3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-s-转硫酶的显色底物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶生物技术领域，设及通过跟踪吸收变化测定谷脫甘肤-S-转硫酶即 GST活性的显色底物;此类底物在GST作用下与谷脫甘肤G細反应生成对应苯环上4-位氯原 子被GSH中硫原子取代的苯硫酸，便于通过测定产物吸收确定酶活性和筛选GSWW制剂。
【背景技术】
[0002] 谷脫甘肤硫转硫酶(GST)是广泛分布于各种生物体内的一组多功能同工酶，其主 要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷脫甘肤的琉基偶联生 成加合物，降低其化学反应活性，并促进偶联的加合物被排出细胞，避免对细胞的毒性。GST 的运些活性使得其抑制剂成为抑制肿瘤生长的药物，用酶标板高通量筛选65巧巧制剂就成 为重要的技术。常用的酶标仪能通过跟踪吸收高通量测定GST活性，运就需要显色底物用于 高通量筛选GST的抑制剂。目前测定GST活性常用还原性谷脫甘肤即G甜与1-氯-2,4-二硝基 苯即CDNB反应，生成苯环上氯原子被取代的苯硫酸产物;此产物相对于两种底物的吸收在 340nm显著增强，便于测定GST活性和表征GST的抑制剂。但CDNB在水中溶解性太差而依赖于 有机溶剂作为溶剂。常用作为药物筛选祀的GST同工酶对有机溶剂很敏感。因此，需要水溶 性更强的GST显色底物测定GST活性，W便于高通量筛选GSWW制剂。
[0003] 设计GST显色底物的最简易思路是设计苯环上带有易于在GST催化下被G細取代的 离去基团的苯环衍生物。作为GST的显色底物，其苯环上的离去基团需要有邻对位的基团促 进其离去W提高GST活性;其离去基团应吸电子但共而效应弱，使得被G甜取代后共辆体系 增大而在长波长处出现新的吸收峰或吸收显著增强。CDNB就在邻对位分别用了两个硝基吸 电子促进氯原子的离去和增加产物的共辆体系，使产物吸收峰红移且酶催化活性较高;在 远离运类离去基团的位置引入不共辆但能增溶的基团，就能得到水溶性更好的显色底物。
[0004] 为便于合成，本发明设计在氯苯对位有便于引入增溶基团的苯横酷胺衍生物，并 在氯原子邻位用硝基促进氯原子离去、增加酶活性和增大产物的共辆体系。
【发明内容】
[0005] 1.3-硝基-4-氯-苯横酷胺类谷脫甘肤-S-转硫酶的显色底物，其结构特征如下：
[0006]
[0007] 2.据权利要求1所述3-硝基-4-氯-苯横酷胺类谷脫甘肤-S-转硫酶的显色底物，其 应用特征是在谷脫甘肤-S-转硫酶即GST催化作用下，该显色底物与还原性谷脫甘肤即GSH 反应生成4-位氯原子被G細琉基取代的苯硫酸；相对于所述显色底物，此苯硫酸产物在 285皿前后10皿范围内的吸收有显著增加;选择在285皿前后IOnm波长范围内的某个波长作 为测定波长，测定此波长下吸收变化的初速度表示GST的活性，或者据产物的差消光系数进 一步换算成产物生成初速度表示GST活性。
[0008] 3.据权利要求1所述3-硝基-4-氯-苯横酷胺类谷脫甘肤-S-转硫酶的显色底物，其 合成过程特征为用所需甘氨酸、乙醇胺、氨基乙横酸、N，N-二甲基乙二胺之一，与3-硝基-4-氯苯横酷氯在不高于30摄氏度下反应;反应溶剂、反应物投料比及操作特征如下：
[0009] (1)甘氨酸和氨基乙横酸用四氨巧喃或1,4-二氧六环与水的混合溶剂溶解，添加 碳酸钢/钟或碳酸氨钢/钟中和所生成的酸，且氨基化合物摩尔量比3-硝基-4-氯苯横酷氯 过量5倍W上；
