一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，涉及生物工程领域。即利用不同磁场强度和脉冲数的脉冲磁场对醋酸菌进行处理，得到产酸量提高的醋酸菌突变株。使其产酸量提高了20%~60%，且遗传稳定性较好。
【专利说明】
一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，特指采用不同强度和脉冲数的脉冲磁场对醋酸菌进行处理，提高其产酸量。
【背景技术】
[0002]醋酸菌是一类能够将酒精转化为醋酸的严格好氧的革兰氏阴性细菌的总称。食醋酿造中醋酸菌产酸占据了非常重要的地位，提高其产酸量对食醋增产有重大意义。而且随着现代发酵技术的进步，杀菌力强、储存及运输成本低的高浓度的发酵醋逐渐被酿醋加工企业重视。
[0003]为了提高醋酸菌的产酸能力，探索和研究新的醋酸菌种是一个方向，如宋勇强等从甘肃民间地产传统酿造食醋醋醅中分离出一株高产酸醋酸菌(宋勇强，胡先望，沙芮，等.一株高产酸醋酸菌的分离与鉴定，中国微生态学杂志，2015，27(9): 997-1003.)，但此技术耗时长，并且结果也是无法预测的，其产量不仅受分离菌基因的影响，也受培养条件的强烈影响。此外，优化醋酸菌发酵技术也可以提高醋酸产量，如张卫华等从乙醇浓度、接种量、发酵温度及转速等方面对醋酸菌的产酸进行发酵条件的优化(张卫华，汪超，罗军杰，等.响应面优化醋酸菌发酵条件研究.中国酿造.2012，31(4):48-51.)，虽然优化发酵工艺可以提高醋酸菌的产量，但发酵成本较高。鉴于此，采用脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，从而达到食醋增产，降低劳动和生产成本的目的。
【发明内容】
[0004]本发明提供不同磁场强度和脉冲数的脉冲磁场处理菌株，使其产酸量提高了20%?60%，且遗传稳定性较好。
[0005]—种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，按照下述步骤进行:将菌株培养至对数生长期，从菌株中取5 mL于离心管中进行脉冲磁场处理，脉冲磁场的磁场强度范围为4?8T，脉冲数范围为10?40个。将处理完的菌液作梯度稀释，稀释到合适的梯度后取100 yL涂布于平板培养基上，30?35°C培养64?96 h，将培养好的平板取出并进行菌落计数，以出发菌株为对照，计算致死率，选择致死率为80%以上的平板进行培养。然后在30?35°C，150?180 r/min进行摇瓶培养，培养64?96 h后，即可提高醋酸菌产酸量。
[0006]菌株培养液态培养基(摇瓶培养的培养基)为:葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10g，蛋白胨3 gaOOO mL蒸馏水，30 mL无水乙醇，菌株固态培养基(平板培养培养基)是在上述液态培养基的基础上，加入18 g琼脂粉和30 mL 0.03%溴甲酚紫。
[0007]本发明所用的出发菌株是任何一种醋酸菌，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)等保藏的菌种、以及从环境中分离得到的菌种。优选从醋醅中分离得到的任何一种醋酸菌。
[0008]其中脉冲磁场的磁场强度为4?8T，脉冲磁场的脉冲数为10?40个。
[0009]本发明脉冲磁场处理后的菌株经过10代的传代后，其产酸量保持较稳定。
[0010]脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法简单经济、不仅可以增加醋酸产量，而且可以降低劳动和生产成本。
【具体实施方式】
[0011 ]根据本发明所采用的总酸的测定方法为:醋酸菌培养液，4000 r/min离心1min，去掉沉淀，取上层清液适量，用事先标定好的0.1 mol/L的NaOH滴定。根据公式产酸量(g/L) = (V_V0) XCNaOHX60/Vl式中:V为滴定发酵液样品所消耗的NaOH的体积，mL;
Vo为滴定对照空白培养基消耗的NaOH的体积，mL;
Vi为样品体积，mL;
CNa0H为标准的NaOH溶液的浓度，mol/L;
为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及方法，给出了以下实施例，但是下述实施例不以任何形式限制本发明的范围。
[0012]
实施例1
1.培养基的制备
菌株培养液态培养基(摇瓶培养的培养基):葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，加入1000 mL蒸馈水，121°C高压条件下灭菌20 min，加入30 mL无水乙醇。
[0013]菌株固态培养基(平板培养培养基):葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，琼脂粉18 g，加1000 mL蒸馏水溶解，完全混匀后加入0.03%溴甲酚紫30 mL，121°C高压条件下灭菌20 min，冷却后加入30 mL无水乙醇。
[0014]2.磁场脉冲处理
将菌株(Acetobacter，中国工业微生物保藏中心，保藏编号:CICC21684)培养至对数生长期，取5 mL菌液于离心管中进行脉冲磁场处理，磁场强度选用4 T，脉冲数40个。将处理完的菌液作梯度稀释，稀释到合适的梯度后取100 yL涂布于平板上，30°C培养64 h，致死率达到85%。
[0015]3.高产醋酸菌菌株
目测平板上菌落周围透明圈的直径，挑选出其中透明圈较大的10个独立的菌落。将这10株菌株用接种环接种到斜面试管中，30°C下培养64 h后，将这10个试管保存到4°C冰箱中，作为菌种备用。将处理后的菌株接入液体培养基，30°C下180 r/min摇床培养64 h后，醋酸菌的产酸量达到55、55、56、57、58、59、59、59、60、60 g/L，而出发菌株的产酸量为44 g/L，其产酸量最低提高了 25%，最高提高了 36.4%。
