菌以及其生产得到的天冬酰胺酶在制备 药物方面的应用。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] 本发明通过构建p43强启动子菌株，实现L-天冬酰胺酶II在食品级安全菌株-枯 草芽孢杆菌中的高效表达，提高了 L-天冬酰胺酶II的分泌能力，与出发菌株相比，本发明 的重组菌胞外分泌L-天冬酰胺酶II的效率提高了 1. 4倍。
【附图说明】
[0016] 图1 :不同菌株发酵天冬酰胺酶酶活；
[0017] 图2 :WB43H分批补料发酵。
【具体实施方式】
[0018] 培养基：
[0019] LB 培养基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L，ρΗ7· 0 ;
[0020] 发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，尿素 lg/L，蔗糖35g/L，磷酸氢二钾 2. 3g/L，磷酸二氢钾 L 7g/L，硫酸镁 0· 75g/L，氯化钠 5g/L ;调节 ρΗ6· 8-7. 0。
[0021] 天冬酰胺酶酶活力的测定：
[0022] 采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活。1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活 定义：在37°C反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放Ιμπιο? ΝΗ3所需要的酶量 为一个酶活单位（U/ml)。酶活测定条件：37°C条件下，lml 10mM Κ2ΗΡ04-ΚΗ2Ρ04(ΡΗ7. 5)， 0. lml 189mM天冬酰胺，0. lml发酵上清液，保温30分钟，0. 5ml 1. 5Μ TCA终止反应。利用 ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶 活。
[0023] 实施例1 :重组菌的构建
[0024] 设计L-ASP的上下游引物Pl、P2(如表1所示），以前期构建的 pMA0911-wapA-SP-ansZ为模板，通过PCR的方式扩增含有WapA信号肽的L-ASP基因 。PCR 条件为：981€31^11，981€305,551€905、72 1€905,34个循环。？〇?扩增体系：模板141^， 上下游引物各 lyL，dNTP Mix4yL，5XprimeSTAR BufferlOyL，灭菌的双蒸水 32.5yL， prime STAR DNA聚合酶0.5 μ L。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验 回收产物的浓度。Κρη I，Pst I酶切胶回收产物（目的基因 L-ASP)及pP43NMK质粒（表 达载体），柱回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质 粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因 L-ASP与载体pP43NMK连接，连接体 系：目的基因4 μ L，载体ρΡ43ΝΜΚ1 μ L，solution I 5 μ L，16°C过夜连接。将连接好的重组 质粒PP43H转化到感受态E. coil JM109,用氨苄青霉素 LB平板，挑取阳性菌落。37°C摇床 过夜培养后提取质粒，命名为PP43H，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。相应 的，将测序重组质粒PP43H再转入枯草芽孢杆菌WB600,以获得WB43H。
[0025] 此外，发明人还采用类似的方法以PyxiE、PlapS、Pglv等强启动子（分别是质粒 pPyxiHl、pPlapSH和pPglvH)介导含有WapA信号肽的L-ASP基因的在WB600中的表达，构 建了 重组菌 WByxiEH、WBPlapSH 和 WBPglvH 等。
[0026] 表1引物
[0028] 实施例2 :重组菌发酵生产L-天冬酰胺酶
[0029] 将实施例1构建的重组菌WB43H、WByxiEH、WBPlapSH和WBPglvH等，与出发菌株 pMA0911-wapA-SP-ansZ/B. subtilisWB600(以 pMA0911 为载体，Hpall 为启动子）分别接种 于10mL含卡那霉素的LB养基中，37°C振荡培养过夜，次日按4%的接种量转接于枯草芽孢 杆菌发酵培养基中，37°C培养24h，取发酵液于4°C，10000r/min离心10min，上清为胞外粗 酶液，用于酶活力的测定。
[0030] 发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，尿素 lg/L，蔗糖35g/L，磷酸氢二钾 2. 3g/L，磷酸二氢钾 L 7g/L，硫酸镁 0· 75g/L，氯化钠 5g/L ;调节 ρΗ6· 8-7. 0。
[0031] 对天冬酰胺酶活力进行测定，结果表明：与出发菌株比较，突变株WB43H的L-ASP 的胞外酶活力提高了 40%，达到39. 52U/ml，而突变株WByxiEH、WBPlapSH和WBPglvH的 L-ASP的胞外酶活力仅仅提高了 7%、5%和12%。
[0032] 在3L发酵罐上，以WB43H为发酵菌株，通过补料分批发酵，发酵40h胞外酶活最高 达到 109. 15U/ml (图 2)。
[0033] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种天冬酰胺酶分泌能力提高的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽 孢杆菌以PP43NMK质粒为载体，表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶基因；所述含有WapA 信号肽的L-天冬酰胺酶基因的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1。2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述含有WapA信号肽的 L-天冬酰胺酶基因的核苷酸序列是SEQIDNO. 2。3. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述含有WapA信号肽的 L-天冬酰胺酶基因是连接到PP43NMK质粒的KpnI，PstI酶切位点，然后转化到枯草芽孢 杆菌WB600中进行表达。4. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述天冬酰胺酶是L-天冬 酰胺酶II。5. -种利用权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产天冬酰胺酶的方法。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是将重组枯草芽孢杆菌种子液 按照4%的接种量转接于发酵培养基中，37°C培养24h，然后发酵液离心，取上清即为胞外 粗酶液，细胞破碎上清液即为胞内粗酶液。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：大豆蛋白胨10g/ L，玉米浆5g/L，尿素lg/L，蔗糖35g/L，磷酸氢二钾2. 3g/L，磷酸二氢钾1. 7g/L，硫酸镁 〇.75g/L，氯化钠 5g/L。8. 权利要求5-7所述方法得到的天冬酰胺酶在制备药物方面的应用。9. 权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌在制备药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种天冬酰胺酶分泌能力提高的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于酶工程领域。本发明以高效分泌信号肽菌株为基础，通过构建p43强启动子菌株，实现天冬酰胺酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效表达，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。与出发菌株相比，本发明的重组菌胞外分泌L-天冬酰胺酶II的效率提高了1.4倍。
【IPC分类】A61P35/02, C12N1/21, C12N9/82, A61K38/50, A61K35/742, C12R1/125
【公开号】CN105316274
【申请号】CN201510827520
【发明人】刘松, 阮洁, 冯岳, 陈坚, 堵国成, 蕉蕴, 程宏烨, 高慧, 吕志阳, 闫沐
【申请人】江南大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月25日