一种荧光探针的制备方法

文档序号：9721567阅读：384来源：国知局

一种荧光探针的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于荧光探针技术领域，尤其涉及一种荧光探针的制备方法。
【背景技术】
[0002]壳聚糖为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是甲壳素部分脱乙酰化而得到的一种直链大分子生物多糖。它是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性能。其弱酸水溶液具有高粘性，带正电荷。可与带负电荷高聚物发生交联反应而形成微球。壳聚糖链中的伯胺基团很容易和生物分子发生反应，诸如:蛋白质、DNA、酶、抗原抗体、生物素以及荧光分子异硫氰酸酯(FITC)等。壳聚糖微球已应用于亲和色谱介质及酶的固定化。因此壳聚糖纳米微球极有可能成为同时偶联荧光分子和生物识别分子的良好基质。

【发明内容】

[0003]本发明就是针对上述问题，提供一种制备简单，良好的生物相容性的荧光探针的制备方法。
[0004]为实现上述目的，本发明包括以下步骤。
[0005]1) 5 g壳聚糖溶解在醋酸溶液中，逐滴加入H202溶液，在水浴中降解；每隔数小时，取溶液，用NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用。
[0006]2)用乙酸、NaCl溶液为溶剂，测定，求出特性粘度数后，计算壳聚糖的粘均Mr。
[0007]3)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m/V);用NaOH调pH = 4.6-4.7 ;取上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬浊液。
[0008]4)高速离心CS纳米粒子，将上层清液倒掉，冲洗微球，备用；将离心后的CS纳米粒子分散在醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入FITC无水二甲基亚砜溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3 h，得到FITC标记的壳聚糖纳米荧光探针。
[0009]5)离心，洗涤，用紫外分光光度计在480 nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
[0010]作为一种优选方案，本发明所述步骤1) 5 g壳聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在水浴中降解；每隔数小时，取50mL溶液，用10mol /L的NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用。
[0011]2)用0.1 mo 1/L乙酸0.2 mo 1/LNaCl溶液为溶剂，在25度下测定，求出特性粘度数后，计算壳聚糖的粘均Mr。
[0012]3)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于1% ( V /V )的醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH调pH = 4.6-4.7 ;取10 mL上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3 mL 0.25% (m/V)TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬池液。
[0013]作为另一种优选方案，本发明所述步骤4)以12000 r /m in高速离心CS纳米粒子10m in,将上层清液倒掉，冲洗微球，备用；将离心后的CS纳米粒子分散在1% ( V /V)醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入10 g /L的FITC无水二甲基亚砜(DMS0)溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箱包住反应试管，避光反应3 h,得到FITC标记的壳聚糖纳米突光探针。
[0014]5)离心，洗涤，用紫外分光光度计在480 nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
[0015]本发明有益效果。
[0016]本实验通过控制低分子量壳聚糖聚阳离子与三聚磷酸钠阴离子之间的比例制备了粒度均一壳聚糖纳米粒子，利用壳聚糖上的氨基在酸性条件下和FITC中的异硫氰酸根(N C S )反应，制得FITC标记的壳聚糖纳米粒子。该探针具有制备简单，良好的生物相容性，粒径均匀有规则以及对光稳定的优点。此外该粒子表面的残余氨基可进一步与生物分子偶联，制备成能识别特定生物分子的纳米荧光探针，因而有望用于生物与医学分析领域。
【具体实施方式】
[0017]本发明包括以下步骤。
[0018]1) 5 g壳聚糖溶解在醋酸溶液中，逐滴加入H202溶液，在水浴中降解；每隔数小时，取溶液，用NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用。
[0019]2)用乙酸、NaCl溶液为溶剂，测定，求出特性粘度数后，计算壳聚糖的粘均Mr。
[0020]3)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m/V);用NaOH调pH = 4.6-4.7 ;取上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬浊液。
[0021]4)高速离心CS纳米粒子，将上层清液倒掉，冲洗微球，备用；将离心后的CS纳米粒子分散在醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入FITC无水二甲基亚砜溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3 h，得到FITC标记的壳聚糖纳米荧光探针。
[0022]5)离心，洗涤，用紫外分光光度计在480 nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
[0023]作为一种优选方案，本发明所述步骤1) 5 g壳聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在水浴中降解；每隔数小时，取50mL溶液，用10mol /L的NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用。
