一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种重要作物病毒的全长cDNA侵染性克隆构建方法及其应用领域，尤 其是一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] ±传禾谷类作物病毒病在世界类广泛发生且一直难W防控。在上世纪末，本实验 室在我国山东首次发现了一种引起小麦花叶病的±传病毒，分子鉴定显示该±传病毒是植 物病毒的一个新种，命名为中国小麦花叶病毒(化inese wheat mosaic virus,CWMV)。该病 毒新种现已划入靑状病毒科(family Virgaviridae)菌传杆状病毒属（genus Furovirus)。 CWMV可由根部专性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)传播且可在真菌介体的休眠抱 子中存活数载，因此，化学药剂也难W将〔￥1￥从±壤中根除。CWMV在小麦病株上引起典型的 症状包括:幼叶呈现稱绿条纹，老叶则黄化甚至变成紫色。严重的病株矮缩、萎黨甚至死亡， 从而导致产量损失严重。
[0003] CWMV粒子呈棒状，内含2条单链正义RNA(ssRNA)基因组片段，即RNA1和RNA2。本实 验室的基因组测序分析表明RNA1长7147nt，编码3个病毒运动和复制所必需的蛋白；而RNA2 则较短，仅3564nt，编码4个蛋白，其中3个与病毒外壳蛋白有关，另一个则是富含半脫氨酸 的RNA沉默抑制子。病毒全长cDNA克隆是为深入理解病毒生物学特性的重要技术手段，CWMV 侵染性克隆的缺乏不仅严重阻碍了人们对CWMV侵染、复制、组装、致病机制的理解，而且也 限制了实验室小麦抗性的鉴定。自从本实验室测定了CWMV的基因组全序列后，一直尝试构 建其全长cDNA侵染性克隆，但均未成功。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种简单快速的构建中国小麦花叶病毒 侵染性克隆的方法及其应用。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案:一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆 的方法，具体包括W下步骤：
[0006] 1)引物设计:基于本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列 共设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对P1F/P1R用于扩增RNA1，引物对P2F/P2R用于扩 增RNA2;
[0007] 2)病毒基因组总RNA提取：取含5 0 -10 0μ 1 CWMV粒子的提取液，利用Tr i Z 01试剂 (Invitrogen)按照试剂说明书提取病毒基因组总RNA;
[000引 3)扩增反应：W提取的病毒基因组RNA作逆转录模板，采用高保真的扣usio邮DNA 聚合酶(肥B)进行扩增，其中引物对P1F/P1R扩增的RNA1产物长约7.2-化，引物对口2。作2巧广 增的RNA2产物长约3.6-化；
[0009] 4)病毒cDNA克隆:扩增RNA1和RNA2产物分别用BamHI/SacI、HindI/EcoRI进行双酶 切反应，酶切产物经纯化后，分别连接至经过同样双酶切的质粒载体上，转化大肠杆菌，测 序验证获得分别含RNAl和RNA2全长cDNA片段的重组质粒PT7-R1、pT7-R2;
[0010] -种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法的应用，具体步骤包括：
[0011] 1)体外转录:重组质粒PT7-R1、pT7-R2分别经限制性内切酶Spel单酶切，获得线性 化的重组质粒载体并用于体外转录，体外转录反应采用Ambion mMessage mMachine试剂盒 (Invitrogen)参照产品说明书步骤进行；
[0012] 2)摩擦接种：然后取RNA1和RNA2体外转录各扣g混合，溶解于1ml含50mM甘氨酸 (glycine)、50Mm憐酸氨二钟化抽Κ)4)、pH 9.2的缓冲液，然后取少许石英砂摩擦接种植物；
[0013] 3)侵染活性分析:二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化。
[0014] 表1用于构建克隆的引物
[0015]
[0016] 发明有益的效果是:本发明针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难点，发展建 立了一种简单快速构建其全长cDNA克隆的方法，并成功获得了具有侵染活性的全长cDNA克 隆，运不仅有助于相关病毒的基因功能、反向遗传学的研究，而且有利于小麦抗性的筛选 等。
【附图说明】
[0017] 图1: CWMV全长cDNA克隆体外转录物侵染性活性分析，其中叶片1来自于摩擦接种 CWMV全长cDNA克隆体外转录物的小麦植株;叶片2来自于接种野生型CWMV的小麦植株;叶片 3来自于模拟接种(mock-inoculate)的小麦植株；
[0018] 图2:No;rthe;rn blotting分析CWMV全长cDNA克隆体外转录物在小麦体内的复制活 性，其中样品1为模拟接种(mock-inoculate)的健康小麦;样品2为接种野生型CWMV的病株 小麦;样品3为摩擦接种CWMV全长cDNA克隆体外转录物的小麦植株；
[0019] 图3:应用电子显微镜观察分析CWMV全长cDNA克隆体外转录物在小麦体内形成的 病毒粒子，其中比例尺表示50nm。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0021] 实施例:一种简单快速的构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法及其对小麦的 侵染活性分析，具体步骤：
[0022] 引物设计:通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共 设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对P1F/P1R用于扩增RNA1，引物对P2F/P2R用于扩增 RNA2；
