诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法。
【背景技术】
[0002]辣椒疫病是一种世界范围内普遍发生的毁灭性真菌病害，其首先于1918年在美国新墨西哥州发现，引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian是LeonLeonian于1922年命名的，它属于植物病原卵菌。辣椒疫霉以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬，可以存活数月甚至更长时间，寄主范围广，主要侵染辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物。辣椒疫病露地和保护地均能发生，该病的流行致使辣椒损失严重，一般病株率为15-30 %，严重时达80 %以上。自1980年以来，辣椒疫病在我国蔬菜种植区域发病程度日趋加重，严重影响了蔬菜种植业的经济效益，给我国的蔬菜安全生产造成了巨大的经济损失。因此，辣椒疫霉菌受到各国植物病理学家和遗传学家的高度广泛关注。
[0003]自然条件下，辣椒疫霉主要通过游动孢子从植株的根部或茎基部侵染，人工培养时，可经过菌丝培养、诱导产生孢子囊、低温处理促进游动孢子释放，从而获得数量更多的游动孢子。传统培养诱导法:将菌丝置于燕麦培养基或黑麦培养基或V8汁培养液，活化培养较长一段时间后，再加入土壤浸出液或者皮氏液，光照条件下诱导产生孢子囊，经低温处理后产生游动孢子。该方法诱导疫霉菌产生孢子囊需要10天以上，时间长；同时，土壤浸出液未经严格灭菌、皮氏培养液湿热灭菌，诱导产生游动孢子囊的效果不稳定、也容易污染。还有另外的诱导方法也可产生大量的游动孢子:黑麦培养基培养菌丝长满平板，以无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的培养基平板后，置于28°C光照生化培养箱中培养24h以诱导孢子囊的产生，再将已产生孢子囊的培养基平板加入18mL的无菌水后移至4°C冰箱中lh，可以诱导辣椒疫霉产生游动孢子，但上述方法比较繁琐，还要经过过滤才能获得可用的游动孢子。另外，新鲜寄主植物材料诱导法也可诱导产生孢子囊，经低温处理后产生游动孢子，但该方法容易遭受细菌的污染，而且植物材料较难获得。
[0004]
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，用于辣椒疫霉菌致病力测定以及杀菌剂对辣椒疫霉菌的生物活性测定等研究。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，包括如下步骤:
(1)辣椒疫霉菌活化:将辣椒疫霉菌接种于胡萝卜培养基上进行活化培养。
[0007](2)制备产生孢子囊的诱导液:用去离子水将市场上购买原装进口 V8蔬菜汁配制成体积浓度10%_15%的汁液，灭菌后备用;制备0.2-0.3g/LCaC03溶液，灭菌后备用。
[0008](3)诱导产生孢子囊:取步骤(1)已活化的辣椒疫霉菌接种到步骤(2)制备的10%-15%的V8蔬菜汁中，25°C黑暗培养2d;然后倒尽V8蔬菜汁液，用灭菌去离子水清洗一次，换上步骤(2)制备的0.2-0.3g/LCa⑶3溶液，于光照强度700-800Lux的白色日光灯下25°C连续光照培养2d，即可诱导产生孢子囊。
[0009](4)诱导释放游动孢子:将步骤(3)经过诱导的辣椒疫霉菌4°C放置15min，然后置于25°C，30min后即可释放出大量的游动孢子。
[0010]步骤(1)中所述的活化培养为25°C黑暗培养2d。
[0011]步骤(2)中所述的水为灭菌去离子水。
[0012]步骤(2)中所述的灭菌的条件优选为121°C湿热灭菌30min。
[0013]步骤(3)中所述的诱导产生孢子囊的方法优选为:取步骤(1)已活化的辣椒疫霉菌边缘菌丝块置于无菌的培养皿上，菌丝块为lcm X 1cm、20块，加入步骤(2)制备的体积浓度15%的V8蔬菜汁，使汁液刚好浸过菌丝块，25°C黑暗培养2d;然后倾尽V8蔬菜汁，用灭菌的去离子水清洗一次，再加0.3g/LCaC03溶液使刚好浸过菌丝块，置于光照强度800LUX的白色日光灯光照培养箱中25°C连续光照培养2d，即可诱导产生孢子囊。
[0014]所述的胡萝卜培养基为200g新鲜胡萝卜去皮切成丝，加水800ml煮沸lh，4层纱布过滤去除残渣，琼脂15g，加热使琼脂融化，定容1000ml，pH=6.0。
[0015]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)快速:本发明的方法可以在4.5d内获得大量的辣椒疫霉菌的孢子囊和游动孢子，较传统培养诱导方法相比，诱导周期缩短。
[0016](2)无污染:本发明在操作过程中无污染源的加入，诱导出的孢子囊和游动孢子均没有污染。
[0017](3)诱导液可以长期保存备用:本发明所用的0.2-0.3g/L CaC03经过灭菌处理，
可置室温保存。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0019]原材料规格
V8蔬菜汁:金宝汤公司，美国。
[0020]15%的V8蔬菜汁:用去离子水850mL与V8蔬菜汁饮料150mL混匀，121°C湿热灭菌30min后备用。
[0021]CaC03: sigma公司，美国。
[0022]0.3g/L CaC03:称取0.3g的CaC03，溶解于1000mL去离子水中，121°C湿热灭菌30min
