一株广谱性植物病害生防毛壳菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株毛壳菌，属于植物保护、植物病害综合治理中的生物防治领域。
【背景技术】
[0002]生物防治指利用有益生物及其产物来抑制病原物的生存和活动，从而减轻或抑制病害发生发展的植物病害防治技术。相比于化学防治，生物防治具有对人畜安全，不会诱导病原菌产生抗药性，能对生态环境起到积极长效的调控作用等优点。因此，随着人们对环境保护意识的增强，大力研发和应用生物农药以逐步取代化学农药已经成为现代农业产业化发展的新趋势。
[0003]生防菌在植物病害生物防治中起着举足轻重的作用。植物病害防治中使用生防菌后所表现出来的良好的防病效果、对生态系统的安全性以及对人类和各种生物的无毒害等优点已得到人们的认可。因此，从自然界寻找有益微生物对植物病害进行可持续控制和无公害治理已成为一个十分活跃并显示良好应用前景的领域。
[0004]应用于植物病害生物防治的生防菌主要利用微生物之间的拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、交叉保护作用等来减轻病害的发生。目前，生产上开发应用的生防菌涉及真菌、细菌、放线菌、病毒等。真菌中应用广泛的有木霉菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌及菌根真菌等;生防细菌主要有芽胞杆菌、假单胞杆菌、放射性土壤农杆菌等。其中，土壤杆菌、枯草芽孢杆菌都已广泛应用;放线菌中应用最多的是链霉菌及其变种，如井岗霉素、农抗120等;病毒主要是利用弱毒株系的交叉保护作用进行病毒病的防治。
[0005]毛壳菌属于子囊菌门、核菌纲、粪壳目、毛壳菌科、毛壳属的真菌，曾先后发现于动植物体、土壤、尘粒及一些动物的粪便中。近年来的研究发现毛壳菌是类极具生防潜力的真菌类群，其生防作用以球毛壳菌的研究较多，已报道球毛壳菌对苹果黑星病菌、辣椒炭疽病菌、立枯丝核菌、小麦锈病菌、水稻稻瘟病菌等均具有较强的抑制作用。毛壳菌对植物病原菌的抑制作用以营养竞争和产生抑菌物质为主要作用途径，其中以抑菌物质研究最多，目前以发现的毛壳菌产生的抑菌物质主要有chaetoglobosin、chaetoglobosin、chaetocin和chaetoaurin^o
[0006]目前，用于植物病害生物防治的生防菌研究报道较多，生防菌也筛选、保存有一定的数量，但实际生产中，能够推广应用的生防菌却较少。究其原因，除了生防菌的微生物活性成分在生产、保存和施用过程中易受环境因子的影响外，目前报道的生防菌大多只作用于某种或者某一类植物病害，抑菌谱窄，且对已分离筛选的生防菌的主要生物学特性及主要抗耐性研究滞后。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是:提供一株具有广谱性抑菌作用的植物病害生防菌株，阐明其主要生物学特性及抗耐性，并提供其在生产中的应用方案。
[0008]本发明提供的生防菌株LB-1是从龙柏鳞叶小枝中分离、筛选而来的，通过形态学观察及ITS序列分析，鉴定其为毛壳属(Chaetomium spp)真菌中的近缘毛壳(Chaetomiumsubaffine)，于2015年10月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCN0.11400。保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009]本发明提供的生防近缘毛壳菌可以用于植物病害(尤其是顽固性土传病害)的生物防治。
[0010]本发明的有益效果:本发明的生防菌株LB-1对生产中常见的顽固性土传植物病原菌(如尖孢镰刀菌、小麦根腐病菌)及常见植物叶部病害的病原菌(如番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌、水稻纹枯病菌、致病性交链孢菌等)均具有良好抑制作用，对于有效解决农业生产中根部病害导致的连作障碍及常见叶部病害化学防治导致的农药残留等环境污染问题，推动农业产业的优质、无公害发展。
【附图说明】
[0011]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0012]图1是本发明的生防菌株形态特征。
[0013]图2是本发明菌株的ITS序列分析的系统进化树。
[0014]图3是本发明菌株对致病性尖孢镰刀菌和交链孢菌的抑制效果。
[0015]图4是本发明菌株发酵液对致病性尖孢镰刀菌和交链孢菌的抑制效果。
【具体实施方式】
[0016]实施例1菌株的筛选
采用组织分离法，从龙柏鳞叶小枝中分离、筛选该生防菌株。首先用自来水去除健康龙柏鳞叶小枝上的尘污，75%乙醇、0.1%升汞依次消毒处理后无菌水冲洗5遍。切取2-3 mm长的消毒龙柏鳞叶小枝组织，于25°C、12 h光照条件下在PDA平板上培养，获得的优势菌株再次在PDA平板上纯化，观察并记录菌落形态特征。
