一种产过氧化氢酶的发酵工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明提供一株粘质沙雷氏菌为出发菌株发酵生产过氧化氢酶。属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]过氧化氢是一种强氧化剂，广泛应用与工业、食品和医疗领域的漂白和消毒，但是其残留对于严重影响生产工艺和身体健康。过氧化氢酶可以特异性的分解过氧化氢为无毒的水和氧气，是一种高效环保的过氧化氢去除途径。过氧化氢酶广泛存在于动植物和好氧微生物中，最初过氧化氢酶是从猪牛等动物肝脏中提取纯化的，但该方法受限于原料有限、成本高和工艺复杂，相比而言微生物发酵生产过氧化氢酶则有产量大、活性高、酶学性质丰富、成本低廉等诸多优点。目前国外已有相关微生物发酵过氧化氢酶商品，国内有一些文献及专利报道过氧化氢酶产酶菌株，多数菌株产酶能力在每毫升发酵液几百至几千个酶活力单位，仅江南大学陈坚教授和江南大学专利CN 101805709 B报道菌株酶产量达到2万个酶活左右。且过氧化氢酶产量的提高往往依靠过氧化氢、乙醇等的诱导，从而提高发酵工艺的复杂性和生产成本。本发明人提供了一种简单廉价的过氧化氢酶生产工艺，仅以红糖、大豆粉和废糖蜜为营养成分，通过液体发酵得到过氧化氢酶酶液，该酶液过氧化氢酶活力高，基于以上发现提出了本发明。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种产过氧化氢酶的发酵工艺。以一株粘质沙雷氏菌为出发菌株，通过液体摇瓶发酵生产过氧化氢酶，所产过氧化氢酶制剂活性高，制备简单，生产成本低廉，适于纺织、造纸等生产工艺中残留过氧化氢的去除和过氧化氢污水的处理。
[0004]本发明的技术方案:
1、应用菌株Kat-1发酵生产过氧化氢酶。工艺如下:
(I)种子液制备:
种子培养基为:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏2g/L，NaCllg/L，pH为7.0。120°〇高压灭菌30mino
[0005]种子液制备方法:挑取一环菌株的纯培养于50ml种子培养基中，180r/min培养12h即为种子液。
[0006](2)发酵产酶:
产酶培养基制备:大豆粉10?40 g/L，红糖20?50g/L，废糖蜜5?10g/L，无需调pH，120°C高压灭菌30min。其中，大豆粉制备以市售大豆为原料经粉碎机充分粉碎后无需过筛，直接称取所需量配制发酵培养基。
[0007]发酵条件:种子液以2%的接种量转接至含50ml产酶培养基的250 ml三角瓶中，30。。，180 ?220 r/min培养32?60 h。
[0008](3)过氧化氢酶的制备:发酵液直接冰浴超声破碎直至澄清，超声功率设为400W，超速离心后上清即为过氧化氢酶酶液。
[0009](4)过氧化氢酶活性测性方法:发酵液超声破碎直至澄清，用pH 7.0的I3BS缓冲液稀释适当倍数后备用。过氧化氢酶酶活测定方法为3.9 ml反应液(50mM PBS pH 7.0,20 mMH2O2)迅速加入0.1 ml酶液中，在240 nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H2O2的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗I微摩尔H2O2所用的酶量为IU0
[0010]米用的菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) KAT-1，该菌种已于2015年12月9日保存在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015732ο
[0011]1、菌株的筛选及鉴定
(I)筛选:挑去从土壤中分离纯化的细菌纯培养于液体种子培养基中震荡培养，取100微升发酵液加入100微升过氧化氢，有大量气泡产生的菌株为产酶菌株。
[0012](2)鉴定:对该菌株16S rRNA进行PCR扩增与测序，NCBI数据库比对显示该菌为粘质沙雷氏菌。
[0013]( 3)菌株特征:菌落为圆形突起，乳白色;发酵液为淡黄色，不产红色灵菌素。光镜下菌体为圆形。
[0014]本发明的有益效果:本发明首先提供了一株高产过氧化氢酶菌株，液体摇瓶培养酶活达30000 U/ml以上，远高于多数已报道菌株。该菌培养基成分简单，以红糖为碳源的培养基可以极大促进该菌株产酶，发酵过程无需过氧化氢或乙醇等诱导，工艺简单，成本低廉。应用该菌株及配套工艺制备的过氧化氢酶可以应用于食品加工、造纸、纺织和污水处理等领域，因此本发明提供的菌种及工艺具有广泛的应用前景和明显的经济效益。
【具体实施方式】
[0015]实施例1:产酶菌株Kat-1的筛选及鉴定