[0010] (2)乙醇胺和N，N-二甲基乙二胺直接作为溶剂，或用二氯甲烧、氯仿将氨基化合物 稀释后与3-硝基-4-氯苯横酷氯反应，且氨基化合物摩尔量比3-硝基-4-氯苯横酷氯过量2 倍W上；
[0011] (3)将氨基化合物的混合物或溶液转移到密闭的容器中；3-硝基-4-氯苯横酷氯用 四氨巧喃、1,4-二氧六环或其他与氨基化合物溶液相容的溶剂溶解，用恒压漏斗滴加到含 氨基化合物的密闭容器中，揽拌反应2小时W上，得到产物混合物；
[0012] (4)用乙醇胺或N，N-二甲基乙二胺所得产物混合物，滤去沉淀，过硅胶柱层析纯 化；
[0013] (5)用甘氨酸所得产物混合物滤去沉淀，减压去有机溶剂进行浓缩，加浓盐酸到抑 <2.0收集固体;水相再用二氯甲烧或氯仿萃取，萃取液浓缩后与酸化后收集的固体合并， 用二氯甲烧或氯仿溶解，过硅胶柱纯化；
[0014] (6)用氨基乙横酸所得产物混合物浓缩后滤去沉淀，再加浓盐酸到抑<2.0收集固 体为目标产物;用异丙醇、丙酬或乙腊和水的混合溶剂重结晶收集所得固体为目标产物。
[0015] 应用实施例1:3-硝基-4-氯本横酷乙醇胺的合成
[0016] (1)取4-氯-3-硝基苯甲酯氯1. Og溶解在5mL二氯甲烧中作为混合液A;
[0017] (2)取乙醇胺0.7g溶解在25mL二氯甲烧中作混合液B;
[0018] (3)将混合液A加入到恒压漏斗中，将混合液B转移到圆底烧瓶中，置于冰浴下；
[0019] (4)圆底烧瓶冰浴下，W2到3秒每滴的速度滴加混合液A，同时磁力揽拌；
[0020] (5)混合液A滴加完全后，撤去冰浴，使其自行升溫到室溫;持续揽拌持续反应16h;
[0021] (6)反应16h后，圆底烧瓶中有固体析出；
[0022] (7)反应混合物抽滤，将滤液收集在IOOmL圆底烧瓶中；
[0023] (8)混合液用ISmL 5%的盐酸水洗，混合液在分液漏斗中分层，取上层有机相；
[0024] (9)上步混合液用ISmL 5%的碳酸氨钢溶液水洗有机层；
[0025] (10)混合液用饱和的氯化钢溶液洗涂成中性；
[0026] (11)混合液过滤后，加压蒸干，得到黄色固体;溶解于2.Oml四氨巧喃中；
[0027] (12)过硅胶柱层析，二氯甲烧洗脱;收集不同于原料成分为所需显色底物(CNBS)。
[0028] 应用实施例2 :GST催化3-硝基-4-氯本横酷乙醇胺与GSH反应
[0029] (1)血吸虫GST的重组表达
[0030] 完全参照文献进行(杨宪峰，张灵，杨晓兰，龙高波，张奕，廖飞。融合标签谷脫甘肤 S-转硫酶高亲和配体的设计与筛选。重庆医科大学学报2012; 37(9): 791-795)。
[0031] (2)GST催化应用实施例中合成的显色产物CNBS与GSH反应的吸收光谱
[0032] 用重组表达GST,在20mM pH 6.5的憐酸盐缓冲液中，催化合成产物和G細加合，用 化iadzu UV2550扫描，记录吸收光谱随着反应进行产生的变化，见附图1。
[0033] (3)连续跟踪GST催化合成显色底物CNBS和GSH反应过程检测酶活性
[0034] 用重组表达GST，在20mMpH6.5的憐酸盐缓冲液中，，用化imadzuUV2550连续测 定285nm吸收变化，结果如附图2;用285nm的吸收变化初速度表示酶活性。 【附图说明】 图1是合成的显色产物CNBS与G甜反应的吸收光谱图 图2是GST催化合成显色底物CNBS和G甜反应过程酶活性连续跟踪检测图。