[0016]4.遗传稳定性测试
对其中3株产酸量最高的菌株，进行菌株传代培养，传代培养条件为温度30°C，培养时间64 h，传代10次，产酸量分别为49、51、52 g/L。
[0017]
实施例2
1.培养基的制备菌株培养液态培养基(摇瓶培养的培养基):葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，加入1000 mL蒸馈水，121°C高压条件下灭菌20 min，加入30 mL无水乙醇。
[0018]菌株固态培养基(平板培养培养基):葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，琼脂粉18 g，加1000 mL蒸馏水溶解，完全混匀后加入0.03%溴甲酚紫30 mL，121°C高压条件下灭菌20 min，冷却后加入30 mL无水乙醇。
[0019]2.磁场脉冲处理
将菌株(Acetobacter pasteurianus，中国工业微生物保藏中心，保藏编号:CICC22519)培养至对数生长期，取5 mL菌液于离心管中进行脉冲磁场处理，磁场强度选用8T，脉冲数10个。将处理完的菌液作梯度稀释，稀释到合适的梯度后取100 yL涂布于平板上，30 °C培养96 h，致死率达到80%。
[0020]3.高产醋酸菌菌株
目测平板上菌落周围透明圈的直径，挑选出其中透明圈较大的10个独立的菌落。将这10株菌株用接种环接种到斜面试管中，30°C下培养96 h后，将这10个试管保存到4°C冰箱中，作为菌种备用。将处理后的菌株接入液体培养基，30°C下160 r/min摇床培养96 h后，醋酸菌的产酸量达到60、61、63、66、67、68、68、69、70、70g/L，而出发菌株的产酸量为50 g/L,其广酸量最低提尚了 20%，最尚提尚了 40%。
[0021]4.遗传稳定性测试
对其中3株产酸量最高的菌株，进行菌株传代培养，传代培养条件为温度30°C，培养时间96 h，传代10次，产酸量分别为60、62、63 g/L。
[0022]
实施例3
1.培养基的制备
菌株培养液态培养基(摇瓶培养的培养基):葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，加入1000 mL蒸馈水，121°C高压条件下灭菌20 min，加入30 mL无水乙醇。
[0023]菌株固态培养基(平板培养培养基):葡萄糖10g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g，琼脂粉18 g，加1000 mL蒸馏水溶解，完全混匀后加入0.03%溴甲酚紫30 mL，121°C高压条件下灭菌20 min，冷却后加入30 mL无水乙醇。
[0024]2.磁场脉冲处理
将菌株(从醋醅中分离得到并鉴定为醋酸菌)培养至对数生长期，取5 mL菌液于离心管中进行脉冲磁场处理，磁场强度选用5 T，脉冲数20个。将处理完的菌液作梯度稀释，稀释到合适的梯度后取100 yL涂布于平板上，35°C培养72 h，致死率达到88%。
[0025]3.高产醋酸菌菌株
目测平板上菌落周围透明圈的直径，挑选出其中透明圈较大的10个独立的菌落。将这10株菌株用接种环接种到斜面试管中，35°C下培养72 h后，将这10个试管保存到4°C冰箱中，作为菌种备用。将处理后的菌株接入液体培养基，35°C下150 r/min摇床培养72 h后，醋酸菌的产酸量达到53、53、54、56、57、58、58、60、62、64g/L，而出发菌株的产酸量为40 g/L，其产酸量最低提高了 32.5%，最高提高了 60%。
[0026]4.遗传稳定性测试
对其中3株产酸量最高的菌株，进行菌株传代培养，传代培养条件为温度35°C，培养时间72 h，传代10次，产酸量分别为53、55、56 g/L。
【主权项】
1.一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，其特征在于按照下述步骤进行:将菌株培养至对数生长期，进行脉冲磁场处理，脉冲磁场的磁场强度范围为4?8 T，脉冲数范围为10?40个;将处理完的菌液作梯度稀释，稀释到合适的梯度后进行平板培养，28?35°C培养64?96h，将培养好的平板取出并进行菌落计数，以出发菌株为对照，计算致死率，选择致死率为80%以上的平板进行培养;然后在30~35°C，150?180 r/min进行摇瓶培养，培养64?96 h后，即可提高醋酸菌产酸量。2.根据权利要求1所述的一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，其特征在于菌株摇瓶培养培养基为:葡萄糖10 g，酵母粉或酵母浸膏10 g，蛋白胨3 g, 1000 mL蒸馈水，30 mL无水乙醇，菌株平板培养培养基是在上述液态培养基的基础上，加入18 g琼脂粉和30 mL0.03%溴甲酚紫。3.根据权利要求1所述的一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，其特征在于所用的出发菌株是任何一种醋酸菌，如中国普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)、中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)等保藏的菌种、以及从环境中分离得到的菌种;优选从醋醅中分离得到的任何一种醋酸菌。4.根据权利要求1所述的一种脉冲磁场提高醋酸菌产酸量的方法，其特征在于其中脉冲磁场的磁场强度为4?8 T，，脉冲磁场的脉冲数为10?40个。
【文档编号】C12J1/00GK105820977SQ201610209114
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月6日
【发明人】钱静亚, 尚磊, 沈凯誉, 高怡慧, 马海乐
【申请人】江苏大学