挑取一环各菌株纯培养分别转接于含有50ml前述液体种子培养基的三角瓶中，取每个菌株的发酵液200微升加入等体积过氧化氢观察产气泡情况。有气泡产生者为过氧化氢酶产酶菌株，选择产气泡最剧烈的菌株Kat-1作为过氧化氢酶生产用菌。将菌株Kat-1的发酵液冰浴超声破碎直至澄清，破碎条件为300W，破碎2s停顿3s，将破碎液用I3BS缓冲液稀释20倍测量酶活。过氧化氢酶活力测定方法为:3.9ml反应液(0.2M PBS pH7.0、20mM H2O2)迅速加入0.1ml酶液中，在240nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H2O2的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗I微摩尔H2O2所用的酶量为1U。测得此时过氧化氢酶活性为2230U/ml。取3ml菌液用细菌基因组提取试剂盒提取该菌基因组，用细菌16S 犷0“通用弓|物(27?:5’46八61'1^八1'(:(^6(:1^6-3’和 14921?:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)PCR扩增该菌的 16S rDNA，扩增程序为94°C变性lmin，55°C退火Imin，72°C延伸2min，扩增循环数为35个循环。PCR扩增产物送生物公司测序。在NCBI进行序列比对后确认该菌为粘质沙雷氏菌。
[0016]实施例2:
种子培养基为:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏2g/L，NaCllg/L，pH为7.0。120°〇高压灭菌30mino
[0017]产酶培养基制备:大豆粉30g/L，红糖40g/L，废糖蜜10g/L，无需调pH，120°C高压灭菌30min。
[0018]挑取一环斜面菌种粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) KAT-1接种于50mL种子培养基中，37°C，180rpm摇床培养12h。以2%的接种量将上述种子液接种到50mL发酵培养基中，30°C，180rpm发酵培养48h。发酵液酶活达到18637U/mL。
[0019]实施例3:菌株发酵生产过氧化氢酶
种子培养基为:大豆蛋白胨10g/L，牛肉膏2g/L，NaCl lg/L，pH为7.0。120°C高压灭菌30mino
[0020]产酶培养基制备:大豆粉40g/L，红糖50g/L，废糖蜜5g/L，无需调pH，120°C高压灭菌30min。
[0021 ] 从斜面上挑取一环粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) KAT-1纯培养于盛有50ml种子液体培养基的250 ml三角瓶中，37°C摇床上培养12 h，摇床转速为180 r/min。以2%的接种量转接至产酶培养基，250 ml三角瓶的装液量为50 ml，培养条件为30°C，摇床转速180 r/min，培养48 h。此时酶液活性达30420 U/ml。
[0022]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种产过氧化氢酶的发酵工艺，其特征在于:具体工艺为: (1)种子液培养: 种子液培养基:大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏2 g/L，NaCl I g/L，pH为7.0; 种子液制备:挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，37°C培养12 h，转速为180r/min，得种子液； (2)发酵产酶: 产酶培养基:大豆粉10?40 g/L，红糖20?50g/L，废糖蜜5?10g/L; 发酵产酶:将步骤(I)获得的菌液以2%接种量接种液体产酶培养基，发酵温度为30°C，转速为180?220r/min，发酵时间为32 -60 h； (3 )过氧化氢酶的制备: 取发酵液冰浴超声破碎后离心，上清即为过氧化氢酶液。2.根据权利要求1所述的一种高产过氧化氢酶的发酵工艺，其特征在于:所采用菌株为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)KAT_l，该菌株已于2015年12月9日保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M 2015732。
【专利摘要】本发明提供了一种产过氧化氢酶的发酵工艺，属于生物工程领域。以一株粘质沙雷氏菌保藏编号为（CCTCC？M？2015732）为出发菌株，仅以大豆粉、红糖和废糖蜜为培养基成分经液体摇瓶发酵可得到高产量的过氧化氢酶，酶活最高高达30420？U/ml。本发明过氧化氢酶制剂制备简单、酶活性高，造价低廉，该酶制剂在纺织、造纸和过氧化氢污水处理等领域有良好的应用前景。CCTCC NO：M 201573220151209
【IPC分类】C12N9/08, C12R1/43
【公开号】CN105441402
【申请号】CN201610007442
【发明人】林新坚, 贾宪波, 陈济琛, 陈龙军, 蔡海松
【申请人】福建省农业科学院土壤肥料研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2016年1月7日