[0017]菌种鉴定:①形态观察:用1%的葡萄糖溶液将分离纯化的菌落制成菌悬液临时装片，借助于数码显微镜观察病原菌的形态特征；②ITS序列分析:CTAB法提取菌种基因组DNA，真菌通用弓丨物 ITSl ( 5 ’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’)和ITS4 ( 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ’)对提取的DNA进行PCR扩增。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测、TaKaRa琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、测序。测序结果与GenBank数据库中已登录真菌的rDNA-1TS序列进行同源性比较，MEGA 4.0软件中的邻接法构建系统发育树。
[0018]结果见图1-2。
[0019]生物学特性测定:采用菌饼接种TOA平板，十字交叉法测定菌落直径以评判菌种生长状况的方法，测定本发明的生防菌株的温度、PH、最佳碳、氮源及其对紫外线、水分胁迫及盐胁迫的耐受性等主要生物学特性。
[0020]生物学特性分析结果表明，该发明的生防菌株LB-1生长的温度范围为4_38°C，最适温度为25-30°C，致死温度为65°C;pH值范围为4-13，在pH7-10的范围内均能很好生长;黑暗和自然光照对病菌的生长没有明显影响，但持续光照可明显抑制其菌丝扩展；该菌株可吸收利用多种常见单糖、二糖和多糖及有机和无机氮源，但其生长的最佳碳源为甘露醇和葡萄糖，最佳氮源为尿素。该发明的生防菌株对紫外照射、盐胁迫、水分胁迫均有很好耐受性，持续紫外照射120分钟以下，生长基质中NaCl含量在0.75M、生长基质中PEG含量在25%以下对其生长均无明显影响。
[0021]培养方法:采用传统的TOA固体培养可获得大量LB-1菌组织；以葡萄糖或者甘露醇为碳源，在23-25°C的条件下振荡培养3-4天，即可获得具有很好抑菌作用的菌体发酵液。
[0022]实施例2菌株的抑菌实验
(一)本发明菌株对致病性尖孢镰刀菌和交链孢菌的抑制效果实验。
[0023]采用平板对峙培养法筛选生防菌，并检测抑菌率:分别接种直径6_的分离纯化的LB-1菌株和指示菌菌饼于PDA培养基两端的相对位置上，放置于光照培养箱中培养(25°C，8h光照)。设单独培养的指示菌为对照。3天后，采用十字交叉法测定对照平板中单独培养的菌落半径(Re)和对峙培养平板中的趋向半径(Rp)，根据下列公式计算抑菌率，分析筛选出的生防菌对指示菌的抑制作用(邓振山等，2009):抑菌率(％)=[ (Rc-Rp)VRc X 100。结果见
图3.图中，左边是尖孢镰刀菌，右边是交链孢菌。
[0024](二)本发明菌株发酵液对致病性尖孢镰刀菌和交链孢菌的抑制效果实验。
[0025]发酵液的获得:将生防菌株LB-1在PDA平板上活化，刮取菌丝，以0.1%的接种量接入液体PDA培养基中，振荡培养4d(25°C，转速为120r/min)。培养的发酵液经双层纱布过滤除去菌丝，滤液lOOOOr/min离心15分钟，得到的上清液即为发酵液。
[0026]发酵液抑菌作用测定:将发酵液分为两份，一份经高压灭菌锅灭菌，一份未灭菌，然后将两份发酵液与分别与PDA培养基以1:2的体积比混合，制成含有LB-1发酵液的TOA平板，接种直径6_的指示菌(交链孢菌和尖孢镰刀菌)菌饼于平板中央，置于光照培养箱中培养3d(25°C，12h光照)。对照为不含发酵液的PDA平板。根据对照和处理TOA平板上指示菌的菌落直径大小，计算灭菌发酵液的抑菌率。结果见图4。图中，左边是尖孢镰刀菌，右边是交链孢菌。
[0027]本发明的生防菌株对致病性尖孢镰刀菌、交链孢菌、大丽轮枝菌等均具有很好的抑制作用，其中对尖孢镰刀菌的最大抑菌率达75.3%，且其培养发酵液可对致病菌的菌丝可起到明显的溶解作用。同时，由于本发明的生防菌对紫外线、盐胁迫及水分胁迫具有很好的抗耐性，因此，是一株具有很好环境适应性的优良生防菌株。实际生产应用中可通过根部接种、叶面喷施等方式施用。
【主权项】
1.一株毛壳菌，于2015年10月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCN0.11400。2.权利要求1所述毛壳菌在植物病害生物防治上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一株广谱性植物病害生防毛壳菌，是从龙柏鳞叶小枝中分离、筛选而来的，通过形态学观察及ITS序列分析，鉴定其为毛壳属（<i>Chaetomium</i>？spp）真菌中的近缘毛壳（<i>C.？subaffine</i>），于2015年10月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏登记号为CGMCCNo.11400。本发明提供的毛壳菌可用于植物病害的生物防治。本发明的生防菌株对生产中多种常见的植物病原菌（枯萎病尖孢镰刀菌、番茄灰霉病菌、根腐病菌）等均具有很好地抑制作用，尤其是对顽固性土传植物病原菌（大丽轮枝菌和尖孢镰刀菌）抑制效果显著，可解决设施种植模式下根部病害导致的连作障碍，推动农业产业的优质、无公害发展。CGMCCNo.1140020151019
【IPC分类】C12N1/14, C12R1/645, A01P3/00
【公开号】CN105524841
【申请号】CN201510751523
【发明人】刘彩云, 常志隆, 阚世红
【申请人】潍坊学院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年11月9日