Kcp基因突变序列、检测方法、以及kcp基因突变在区分肾癌干细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本申请属于生物检测领域，具体涉及肾癌干细胞特异性基因突变的鉴定及检测， 以及所述突变在区分肾癌干细胞中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，利用基因测序技术发现特定肿瘤中的特异性基因突变用于肿瘤的诊断已经 被现有技术公开，如申请号为201410213970涉及基因 STAG2基因突变序列，所述的STAG2 突变及其检测方法在检测膀胱癌中的应用；申请号为201410255625的发明专利申请则涉 及用于胆囊预后评估的ERBB信号通路突变靶向测序方法；申请号为201410274543则公开 的是利用人类BRAF基因突变检测引物和探针及其试剂盒。
[0003] 肾细胞癌是泌尿系统肿瘤中致死率最高的肿瘤类型。随着第二代测序技术的广泛 应用，高通量测序的结果揭示了，VHL基因的高频突变所导致的蛋白水解作用途径（UMPP) 的失活和PBRM1基因的高频突变所介导的染色质调节的紊乱，共同促进了肾细胞的发生。 然而，负责肾癌转移和耐药的肾癌干细胞的基因水平的突变至今没有报道。
[0004] KCP(kielin/chordin - like protein)是人类基因组中的一组编码基因，由48个 外显子组成，位于CR7q32. 1。含有18个半胱氨酸的富集区域。KCP能够增强BMP介导的 (bone morphogenetic proteins)的信号通路。KCP在肾损伤中起重要作用，KCP的缺失易 造成肾纤维化。
【发明内容】
[0005] 本发明设计和发明一种检测KCP基因突变的方法，并公开了 KCP基因突变检测用 于鉴别肾癌干细胞的方法。
[0006] 为了探索肾癌干细胞中特有的突变，我们对一列肾癌患者的肿瘤进行了单细胞消 化，流式分选，然后将分选获得的肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞结合癌旁组织一起进行了单 细胞外显子测序。通过生物信息学的严格分析，发现了 1个特有的显著突变。
[0007] 通过对新诊断的患者获取肾癌肿瘤样本、外周血或正常对照组织，选取肾癌细胞 纯度超过85%的组织用于DNA提取和测序。采用单细胞流式分选方法，分选出肾癌干细胞 和非干细胞。使用Single Cell Kit对单细胞的基因组进行DNA提取和扩增，并构建DNA 文库。米用SureSelect Human All Exon 50Mb Kit来捕获全外显子组序列，Illumina公司 的HiSeq2000平台进行全外显子组测序。继而行肾癌干细胞全外显子组体细胞突变检测， 采用Sanger测序来验证体细胞突变（图2)。筛选出只在肾癌干细胞中突变的基因，其中包 括KCP基因。本发明采用了高通量单细胞外显子测序技术和严格的生物信息学的分析，发 现了肾癌干细胞中的1个特有的显著突变（图3)。本发明的有益效果在于，设计了一种检 测KCP基因突变的方法，并公开了 KCP基因突变检测用于鉴别肾癌干细胞的方法。有助于 对肾癌基因水平的诊断、分型、治疗靶点的确立提供参考。
【附图说明】
[0008] 图1 :本申请技术方案实施的总体技术路线图；
[0009] 图2 :肾癌外显子突变频谱图；
[0010] 图3 :肾癌干细胞特有突变基因；
[0011] 图4 :PCR片段测序结果显示KCP基因的突变位点；
[0012] 图5 :随访实验验证KCP突变与病人生存期的关系。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1材料和仪器
[0014] 为了使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验实例对本发明KCP基因突 变序列，其检测方法以及KCP基因突变在检测和鉴别肾癌干细胞中的应用作进一步的说 明。全部试验的操作方法均按照仪器的说明书进行操作。
[0015] 1)试剂和仪器
[0016] SureSelect Human All Exon50Mb Kit
[0017] TruSeq RNA样品制备试剂盒（Illumina公司）