[002引病毒基因组总RNA提取：取含50-100μ1 CWMV粒子的提取液，利用Trizol试剂 (Invitrogen)按照试剂说明书提取病毒基因组总RNA，即将病毒提取液转入1.5ml新离屯、 管，加入1ml Trizol试剂（Invitrogen)，振荡混匀后加入ο . 2ml氯仿，混匀后静置3-5min， 12000g离屯、lOmin，取上清至新离屯、管并加入等体积异丙醇，混匀后12000g、4°C条件下离屯、 lOmin，弃上清，沉淀用70 %乙醇洗2次，干燥后将沉淀溶解于无 R化se的dd此0中，提取的病 毒基因组RNA经琼脂糖凝胶电泳检测合格后保存于-80°C备用；
[0024] 扩增反应：W提取的病毒基因组RNA作逆转录模板，采用高保真的Phusiot#DNA聚 合酶(肥B)进行扩增，其中引物对P1F/P1R扩增的RNA1产物长约7.2-化，引物对P2F/P2R扩增 的RNA2产物长约3.6-化，CWMV RNA1和RNA2的扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化 后保存备用；
[00巧]病毒cDNA克隆:扩增RNA1和RNA2产物分别用BamHI/SacI、HindI/EcoRI进行双酶切 反应，酶切产物经纯化后，分别连接至经过同样双酶切的质粒载体上，转化大肠杆菌，测序 验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒PT7-R1、pT7-R2;
[0026] 体外转录:重组质粒pT7-Rl、pT7-R2分别经限制性内切酶Spel单酶切，获得线性化 的重组质粒载体并用于体外转录，体外转录反应采用Ambion mMessage mMachine试剂盒 (Invitrogen)参照产品说明书步骤进行；
[0027] 摩擦接种：取RNA1和RNA2体外转录产物各扣g，混合并溶解于1ml含50mM甘氨酸 (glycine)、50mM憐酸氨二钟化抽Κ)4)、抑9.2的缓冲液，然后取少许石英砂摩擦接种植物， 二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化。
[0028] 结果分析:在接种体外转录产物后，小麦植株的系统叶片上明显呈现稱绿花叶症 状（图1)，运与野生型病毒引起的症状相似，而与模拟接种的对照小麦叶片明显不同，表明 本发明构建的CWMV全长cDNA具有侵染活性且能在植物体内系统运动;Northern Blotting 检测显示本发明构建的CWMV全长cDNA侵染性克隆能够在小麦植株中高效地复制，且能够产 生大量的亚基因组RNA(subgenomic RNA，sgRNA)(图2);应用电子显微镜观察显示，在接种 CWMV全长cDNA克隆转录产物的小麦病汁液中可发现大量的病毒粒子（图3 )，表明本发明构 建的CWMV全长cDNA侵染性克隆能够在小麦植株中正确地组装形成病毒粒子，和野生型病毒 一样在小麦体内完成其生命循环；另一方面接种CWMV全长cDNA克隆转录产物的烟农22( - 个小麦品种名称)能够发展形成典型的花叶症状，也表明该小麦品种是一个感病品种，对中 国小麦花叶病毒缺乏抗性。因此，本发明不仅针对当前中国小麦花叶病毒研究技术的难点， 发展建立了一种简单快速构建其全长cDNA克隆的方法，成功获得了具有侵染活性的全长 cDNA克隆；而且有益于开展小麦花叶病抗性品种的筛选已及相关病毒的反向遗传学研究等 工作。
[0029] 除上述实施例外，本发明还可W有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法，包括以下步骤： 1) 引物设计:基于本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设 计4条引物，其中引物对P1F/P1R用于扩增RNA1，引物对P2F/P2R用于扩增RNA2; 2) 病毒基因组总RNA提取:取含50-100μ1中国小麦花叶病毒粒子的提取液，利用Trizol 试剂按照试剂说明书提取病毒基因组总RNA; 3) 扩增反应：以提取的病毒基因组RNA作逆转录模板，采用高保真的Phusion DNA聚合 酶进行扩增，其中引物对P1F/P1R扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对P2F/P2R扩增的RNA2 产物长约3.6-kb; 4) 病毒cDNA克隆:扩增RNA1和RNA2产物分别用BamHI/SacI、HindI/EcoRI进行双酶切反 应，酶切产物经纯化后，分别连接至经过同样双酶切的质粒载体上，转化大肠杆菌，测序验 证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒pT7-Rl、pT7-R2。2. -种根据权利要求1所述的构建中国小麦花叶病毒侵染性克隆的方法的应用，包括 以下步骤： 1) 体外转录:重组质粒pT7-Rl、pT7-R2分别经限制性内切酶Spel单酶切，获得线性化的 重组质粒载体并用于体外转录，体外转录反应采用Ambion mMessage mMachine试剂盒参照 产品说明书步骤进行； 2) 摩擦接种:取RNA1和RNA2体外转录各5yg混合，溶解于lml含50mM甘氨酸、50Mm磷酸氢 二钾、pH 9.2的缓冲液，然后取少许石英砂摩擦接种植物； 3) 侵染活性分析:二周后进行病毒分子检测并记录植株表型变化。
【专利摘要】本发明涉及一种简单快速构建中国小麦花叶病毒全长cDNA侵染性克隆的方法，应用一套病毒基因组特异性引物以纯化的病毒基因组RNA为模板进行一步法RT-PCR扩增，该套引物共有4条，分别为P1F、P1R、P2F、P2R，扩增产物经纯化后连接至载体，生物学活性分析显示本方法所获得的CWMV全长cDNA克隆能成功地侵染小麦等植物并可在植物体内复制、系统运动和装配，表明该克隆具有侵染活性，可用于相关病毒功能基因组研究和植物抗病性分析。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/66
【公开号】CN105543271
【申请号】CN201610002962
【发明人】张恒木, 羊健, 张芬, 李静, 陈剑平
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月4日