后备用。
[0023]其它实验操作所需要的培养皿、胡萝卜培养基、移液器、手术刀片、灭菌锅、冰箱、去离子水、光照培养箱等均为实验室常规工具或材料。
[0024]实施例1辣椒疫霉菌标准测序菌株产生孢子囊和游动孢子
(1)在超净工作台上，将辣椒疫霉菌(菌株编号:LT1534，测序标准菌株)接种到胡萝卜培养基上，25°C黑暗培养2d。
[0025](2)在超净工作台上，在菌落边缘处用手术刀片割取0.3X0.3cm的菌丝块，取20块菌丝块置于直径为11cm的无菌培养皿中，加入体积浓度为15%的V8蔬菜汁30mL，25°C黑暗培养2d;然后倒尽V8蔬菜汁，用灭菌去离子水清洗一次，再换上无菌的0.3g/LCaC0315mL，置于光照强度800Lux的白色日光灯的光照培养箱，25°C连续光照培养2d。
[0026](3)将经过上述诱导培养的辣椒疫霉菌于4°C冰箱中，放置15min;然后将其置于25°C培养箱中，30min后收集液体。
[0027](4)用量程为lOyL移液枪吸取5tiL的液体至于血球计数载玻片上，在10倍镜视野下计算游动孢子的数量。取样3次，计算出5nL液体中游动孢子的平均数，然后换算成每毫升游动孢子悬浮液的浓度。经测定释放的游动孢子数达7.32X 105个孢子/mL，释放率90%以上。
[0028]实施例2诱导新鲜辣椒疫病病样中分离的辣椒疫霉菌菌株产生孢子囊和游动孢子
(1)取新鲜发病的辣椒疫病病样标本，用剪刀在病健交界处剪取大小约为5mmX 5mm的组织块。
[0029](2 )在超净工作台上，将组织块置于75%酒精中浸30s，再在5%次氯酸钠溶液中浸泡漂洗1 min;然后用灭菌去离子水清洗3次。在灭菌滤纸上吸干水后，将其转移到胡萝卜培养基平板上，25°C黑暗培养3d。
[0030](3)待长出菌落后，在超净工作台上挑取菌落颜色为白色的边缘菌丝块，对其进行菌丝纯化，即可获得辣椒疫霉菌。
[0031](4)在超净工作台上，在菌落边缘处用手术刀片割取lcmX lcm的菌丝块，取20块菌丝块置于体积浓度为10%的V8蔬菜汁中，使果汁液刚好浸过菌丝块，25°C黑暗培养2d;然后倾尽液体，用灭菌去离子水清洗一次，换入灭过菌的0.2g/L CaC03刚好浸过菌丝块，置于光照强度700LuX的白色日光灯的光照培养箱，25°C连续光照培养2d。
[0032](5)将上述经过诱导培养的菌株置于4°C冰箱中15min，然后放置于25°C培养箱中，30min后收集液体。用量程为lOyL移液枪吸取5tiL的液体至于血球计数载玻片上，在10倍镜视野下计算游动孢子的数量。取样3次，计算出5nL液体中游动孢子的平均数，然后换算成每毫升游动孢子悬浮液的浓度。经测定，释放的游动孢子数5.31 X105个孢子/mL，释放率90%以上。
【主权项】
1.诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于: (1)辣椒疫霉菌活化:将辣椒疫霉菌接种于胡萝卜培养基上进行活化培养； (2)制备产生孢子囊的诱导液:用去离子水将V8蔬菜汁配制成体积浓度10%-15%的汁液，灭菌后备用； (3)诱导产生孢子囊:取步骤(1)已活化的辣椒疫霉菌接种到步骤(2)制备的体积浓度10%_15%的￥8蔬菜汁中，25°C黑暗培养2d，菌丝块为0.3cmX 0.3cm-lcm X 1cm、20块;然后倾尽V8蔬菜汁液，用灭菌去离子水清洗一次，换上灭菌的0.2-0.3g/LCaC03溶液，于光照强度700Lux-800Lux的白色日光灯下25°C连续光照培养2d，即可诱导产生大量的孢子囊； (4)诱导释放游动孢子:将步骤(3)经过诱导的辣椒疫霉菌4°C放置15min，然后置于25°C，30min后即可释放出大量的游动孢子。2.根据权利要求1所述的诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的诱导产生孢子囊的方法为:取步骤(1)已活化的辣椒疫霉菌边缘菌丝块置于无菌的培养皿上，菌丝块为1 cm X 1 cm、20块，加入步骤(2)制备的体积浓度15%的V8蔬菜汁，使汁液刚好浸过菌丝块，25°C黑暗培养2d;然后倾尽V8蔬菜汁，用灭菌的去离子水清洗一次，再加0.3g/LCaC03溶液使刚好浸过菌丝块，置于光照强度SOOLux的白色日光灯光照培养箱中25°C连续光照培养2d，即可诱导产生孢子囊。3.根据权利要求1所述的诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法，其特征在于:所述的胡萝卜培养基为200g新鲜胡萝卜去皮切成丝，加水800ml煮沸lh，4层纱布过滤去除残渣，琼脂15g，加热使琼脂融化，定容1000ml，pH=6.0。
【专利摘要】本发明公开了诱导辣椒疫霉菌产生孢子囊并释放游动孢子的方法。本方法包括辣椒疫霉菌活化、制备产生孢子囊的诱导液、诱导产生孢子囊和诱导释放游动孢子。本发明所用的诱导液为体积浓度10%-15%的原装进口V8蔬菜汁和0.2-0.3g/LCaCO3溶液，在诱导辣椒疫霉产生孢子囊时于白色日光灯下连续光照培养。本发明方法简便、快速、无污染，可用于辣椒疫霉菌致病力测定以及杀菌剂对辣椒疫霉菌的生物活性测定。
【IPC分类】C12N3/00, C12R1/645
【公开号】CN105441375
【申请号】CN201510899825
【发明人】刘裴清, 陈庆河, 李本金, 翁启勇
【申请人】福建省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月9日