一种基于CoI DNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于鱼类分子生物学领域，具体涉及一种鱼卵鱼苗的分类鉴定方法。
【背景技术】
[0002]鱼卵、鱼苗是鱼类早期生活史的重要阶段。开展包括鱼卵、鱼苗在内的鱼类早期资源调查，既能推算鱼类繁殖群体数量，又可以估算补充群体数量，进而科学地预测鱼类种群数量变动，为渔业资源保护和合理开发利用提供科学依据。
[0003]鉴别鱼卵、鱼苗的传统方法主要利用光学显微镜(解剖镜)来观察其形态特征。但在鱼类的生活史中，鱼卵、鱼苗阶段形态变化复杂，可用于鉴别的形态特征较少，只有极少数的鱼卵、鱼苗在发育后期阶段可以被鉴别到种，大量鱼卵、鱼苗只能鉴别到科或属的水平，因此鱼卵、鱼苗分类鉴定工作已经成为制约鱼类早期资源调查的技术瓶颈。在上述传统的分类鉴定中，为了提高鉴定的准确性，通常采用先对鱼卵、鱼苗进行短期培育，待其形态发生分化后再行鉴定的方法，但在鱼卵、鱼苗采集量较大、死亡率较高以及调查水域距离较远时，传统方法具有明显的局限性。
[0004]2002年，Tautz D等在Nature上首先提出要用DNA序列作为生物分类系统的主要平台(即DNA Taxonomy),随后2003年加拿大动物学家Paul Hebert首次提出DNA条形码(DNA Barcoding)的概念。DNA条形码是指利用一段标准DNA序列作为标记来实现快速、准确和大批量的物种识别和鉴定。
[0005]近年来，也有一些利用DNA序列进行分类鉴定的报道，如专利“一种仔稚鱼快速分类鉴定方法”(201110145486.4)报道以16S rRNA为特征片段进行仔稚鱼快速分类鉴定。笔者在实践和查阅大量文献中发现，16S rRNA对应的16S rDNA序列通常被用作微生物群落结构和系统进化的分子标记，16s RNA对于鱼类特别是亲缘关系较近的物种区分度有限；同时，由于16S rDNA片段较长(约1.5kb)，不仅特征片段扩增较难，而且测序时需要双向测序，导致分类鉴定成本较大。
【发明内容】
[0006]本发明的目的即为克服现有方法的不足之处，提供一种基于Col DNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法。
[0007]与现有方法中的16S rRNA相比，线粒体Col基因进化速率较快，即使近缘物种其区分度也很好；密码子保守性高、引物通用性强，目的片断更短更易扩增；约650bp的序列长度不需要双向测序，分类鉴定成本更低。
[0008]本发明一种基于Col DNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，包括以下步骤:
(1)在调查水域采集可以准确分类鉴定的鱼类样本，提取样本DNA，通过对特征片段进行扩增、测序，获得相应序列，从而建立该水域鱼类DNA条形码数据库。
[0009](2)在调查水域采集鱼卵、鱼苗样本，提取样本DNA，对特征片段进行PCR扩增、测序。
[0010](3)将获得的鱼卵鱼苗特征片段序列与事先建立的DNA条形码数据库进行比对，判断鱼卵鱼苗种类。
[0011]步骤(1)中所述DNA提取方法为:取95 %酒精保存样品的背部肌肉组织，常规酚/氯仿法抽提DNA，_20°C保存备用。
[0012]所述的特征片段为线粒体DNA中细胞色素氧化酶亚单位I基因(线粒体Col基因)。
[0013]所述特征片段扩增通用引物为:
LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，
所述的PCR扩增的反应条件为:94°C预变性3 min ;每一循环包含94°C 40s，56°C 40s，72°C 50s，共35个循环；最后72°C延伸8 min ;PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用纯化试剂盒回收，送测序。
[0014]本发明在采集鱼卵鱼苗后仅需要用95%的酒精保存，不需要复杂的保存条件，同时选择线粒体Col这一片段为特征片段建立调查水域鱼类DNA条形码数据库，对鱼卵鱼苗特征片段进行扩增、测序，然后将序列与DNA条形码数据库进行比对，根据比对结果对调查水域鱼卵鱼苗进行分类鉴定。该方法对样本要求低，实验周期短，鉴定准确度高，克服了现有方法的局限性，显示了其准确、便捷、快速的优势。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
本发明为一种基于Col DNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，采用以下步骤:
1、在调查水域通过定点捕捞、市场购买等方法获取可以准确分类鉴定的鱼类样本，用95%分析纯酒精固定带回实验室。对上述鱼类样本逐一进行分类鉴定。取适量背部肌肉(或鳍条)常规酚/氯仿法抽提DNA，-20°C保存备用。
[0016]2、分别以步骤1中所得的DNA为模版，扩增线粒体Col片段。扩增引物为通用引物:LC01490:5，-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，，HC02198:5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。
[0017]3、PCR扩增的反应条件为:94°C预变性3 min ;每一循环包含94°C 40s，56°C 40s，72°C 50s，共35个循环；最后72°C延伸8min ;PCR扩增的反应体系为:总体积为20 μ L，其中Premix Taq (TaKaRa TaqTM Vers1n 2.0 plus dye) 10 μ L，正反向引物(20uM)各 1 μ L，DNA 模板 2 yL (20 ng/μ L)，ddH20 补足至 20 μ L。
[0018]4、PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用纯化试剂盒回收，送测序。
[0019]5、将步骤4获得的调查水域的线粒体Col片段序列汇总，建立Col DNA条形码数据库。
[0020]6、在调查水域采集鱼卵鱼苗样本，保存于95%酒精中带回实验室。目测或在显微镜(解剖镜)下观察，将目测及显微镜(解剖镜)观察后无法准确分类的鱼卵、鱼苗编号，按步骤1所述的实验方法分别提取DNA并保存于_20°C冰箱中备用。
[0021]7、对制备好的鱼卵鱼苗样本DNA按步骤2-4所述的实验程序，通过扩增、测序获得待鉴定鱼卵、鱼苗样本的线粒体Col片段序列。
[0022] 8、将上述待鉴定鱼卵、鱼苗样本的线粒体Col片段序列与步骤5中建立的Col DNA条形码数据库进行比对，对鱼卵、鱼苗样本进行分类鉴定。
【主权项】
1.一种基于Col DNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)在调查水域采集可以准确分类鉴定的鱼类样本，提取样本DNA，选择线粒体Col为特征片断，进行扩增、测序，获得相应序列，从而建立该水域鱼类DNA条形码数据库； 2)在调查水域采集鱼卵、鱼苗样本，提取样本DNA，对线粒体Col特征片段进行PCR扩增、测序； 3)将步骤2)获得的鱼卵鱼苗特征片段序列与步骤1)建立的DNA条形码数据库进行比对，判断鱼卵鱼苗种类。2.根据权利要求1所述基于ColDNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，其特征在于，步骤1)中所述DNA提取方法为:取95%酒精保存样品的背部肌肉组织，常规酚/氯仿法抽提DNA，-20°C保存备用。3.根据权利要求1所述基于ColDNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，其特征在于，所述特征片段扩增通用引物为:LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。4.根据权利要求1所述基于ColDNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件为:94°C预变性3 min ;每一循环包含94°C 40s，56°C 40s，72°C 50s，共35个循环；最后72°C延伸8 min ;PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用纯化试剂盒回收，送测序。
【专利摘要】本发明公开了一种基于CoI？DNA条形码的鱼卵鱼苗快速分类鉴定方法，采集调查水域中可以准确分类鉴定的鱼类样本，对各种鱼类的线粒体<b>CoI</b>片段分别进行PCR扩增、测序，并据此建立调查水域鱼类CoI？DNA条形码数据库，然后将调查水域的鱼卵、鱼苗样本编号后分别提取DNA，对特征片段进行扩增、测序并与已建立的CoI？DNA条形码数据库进行比对，从而快速、准确判断鱼卵鱼苗种类。本发明克服了现有分类鉴定方法误差较大甚至无法鉴定、需要大量培育待分类样本、及无法对近缘物种进行区分、分类鉴定成本较大的局限，体现了其快速、准确的优势。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349645
【申请号】CN201510759041
【发明人】张敏莹, 徐东坡, 方弟安, 周彦锋, 刘凯, 段金荣
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月10日