【主权项】
1.3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-s-转硫酶的显色底物，其结构特征如下：R: -COOH-CH2OH-CH2-SO3H-CH2-N- (CH3) 2。2. 据权利要求1所述3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物，其应用 特征是在谷胱甘肽-S-转硫酶即GST催化作用下，该显色底物与还原性谷胱甘肽即GSH反应 生成4-位氯原子被GSH巯基取代的苯硫醚;相对于所述显色底物，此苯硫醚产物在285nm前 后10nm范围内的吸收有显著增加;选择在285nm前后10nm波长范围内的某个波长作为测定 波长，测定此波长下吸收变化的初速度表示GST的活性，或者据产物的差消光系数进一步换 算成产物生成初速度表示GST活性。3. 据权利要求1所述3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物，其合成 过程特征为用所需甘氨酸、乙醇胺、氨基乙磺酸、N，N_二甲基乙二胺之一，与3-硝基-4-氯苯 磺酰氯在不高于30摄氏度下反应;反应溶剂、反应物投料比及操作特征如下： (1) 甘氨酸和氨基乙磺酸用四氢呋喃或1，4_二氧六环与水的混合溶剂溶解，添加碳酸 钠/钾或碳酸氢钠/钾中和所生成的酸，且氨基化合物摩尔量比3-硝基-4-氯苯磺酰氯过量5 倍以上； (2) 乙醇胺和N，N-二甲基乙二胺直接作为溶剂，或用二氯甲烷、氯仿将氨基化合物稀释 后与3-硝基-4-氯苯磺酰氯反应，且氨基化合物摩尔量比3-硝基-4-氯苯磺酰氯过量2倍以 上； (3) 将氨基化合物的混合物或溶液转移到密闭的容器中；3-硝基-4-氯苯磺酰氯用四氢 呋喃、1，4-二氧六环或其他与氨基化合物溶液相容的溶剂溶解，用恒压漏斗滴加到含氨基 化合物的密闭容器中，搅拌反应2小时以上，得到产物混合物； (4) 用乙醇胺或N，N-二甲基乙二胺所得产物混合物，滤去沉淀，过硅胶柱层析纯化； (5) 用甘氨酸所得产物混合物滤去沉淀，减压去有机溶剂进行浓缩，加浓盐酸到pH< 2.0收集固体;水相再用二氯甲烷或氯仿萃取，萃取液浓缩后与酸化后收集的固体合并，用 二氯甲烷或氯仿溶解，过硅胶柱纯化； (6) 用氨基乙磺酸所得产物混合物浓缩后滤去沉淀，再加浓盐酸到pH<2.0收集固体为 目标产物;用异丙醇、丙酮或乙腈和水的混合溶剂重结晶收集所得固体为目标产物。
【专利摘要】3-硝基-4-氯-苯磺酰胺类谷胱甘肽-S-转硫酶的显色底物，其结构特征是用3-硝基-4-氯-苯磺酰氯与乙醇胺、氨乙基磺酸、甘氨酸、N，N-二甲基乙二胺之一反应生成的苯磺酰胺；在谷胱甘肽-S-转硫酶即GST催化下，该显色底物与还原型谷胱甘肽即GSH反应生成苯硫醚；所得苯硫醚产物相对于显色底物在285nm附近的吸收显著增强；测定GST催化该显色底物与GSH反应过程中在285nm附近的吸收变化初速度，可表示GST活性并用于筛选抑制剂。
【IPC分类】C07C311/18, C07C311/19, G01N21/77, C07C311/16, C07C311/17, C07C303/38
【公开号】CN105669502
【申请号】CN201610093546
【发明人】廖飞, 刘芳, 杨晓兰, 胡小蕾, 种慧敏
【申请人】重庆医科大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月18日