一种产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种产酸性Ct-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法，是以Ζ1-2-1菌株为菌种进行接种发酵产酶的，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]淀粉是自然界中仅次于纤维素的第二大多糖储备物质，是许多食品与非食品行业的重要组成部分。直到19世纪之前，淀粉水解使用的是稀盐酸的酸水解法，但因该法的糖含量较低且产生一些不必要的化合物，现在几乎完全被酶水解法取代，α-淀粉酶能将淀粉水解成糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等一系列小分子物质，是目前用途较广泛的一种酶制剂。现今α_淀粉酶工业生产主要由微生物发酵所得。
[0003]液体发酵由于发酵条件可以人为进行调控而被广泛应用于传统的工业生产酶制剂当中。但是在发酵过程中，培养基的成分和比例在很大程度上影响着微生物的生长及酶产量。此外，发酵的温度、PH以及其他的一些物理、化学参数也会对发酵效果起到重要作用，进而最终影响菌株酶产量。因此，为了满足工业生产中低成本、高产率的需求，需要对筛选获得的优良菌株发酵条件进行优化，以期利用最低的成本创造最高的经济价值。
[0004]传统优化生产工艺的方法如单因素法，实验设计简单，能够获得单个因素的影响，但容易忽视各个因素间的互作关系。而新的统计学方法，比如用响应面设计就可以从众多发酵条件因素中较快筛选出主效应因子，结合响应面法中的中心组合设计可对筛选出的主效应做进一步的优化，快速获得最佳的发酵条件，已经被广泛应用到许多的发酵工艺条件优化中。
【发明内容】
[0005]本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供的一种产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶工艺方法，是以菌种保藏号CGMCC N0.11587的Ζ1-2-1菌株(该菌株于2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)为菌种进行发酵产酶，进而制备出酸性α-淀粉酶，具体步骤如下:
a、种子培养:培养基成分:10-30g/L可溶性淀粉，10-20 g/L蛋白胨，0.02-0.06 g/LCa2+, 0.03 g/L KH2PO4,0.025 g/L (NH4)2SO4, pH5_6(优化后为 5.54)，菌种接入后于 38 土0.5 °C、120 rpm摇床培养12h，制成种子液；
b、将a步骤所得种子液以体积比10%接种量，接种于成分同步骤a的培养基中，pH5_6(优化后为5.54)，10mL三角瓶装液量41.28 mL，38±0.5°C、120 rpm摇床培养12h，作为二级种子液;此条件也即摇瓶发酵，酶活为201.2 U/mLo
[0007]c、将b步骤所得二级种子液以体积比10%接种量，接种于小型5L发酵罐，发酵罐内，培养基成分同步骤&的培养基，发酵温度38±0.5°(:，罐压0.03 10^，通气比0.5-1.0 V/V.min，发酵时间为48h，所得酶活为282.6 U/mL。
[0008]经单因素和响应面优化后，得到优选的培养基为:20.2 g/L可溶性淀粉，13.9 g/L蛋白胨，0.065 g/L Ca2+,0.03 g/L KH2PO4,0.025 g/L (NH4)2SO4o
[0009]本发明的有益效果:以自主筛选诱变育种而得到的产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株(Leclercia sp.)Ζ1_2_1为菌种进行发酵产酶，发酵培养基和产酶方法具有发酵周期短，条件温和，易于控制，提供的最佳发酵条件，具有产酶效率高，且淀粉酶酶活力高，酶活力稳定等优点。
[0010]【附图说明】:
图1培养基成分响应面图。
[0011]图2发酵罐酶活曲线与生长曲线。
【具体实施方式】
[0012]本发明用下列实例来进一步说明本发明，但不限于下列实例。
[0013]—种产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶工艺方法，是以菌种保藏号CGMCCN0.11587的Ζ1-2-1菌株为菌种进行发酵产酶，进而制备出产酸性α-淀粉酶，具体步骤如下:
a、种子培养:培养基成分:20.2 g/L可溶性淀粉，13.9 g/L蛋白胨，0.065 g/L Ca2+，0.03 g/L KH2PO4,0.025 g/L (NH4)2SO4，pH5.54，菌种接入后于38 °C、120 rpm摇床培养12h，制成种子液；
b、将a步骤所得种子液以体积比10%接种量，接种于成分同步骤a的培养基中，pH5.54，10mL三角瓶装液量41.28 mL，38 °C ,120 rpm摇床培养12h，作为二级种子液;此摇瓶发酵水平酶活为201.2 U/mL。
[0014]c、将b步骤所得二级种子液以体积比10%接种量，接种于小型5L发酵罐，发酵罐内培养基成分同步骤a的培养基，发酵温度38°C，罐压0.03 MPa，通气比0.5_1.0 V/V‘min，发酵时间为48h，酶活为282.6 U/mL。
[0015]本发明以下对相关条件的具体优化过程描述如下:
实施例1单因素优化发酵培养基和产酶条件
本发明采取以下方法完成发酵培养基和产酶条件的单因素优化:
碳源:分别以1%麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉作为碳源，10%的接种量至50 mL发酵培养基中，37°C、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活。
[0016]酶活测定方法为DNS法。酶活定义:60°C、pH6.0条件下，I mL酶液每分钟水解淀粉产生I mg麦芽糖的酶量为一个酶活力单位，单位为U/mL。下述实施例相同测定。
[0017]氮源:分别以0.5%蛋白胨、牛肉膏、棉籽饼、黄豆饼、酵母膏、胰蛋白胨作为氮源，10%的接种量至50 mL发酵培养基中，37°C、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活。
[0018]〇&2+浓度:分别设置0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8g/L Ca2+浓度，10%的接种量至50 mL发酵培养基中，37°C、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活。
[0019]温度:以10%的接种量将种子液接至50 mL发酵培养基，分别于28、30、37、40°C振荡培养，从产酶高峰期开始，每4小时测定酶活。
[0020] 初始pH:调节发酵培养基初始pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，接入10%种子液，37°C、200 r/min培养，在产酶高峰期取样，测定酶活。
[0021 ] 装液量:在10mL三角瓶中分别装入20、30、40、50 mL发酵培养基，接入10%的种子液，37°C、200 r/min培养，在产酶高峰期测定酶活。
[0022]实施例2响应面优化
根据单因素优化实验结果，在摇瓶发酵水平针对碳源、氮源、Ca2+浓度对培养基进行响应面优化，经Des ign-expert软件设计三因素三水平响应面实验。
[0023]经Dexpert expert 8.0软件进行优化，得到响应面图，如图1所示，抛物面开口向下，有极大值点。以酶活最高为指标。分析结果表明，添加2.02%可溶性淀粉、1.39%蛋白胨和0.065 g/L Ca2+效果最佳。采用该配方进行验证试验，得到酶活与模型预测值较接近，说明该模型较可靠。
[0024]根据单因素与培养基响应面优化实验结果，在摇瓶发酵水平针对PH、温度、装液量对发酵条件进行响应面优化，经Design-expert软件设计三因素三水平响应面实验。结果显示温度38.11°C，pH5.54，100 mL摇瓶装液量41.28 mL效果最佳，在此条件下酶活为201.02U/mL，且验证试验结果可靠。
[0025]实施例3发酵罐放大培养
选取响应面优化实验最佳培养基与培养条件，以10%接种量在5L发酵罐，发酵84h，取样并测试酶活与生长曲线，发酵48h时酶活最高。酶活与生长曲线见图2。
【主权项】
1.一种产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法，其特征在于:该方法是以菌种保藏号CGMCC N0.11587的Z1-2-1菌株为菌种进行发酵产酶，进而制备出产酸性α-淀粉酶，具体步骤如下: a、种子培养:培养基成分:10-30g/L可溶性淀粉，10-20 g/L蛋白胨，0.02-0.06 g/LCa2+, 0.03 g/L ΚΗ2Ρ04，0.025 g/L (NH4)2SO4, pH5.0-6.0，菌种接入后于 38± 0.5 °C、120rpm摇床培养12h，制成种子液； b、将a步骤所得种子液以体积比10%接种量，接种于成分同步骤a的培养基中，pH5.0-6.0，10mL三角瓶装液量41.28 mL，38±0.5 °C、120 rpm摇床培养12h，作为二级种子液； C、将b步骤所得二级种子液以体积比10%接种量，接种于小型5L发酵罐，发酵罐内培养基成分同步骤a的培养基，发酵温度38 ± 0.5 °C，罐压0.03 MPa，通气比0.5_1.0 V/V.min，发酵时间为48h。2.根据权利要求1所述的产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法，其特征在于:所述培养基经单因素和响应面优化后成分为:20.2 g/L可溶性淀粉，13.9 g/L蛋白胨，0.065 g/L Ca2+,0.03 g/L KH2PO4,0.025 g/L (NH4)2SO4o3.根据权利要求1所述的产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法，其特征在于:pH为5.54。
【专利摘要】一种产酸性α-淀粉酶的勒克氏菌株的发酵产酶方法，其特征在于：该方法是以菌种保藏号CGMCC？No.？11587的Z1-2-1菌株为菌种进行发酵产酶，进而制备出酸性α-淀粉酶，发酵培养基成分：20.2？g/L可溶性淀粉，13.9？g/L蛋白胨，0.065？g/L？Ca2+，0.03？g/L？KH2PO3，0.025？g/L？(NH4)SO4，发酵产酶条件为温度38℃，初始pH？5.54。本发明的优点在于：通过筛选优化所得的发酵培养基和产酶方法具有发酵周期短，条件温和，易于控制，提供的最佳发酵条件，具有产酶效率高，且淀粉酶酶活力高，酶活力稳定等优点。CGMCC No. 1158720151105
【IPC分类】C12N9/26, C12N1/20, C12R1/01
【公开号】CN105567602
【申请号】CN201610072221
【发明人】屈建航, 尹伊, 李海峰, 翟焕趁, 胡元森, 王金水, 蔡静平, 屈凌波
【申请人】河南工业大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年2月2日