[0018] Single Cell Kit (Qiagen 公司）
[0019] Dual96 - well GeneAmp PCR System9700(Applied Biosystems)
[0020] 3730xlDNA 分析仪（Applied Biosystems)
[0021] EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen, Hilden, Germany)
[0022] HotStar Taq DNA 聚合酶（Qiagen, Hi lden, Germany)
[0023] ABI StepOne(Applied Biosystems)
[0024] SYBR Premix Ex TaqTMII (TAKARA)试剂
[0025] GeneAmp PCR System9700thermal cycler(Life Technologies)〇
[0026] 2)材料
[0027] 通过泌尿生殖系统癌症基因组联盟（UCGC)的中国成员机构，从新诊断的患者中 获取肾癌肿瘤样本和与其匹配的外周血或正常对照组织（相邻的形态正常的肾组织）。按 照伦理审查委员会规定的制度，病人在招聘研究之前均签署了知情同意书。患者的详细的 临床资料。所有的标本在收集后用液氮速冻并立即储存在-80°C用于进一步研究。苏木精 一伊红（HE)染色切片均由两个病理医生在显微镜下独立地进行评估。在本研究中，我们只 选取了肾癌细胞纯度超过85%的组织用于DNA提取和后续的测序。
[0028] 样本的选择标准：所有患者在术前都未经放疗或化疗；样本组织都是新鲜组织， 切下后30分钟内放入组织保存液中，并在4°C冷藏过夜，其后-80°C低温储存；经HE染色， 肿瘤细胞超过80%的肿瘤组织和无肿瘤细胞污染正常肾脏组织。
[0029] 实施例2组织消化和单细胞流式分选
[0030] 对于肿瘤和正常的标本，先用无菌的1640淋洗3次，1/6保存到-80,1/6保存到 多聚甲醛固定，余下2/3用无菌剪刀减碎，使用12ml - 0. 15%的胶原酶IV重悬减碎的组织 块，同时加入200ul双抗，2mlFBS。37°C消化2h。
[0031] 用1ml枪重悬消化好的组织，加到300目的晒网上过滤变为单细胞悬液。将细胞 悬液加到50ml离心管中，补加10ml 10% FBS培养基中和胶原酶，然后2. 5*103rpm/min离 心5min。弃上清，PBS重悬细胞，洗涤一次。2. 5*103rpm/min离心5min。
[0032] 预留不染色的空白对照细胞，然后先配置抗体反应液，⑶1331:200稀释⑶45， ⑶311:200稀释，用配好的无菌抗体稀释液重悬肿瘤和正常组织，冰上振摇反应lh。 2. 5*103rpm/min离心，5min收集细胞，PBS重悬洗涤一次，2. 5*103rpm/min，离心5min收集 细胞。lml无血清培养基重悬细胞，准备流式检测和分选。对于肿瘤样本，分别分选CD133 阳性和CD133阴性的肾癌干细胞和肾癌非干细胞到96孔板中，每个孔设置分选1个细胞。 对于正常的肾癌细胞，分选CD45和CD31阴性的细胞到96孔板，同样每个孔设置分选1个 细胞。分选后的细胞立即放置在干冰中，冻在-20过夜。
[0033] 实施例3单细胞基因组DNA的提取和测序
[0034] 使用Single Cell Kit对单细胞的基因组进行DNA提取和扩增，并构建DNA文库。
[0035] 按照Agilent Technologies说明书提供的实验流程，采用 SureSelect Human All Exon 50Mb Kit来捕获全外显子组序列。全外显子组测序所使用的测序平台是Illumina公 司的HiSeq2000平台，测序方式为双末端测序，测序读长为100bp。最终对三种细胞类型分 别测序10个细胞，细胞种类及编号见表1。
[0038] 实施例4肾癌干细胞全外显子组体细胞突变检测
[0039] 去除含有测序接头和包含五个以上未知碱基的低质量序列以后，我们使用BWA软 件，将过滤后的数据比对到人参考基因组（b37)，并对比对结果进行统计。比对率不低于 96%，平均深度都在130X以上，coverage在91 %以上，10X覆盖74%以上。
