一种琥珀酸的生物制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，公开了一种琥珀酸的生物制备方法，与传统的方法 相比，具有产量高，生长周期短，培养基简单。利用本发明生产的琥珀酸用于医药、生物工 程、塑料、生物化工等行业。
【背景技术】
[0002] 琥珀酸为四碳二元酸，可以用作食品的调味剂，磺胺、维生素等药物的合成原料， 也可以用于油漆、染料的合成，制作化工清洗剂以及用于合成可降解的生物塑料等，需求十 分广泛。目前世界各国规定用于食品的琥珀酸只能够使用发酵法制得的产品，严禁使用化 工方法合成的产品。
[0003] 传统的化工合成方法为从丁烷通过顺式丁烯二酐生产，而丁烷是通过石油裂解方 法制造的。随着石油资源的枯竭，其生产成本越来越高。
[0004] 生物发酵法是以葡萄糖为原料，通过细菌的代谢在常温、常压下制备琥珀酸。这种 方法较化工方法所获得的琥珀酸的成本至少便宜20%以上。随着从生物质如秸杆、树叶、锯 末等农林废弃物制造葡萄糖技术的发展，生物发酵法制造琥珀酸的成本会进一步降低，其 生产成本会更进一步降低。
[0005] 美国能源部组织专家和学者对可以作为基础化工原料且能够从生物质原料中转 化生产的化合物进行了遴选，最后选定了 12种具有战略性意义的化合物作为21世纪生物 化工原料研究和开发的重点，琥珀酸名列其中。所选定的化合物可以利用现有的以化石能 源为基础的化工设施进行进一步加工，即不需要进行大的固定资产投资，就可以进行生产。
[0006] 2015年全世界塑料的产量预计将达到2亿9千7百万吨，全世界约8%的石油及 天然气等化工能源用于塑料的生产。我国塑料的产量占全世界产量的23. 5%。随着化工能 源的枯竭及伴随的价格增长，和化工能源消耗所导致的温室气体效应等一系列问题，使人 们越来越重视利用可再生能源如生物质、陈化粮淀粉等来加工塑料。这种以生物质为载体 的塑料，可以在环境中降解不造成白色污染。在生物质的生产过程中均伴有二氧化碳的利 用，可以降低大气中二氧化碳的浓度，减少温室气体效应。
【发明内容】
[0007] 发明的目的在于提供一种琥珀酸的生物制备方法，与传统的方法相比，具有产量 高，生长周期短，培养基简单的特点。利用本发明生产的琥珀酸用于医药、生物工程、塑料、 生物化工等行业。
[0008] 为了达到上述目的，对糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖通路进行了改造，使葡萄糖 进入细菌后，绝大部分转化为琥珀酸，并在这一过程中利用二氧化碳，使其骨架整合到琥珀 酸，提1? 了广量。
[0009] 为了达到上述目的，需要对代谢通路中的一些基因进行敲除，有些基因需要增加 其表达量，而且由于一些涉及细菌的主要代谢通路，需要分阶段进行调整。
[0010] 本发明提供的方法构建的菌株具有产量高、生长周期短、培养基简单等特点，生产 的琥珀酸可用于医药、生物工程、环境保护、塑料、生物化工等行业。
【具体实施方式】
[0011] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0012] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 实施例中，所涉及到的百分比（％)，若未特别指出，液体之间的百分比为体积百分比，固 体之间的百分比为重量百分比，固体与液体之间的百分比为重量体积比（10 %即表示每 100ml液体中含固体10g)。
[0013] 以构建可以生产大肠杆菌的琥珀酸酸为例，说明本发明的【具体实施方式】。
[0014] 一 .磷酸烯醇式丙酮酸消耗和调控途径基因的敲除：
[0015] 1.丙酮酸激酶基因的条件敲除敲除：
[0016] pykAUp GCCGA GCGGCCGCtttcggattaggctcttcagc
[0017] pykADn tattatcgcgatctgttgctgg
[0018] pykAUp1 ccagcaacagatcgcgataataTAGTCTAGAggatcAGATCTagtaagtacgttgccggat g
[0019] pykADn1 GCCGAGCGGCCGCaaagttccgtgatcccattct