[0024]2)用0.1 mo 1/L乙酸0.2 mo 1/LNaCl溶液为溶剂，在25度下测定，求出特性粘度数后，计算壳聚糖的粘均Mr。
[0025]3)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于1% ( V /V )的醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH调pH = 4.6-4.7 ;取10 mL上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3 mL 0.25% (m/V)TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬池液。
[0026]作为另一种优选方案，本发明所述步骤4)以12000 r /m in高速离心CS纳米粒子10m in,将上层清液倒掉，冲洗微球，备用；将离心后的CS纳米粒子分散在1% ( V /V)醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入10 g /L的FITC无水二甲基亚砜(DMS0)溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箱包住反应试管，避光反应3 h,得到FITC标记的壳聚糖纳米突光探针。
[0027]5)离心，洗涤，用紫外分光光度计在480 nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
[0028]分子量越低，壳聚糖经交联后所得的粒径越小。因此，为得到纳米级粒子，需将高分子量的壳聚糖降解。h202氧化降解法因反应产物无残毒，易处理而成为壳聚糖降解中的常用方法。反应温度、反应时间、反应介质和h202浓度是壳聚糖降解的主要影响因素。通常随着反应温度升高，反应时间延长和h202浓度的增大，壳聚糖的降解程度增大。实验表明反应温度过高，壳聚糖被氧化，副反应较多，降解产物颜色变深；而h202浓度过高会使产物收率下降，所得分子量分布较宽，以此制得的纳米粒子粒径不均匀。此外，在稀酸溶液中壳聚糖分子溶解，分子间与分子内氢键断裂，降解反应是均相反应，因而降解速度快，所得降解产物分子量低。综合考虑上述因素，实验采用在弱酸性介质中，H202浓度为1.5%，水浴条件下通过改变反应时间来实现低分子量壳聚糖的制备。
[0029]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明、不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明、对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说、在不脱离本发明构思的前提下、还可以做出若干简单推演或替换、都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
【主权项】
1.一种荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤。 1)壳聚糖溶解在醋酸溶液中，逐滴加入h202溶液，在水浴中降解；每隔数小时，取溶液，用NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用； 2)用乙酸、NaCl溶液为溶剂，测定，求出特性粘度数后，计算壳聚糖的粘均Mr； 3)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m /V)；用NaOH调pH = 4.6-4.7 ;取上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬浊液； 4)高速离心CS纳米粒子，将上层清液倒掉，冲洗微球，备用；将离心后的CS纳米粒子分散在醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入FITC无水二甲基亚砜溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3 h,得到FITC标记的壳聚糖纳米荧光探针； 5)离心，洗涤，用紫外分光光度计在480nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。2.根据权利要求1所述一种荧光探针的制备方法，其特征在于所述步骤1)5 g壳聚糖溶解在150 mL 3%的醋酸溶液中，逐滴加入50 mL 6% H202溶液，在水浴中降解；每隔数小时，取50mL溶液，用lOmol /L的NaOH溶液沉淀，用去离子水洗至中性，真空干燥备用; 2)用0.1 mo 1/L乙酸0.2 mo 1/LNaCl溶液为溶剂，在25度下测定，求出特性粘度数后，计算壳聚糖的粘均Mr ； 3)称取经不同时间降解的壳聚糖，溶解于1%( V /V )的醋酸溶液，壳聚糖浓度为0.5% ( m /V);用10 mo 1/L NaOH调pH = 4.6-4.7 ;取10 mL上述壳聚糖的醋酸溶液，逐滴加入3mL0.25% (m/V)TPP溶液，磁力搅拌，得到经TPP交联的壳聚糖纳米粒子悬浊液。3.根据权利要求1所述一种荧光探针的制备方法，其特征在于所述步骤4)以12000r/m in高速离心CS纳米粒子10m in,将上层清液倒掉，冲洗微球，备用；将离心后的CS纳米粒子分散在1% ( V /V )醋酸溶液中，壳聚糖的浓度为1 g /L;加入10 g /L的FITC无水二甲基亚砜(DMS0)溶液，壳聚糖纳米粒子分散液和FITC无水二甲基亚砜溶液的体积比为3 mL:0.3mL ;用锡箔包住反应试管，避光反应3 h，得到FITC标记的壳聚糖纳米荧光探针； 5)离心，洗涤，用紫外分光光度计在480 nm检测离心上清液，直至在此波长下无吸收。
【专利摘要】一种荧光探针的制备方法属于荧光探针技术领域，尤其涉及一种荧光探针的制备方法。本发明提供一种制备简单,良好的生物相容性的荧光探针的制备方法。本发明包括以下步骤。1)5g壳聚糖溶解在醋酸溶液中,逐滴加入H2O2溶液,在水浴中降解；每隔数小时,取溶液,用NaOH溶液沉淀,用去离子水洗至中性,真空干燥备用；2）用乙酸、NaCl溶液为溶剂,测定,求出特性粘度数后,计算壳聚糖的粘均Mr。
【IPC分类】C08J3/24, C08B37/08, C09K11/06, G01N21/64
【公开号】CN105481996
【申请号】CN201410474016
【发明人】徐丽萍
【申请人】徐丽萍
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月17日

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