[0040] 使用GATK对30个细胞的数据检测snp信息，并在做校正时，使用3N和3T两个样 本snp的混合数据集做软过滤，去掉假阳性snp位点，得到的snp结果我们认为是可靠的 snp结果。
[0041] 使用校正后的单细胞snp结果。对于20个肿瘤细胞的结果，我们认为在不低于两 个细胞中存在的snp更加可靠，并用这些结果过滤掉不低于两个正常细胞中存在的snp，及 正常混合组织中存在的snp。最终剩下的snp作为这个肿瘤细胞的somatic突变（具体结 果见图2)。
[0042] 实施例5采用Sanger测序来验证体细胞突变
[0043] 针对测序出来的基因突变，我们设计了 DNA模板的引物，在每个单细胞的DNA水平 来验证测序的准确性。经过验证，验证率为186/192 = 96. 35%。
[0044] 实施例6已知肾癌基因筛选
[0045] ICGC数据库中保存有世界各国研究团体的发现的各个癌种相关基因。将这些信息 从数据库中抓取下来。其中包括三个肾癌已知的突变基因（见表2，KCNA3，MUC4和CSMD3)。
[0048] 实施例7肾癌干细胞特有突变
[0049] 筛选那些只在肾癌干细胞中突变的基因，并计算突变的显著性。获得如下基因。 KCP就位列其中（具体结果见图3)。
[0050] 实施例8肾癌干细胞中KCP突变的鉴别
[0051] 针对KCP的突变在基因组上的位置：chr7:128547482?ΧΑ
[0052] KCP - F ：GACAGCAGTGTCACTCAAGC
[0053] KCP -R：CTTTCTCATCCTGCCTCATT
[0054] 反应条件：95°C 5min，40 个循环，循环内部：95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s。延伸 72°C lOmin。产物大小 364bp。
[0055] 将扩增产物链接克隆载体选择阳性克隆送公司测序，测序结果如图4所示，即KCP 基因上的128547482位点的碱基T突变成为A)
[0056] 实施例9KCP基因突变在肾癌病例中的比例
[0057] 对57例未经过化疗或放疗的肾癌患者的临床切除标本进行组织消化和单细胞流 式分选，获得肾癌干细胞。提取肾癌干细胞的基因组并测序，测序结果与人参考基因组进行 比对统计，发现在13例病人的肾癌干细胞中KCP发生突变，突变率为22. 8%。
[0060] 实施例10KCP突变与病人生存期的关系
[0061] 通过随访实验发现，肾癌干细胞KCP突变的病人无瘤生存期为7 -22个月，中位无 瘤生存期为14. 5月，而肾癌干细胞无 KCP突变的病人无瘤生存期为15 -26个月，中位无瘤 生存期为20. 5月。存在KCP突变的肾癌患者无瘤生存期明显缩短，较无 KCP突变肾癌患者 更易复发（具体请参见图5)。对KCP的检测有助于对肾癌患者预后复发情况的评估。
【主权项】
1. 一种KCP(kielin/chordin-likeprotein)突变基因，其特征在于，与野生型的KCP 基因相比，其突变为chr7: 128547482?ΧΑ。2. -组扩增权利要求1所述的KCP突变基因的引物，其特征在于，上游引物序列为： 5' -GACAGCAGTGTCACTCAAGC-3'，下游引物序列为 5' -CTTTCTCATCCTGCCTCATT-3'。3. 权利要求1所述的突变基因或权利要求2所述的引物用于制备检测肾癌试剂盒中的 用途。4. 一种非诊断性的检测权利要求1所述的KCP突变基因的方法。
【专利摘要】本发明采用了高通量单细胞外显子测序技术和严格的生物信息学的分析，发现了肾癌干细胞中的1个特有的显著突变，为KCP基因。根据该特异性突变，设计了一种检测KCP基因突变的方法，并公开了KCP基因突变检测用于鉴别肾癌干细胞的方法。有助于对肾癌基因水平的诊断、分型、治疗靶点的确立提供参考。
【IPC分类】C12N15/12, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105316343
【申请号】CN201510680968
【发明人】李翀
【申请人】李翀
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月19日