[0020] 2.葡萄糖转运蛋白基因 ptsl的敲除：
[0021] PtsIUp GCCGA GCGGCCGCccgcattgtttgccgatctcttca
[0022] PtsIDn aagcagagctttaccgaaagcgat
[0023] PtsIUp1 atcgctttcggtaaagctctgcttTAGTCTAGAggatcAGATCTcggacgagttaatgacg ctggtt
[0024] PtsIDnl GCCGA GCGGCCGCacgctaccggacagtttgatcagt
[0025] 3.柠檬酸合成酶基因的条件敲除：
[0026] gltAUp GCCGA GCGGCCGCcatgtggcgaatacctacga
[0027] gltADn cctggatcactgttcaggataa
[0028] gltAUpl ttatcctgaacagtgatccaggtagtctagaggatcagatctgctgaacgacccgtacttt at
[0029] gltADn1 GCCGAGCGGCCGCgctatgatgctcccggtttat
[0030] 4. MgsA基因的敲除：
[0031] MgsAUp GCCGA GCGGCCGCtacccagctcatcaaccaggtcaa
[0032] MgsADn cgcaatatgtttccgcgcaggtaa
[0033] MgsAUp1 ttacctgcgcggaaacatattgcgTAGtaatccagtcgccgcatttcaacg
[0034] MgsADn1 GCCGA GCGGCCGCcaaaccggaagagcgcattctgat
[0035] 5. 6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的条件敲除：
[0036] gndUp GCCGA GCGGCCGCggcttcgtgaaagccagata
[0037] gndDn gcctggaatgttcgcaaataag
[0038] gndUpl cttatttgcgaacattccaggcTAGTCTAGAggatcAGATCTccaggcacagcgtgactatt t
[0039] gndDnl GCCGA GCGGCCGCcggtaaacagcatcgggatatt
[0040] 二.基因敲除的基本过程：
[0041] 1.以大肠杆菌染色体DNA为模板，建立如下PCR反应：
[0042]
[0043] 以获得上游片段；
[0044]
[0045] 以获得下游片段。
[0046] 反应程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分钟，循环35次；最后在68°C延伸10分 钟。
[0047] 2.进行重叠 PCR以获得编码序列缺失的PCR片段，建立如下反应：
[0048]
[0049] 以获得编码序列缺失的片段。
[0050] 反应程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分钟，循环35次；最后在68°C延伸10分 钟。
[0051] 3.编码序列缺失片段用Notl酶切插入pDS132NT质粒中，获得对应的可以用于杂 交的质粒。
[0052] 4.所获得的pDS132NT质粒与BL21菌株杂交，经过LB培养基循环后，获得经PCR 证实基因片段缺失的菌落，从而建立对应基因缺失的菌株。
[0053] 5.重复上述过程，直到所有需要敲除的基因完成为止，进而获得 BL21 Δ PykA Δ ptsl Δ gndA Δ gltA Δ MgsA 编码基因缺失的菌株。
[0054] 三.琥珀酸合成途径关键基因的表达量增加：
[0055] 1.静止期rpoS基因启动子的人工合成
[0056] Ggatctctagaaatcggcggaaccaggcttttgcttgaatgttccgtcaagggatcacgggtaggagcc accttcatatggatc
[0057] 用Xbal和Ndel酶切，插入用同样酶切处理的pET_32a中，获得的质粒命名为 pET-32a rpoS.
