发酵法工业化艺生产l-羟脯氨酸的菌种培养基和培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵的菌种培养基及培养方法，具体涉及发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种固体培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002]轻脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸轻基化后的产物，其分子式为C5H9NO3t3羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274°C，易溶于水，微溶于乙醇。自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中。反式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。
[0003]目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4%-7 %，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。
[0004]目前，微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的研究还处于实验室阶段，尚未形成成熟的工业化生产工艺，而先进的工业化生产工艺，尤其是菌种的固体培养配方及方法对于L-羟脯氨酸的发酵单位、成本和三废排放有重要影响。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于:提供一种发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养基及培养方法，采用该菌种培养配方及工艺得到的菌种应用于工业化生产L-羟脯氨酸，有利于提高L-羟脯氨酸的发酵水平、降低生产成本、避免环境污染。
[0006]本发明所采取的技术方案:
[0007]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养基由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，其配方为酵母粉5g/L、蛋白胨I Og/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、AMP50mg/L。
[0008]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养方法，包括以下步骤，首先，菌种培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于1ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121°C灭菌15分钟，取出冷却到50?60°C后于无菌室中加入10%的AMP溶液，到AMP终浓度为50ppm，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用;在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37±1.0°C的培养箱中培养24?48小时，菌苔长好后直接上罐或放置O?5°C冰箱中备用。
[0009]所述的浓度为10%的AMP溶液由氨苄西林溶解于蒸馏水中制得。
[0010]所述的菌种源于中科院天津工业生物技术研究所，菌株是一株Escherichia ColiK12 W3110变种。
[0011]本发明的有益效果:本发明选用菌种在所配制的固体培养基中培养，菌种培养良好，有利于提高L-羟脯氨酸的发酵水平、降低生产成本、避免环境污染。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0013]实例I
[0014]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养基由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，其配方为酵母粉5g/L、蛋白胨I Og/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、AMP50mg/L。
[0015]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养方法:菌种培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于1ml斜面试管，加塞包牛皮纸，121°C灭菌15分钟，取出冷却到50°C后于无菌室中加入10 %的AMP溶液5ul，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用;在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管斜面上，放置37±1.0°C的培养箱中培养24小时，菌苔长好后直接种母瓶；其中菌种来源于中科院天津工业生物技术研究所，菌株是一株Escherichia Coli K12 W3110变种。其中浓度为10%的AMP溶液由氨苄西林溶解于蒸馏水中制得。
[0016]实例2
[0017]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养基由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，其配方为酵母粉5g/L、蛋白胨I Og/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、AMP50mg/L。
[0018]发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养方法:菌种培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121°C灭菌15分钟，取出冷却到55°C后于无菌室中加入10 %的AMP溶液25ul，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用;在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在茄子瓶空白斜面上，放置37± 1.0°C的培养箱中培养38小时，菌苔长好后放置O?5°C冰箱中备用;其中菌种来源于中科院天津工业生物技术研究所，菌株是一株Escherichia Coli K12 W3110变种。其中浓度为10%的AMP溶液由氨苄西林溶解于蒸馏水中制得。
[0019]实例3
[0020]菌种固体培养基由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，其配方为酵母粉5g/L、蛋白胨 I Og/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、AMP50mg/L。
[0021]菌种培养:菌种培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121°C灭菌15分钟，取出冷却到60°C后于无菌室中加入10%的AMP溶液25ul，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用;在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在茄子瓶空白斜面上，放置37± 1.0°C的培养箱中培养36小时，菌苔长好后放置O?5°C冰箱中备用;其中菌种来源于中科院天津工业生物技术研究所，菌株是一株Escherichia Coli K12W3110变种。其中浓度为1 %的AMP溶液由氨苄西林溶解于蒸馏水中制得。
【主权项】
1.发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养基，其特征在于，由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，其配方为酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L、AMP50mg/L02.发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养方法，其特征在于，包括以下步骤，首先，菌种培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于1ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，121°C灭菌15分钟，取出冷却到50?60°C后于无菌室中加入10%的AMP溶液，到AMP终浓度为50ppm，摇匀后倾斜30°放置，待凝固后置无菌室备用；在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37±1.0°C的培养箱中培养24?48小时，菌苔长好后直接上罐或放置O?5°C冰箱中备用。3.根据权利要求2所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养方法，其特征在于，所述的菌种来源于中科院天津工业生物技术研究所，菌株是一株Escheri chi a Col iK12W3110 变种。4.根据权利要求2所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养方法，其特征在于，所述的10%的AMP溶液由氨苄西林溶解于蒸馏水中制得。
【专利摘要】发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的菌种培养基和培养方法，培养基由酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、AMP组成，培养方法，首先菌种培养基用2N的NaOH溶液调pH到7.0，分装于10ml斜面试管或50ml茄子瓶中，加塞包牛皮纸，灭菌，取出冷却到50～60℃后于无菌室中加入10％的AMP溶液，摇匀后倾斜放置，待凝固后置无菌室备用；在超净工作台用接种环划一环菌种均匀涂布在试管或茄子瓶空白斜面上，放置37±1.0℃的培养箱中培养24～48小时，菌苔长好后直接上罐或放置0～5℃冰箱中备用。本发明选用菌种在所配制的固体培养基中培养，菌种培养良好，有利于提高L-羟脯氨酸的发酵水平、降低生产成本、避免环境污染。
【IPC分类】C12P13/24, C12R1/19
【公开号】CN105506018
【申请号】CN201511034740
【发明人】赵体金, 林俊辉, 彭久合
【申请人】天津市敬业精细化工有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日