[0058] 2.磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的扩增
[0059] ppcF ggatccatatgaacgaacaatattccgcattgcgtagt
[0060] ppcR ttagccggtattacgcatacctgcc
[0061] 建立以下PCR反应：
[0062]
[0063] 以获得ppc基因片段。
[0064] 反应程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分钟，循环35次；最后在68°C延伸10分 钟。
[0065] 3.磷酸烯醇式丙酮酸激酶基因的扩增
[0066] ppsAF ggcaggtatgcgtaataccggctaataagaaggagatatacaatgtccaacaatggctcgtca ccg
[0067] ppsAR ggatcggatcctggttaagcctggctgaactgaagaaataa
[0068] 建立以下PCR反应：
[0069]
[0070]
[0071] 以获得ppsA基因片段。
[0072] 反应程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 1分钟，循环35次；最后在68°C延伸10分 钟。
[0073] 4.含有上述关键基因的操纵子的构建
[0074] ppcFndel atgaacgaacaatattccgcattgcgtagt
[0075] ppsAR tggttaagcctggctgaactgaagaaataa
[0076] 建立以下PCR反应：
[0077]
[0078] 以获得ppc-ppsA基因片段，该片段在ppsA基因起始密码子的前面含有核糖体结 合位点，以利于PPsA的翻译。
[0079] 反应程序：98°C 15秒，50°C 15秒，68°C 3分钟，循环25次；最后在68°C延伸10分 钟。
[0080] 5.操纵子在大肠杆菌染色体基因位点上的整合
[0081] 所获得的ppc-ppsA基因片段用Ndel和BamHI酶切，插入用同样酶切处 理的pET_32arpoS中，所获得的质粒命名为pET_32a rpoS ppc-ppsA.该质粒Xbal 和BamHI酶切处理，插入用Xbal和Bglll酶切处理的pDS132NT Λ ptsl质粒中，获 得pDS132NTAptsI: :rpoSppc-ppsA质粒。重复上述杂交过程中，最后获得E.coli BL21 APykAA gndAA gltAAMgsAAptsI ： ：rpoSppc-ppsA〇
[0082] 四：Ε· coli BL21 APykAA gndAA gltAAMgsAAptsI : :rpoSppc_ppsA 菌株的发酵 实验：
[0083] 用下列培养基发酵该菌株，以葡萄糖为底物，氨水维持pH在6. 8,测定琥珀酸的产 量为1.6-1.8M/M葡萄糖。
[0084] 每升培养基含磷酸二氢钠6. 5克，磷酸氢二钾1. 7克，碳酸钙10克，硫酸镁1克， 微量元素混合液1毫升，适当的消泡剂如〇. 05%食用油。起始葡萄糖10克，随后流加50% 的葡萄糖。发酵周期为36小时。
【主权项】
1. 一种琥珀酸的生物制备方法，其通过对消耗琥珀酸的丙酮酸激酶、葡萄糖转运蛋白 ptsl、柠檬酸合成酶以及调控基因mgsA和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因进行敲除和生产琥 珀酸的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶扩增来完成。2. 如权利要求书1，丙酮酸激酶、葡萄糖转运蛋白ptsl、柠檬酸合成酶以及调控基因 mgsA和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的敲除是通过同源重组的方式来完成的。3. 如权利要求书1，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的扩增是通 过同源重组的方式在敲除葡萄糖转运蛋白ptsl的同时来完成的。4. 如权利要求书3,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的扩增是通 过静止期表达的rpoS基因的启动子来完成。5. 如权利要求书1，所构建的菌株其发酵培养基中需要加入碳酸钙来调节pH、提供反 应所需的碳酸氢根离子和使琥珀酸形成沉淀，促进反应的进行。6. -种琥珀酸的生物制备方法，其包括权利要求1-5所述的步骤。
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，公开了一种琥珀酸的生物制备方法，与传统的方法相比，具有产量高，生长周期短，培养基简单。利用本发明生产的琥珀酸用于医药、生物工程、塑料、生物化工等行业。
【IPC分类】C12P7/46, C12N15/70
【公开号】CN105483166
【申请号】CN201410553670
【发明人】李明
【申请人】天水绿健生物技术有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年10月9日