玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的应用
【专利摘要】本发明涉及玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的应用，将含有玉米ZmPPase4基因的表达载体转入植物中，筛选出转基因植株，并进行了耐盐性鉴定。本发明的ZmPPase4基因能显著提高植株的耐盐碱性，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
【专利说明】
玉米焦磷酸酶基因 ZmPPaSe4在提高植物抗逆性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植 物抗逆性中的应用。
【背景技术】
[0002] 盐碱胁迫是影响农作物生产的重要因素。植物在含有高浓度盐离子的土壤中，通 过水分运输，会导致植物组织中离子积累。过多的可溶性离子包括钠离子，钾离子等会影响 植物正常发育。另外，高浓度的盐导致的离子胁迫还会引起渗透胁迫，进而严重影响植物产 量。植物可以通过多种方式平衡盐离子吸收，包括限制摄入、增加钠离子的排泄、将盐离子 区室化到液泡，以及控制的钠离子的长途运输从根到地上部分，从而减弱地上部分细胞质 中钠含量。
[0003] 焦磷酸酶(pyrophosphatase，PPase，EC3 ? 6 ? 1 ? 1)是一种广泛存在于自然界的能够 参与合成糖和蛋白的多种代谢反应的水解酶。焦磷酸酶以焦磷酸为底物将焦磷酸基团水解 为磷酸盐。通常，焦磷酸酶可以分为两大类:一类是存在于细胞质和细胞基质中的可溶性无 机焦磷酸酶；另外一种是与膜结合的不可溶酶类。在细胞质内PPase活性较高，通过不断水 解PPi使得细胞质内PPi保持较低水平。植物液泡膜上PPase和液泡ATPase共同作用，构成植 物完整的质子栗跨膜运输体系，在植物生理活动中起重要作用。此外，PPase还可能参与将 无机盐离子运进液泡，从而调节细胞膨压。
[0004] 对于无机焦磷酸酶的生理机制研究较早，1975年Kawlsson从甜菜(Beta Vugaris) 根中首次分离到激活钾离子的PPase，它在水解PPi的同时，还能将H+从细胞质运送如液泡 膜内。1990年，Kieber从拟南芥中克隆了一个0RF为789bp的焦磷酸酶，其蛋白分子量约为 30kDa。1995年，Jorge从马铃薯中克隆了一个无机焦磷酸酶，发现该蛋白序列的催化结构域 与拟南芥同源域相似度非常高，从进化树及保守结构分析表明马铃薯、拟南芥和大肠杆菌 的无机焦磷酸化酶蛋白结构中都含有一个极端保守的疏水蛋白域。2008年，张宁、司怀军等 人克隆了一个马铃薯PPase基因，通过生物学软件对PPase基因及其编码的蛋白质的分析表 明，该基因与茄科属植物的同源性高达89 %~97 %，与其他物种基因的同源性在77 %~ 80%之间。其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点，没有跨膜区。通过亚细胞定位可知，它主 要定位于细胞质和线粒体基质，可能在糖代谢中发挥重要的调控作用。2009年张春凤，司怀 军等对转正义和反义PPase基因的马铃薯植株进行了功能研究，分析了焦磷酸酶的活性测 定条件，结果表明PPase在pH值为8.0时具有较高的活性，酶促反应的最适温度是42°C，不同 阳离子活性检测中Mg 2+与PPase亲和力最高。
[0005] 对液泡焦磷酸酶(V-PPase)的研究要晚于无机焦磷酸酶，1992年，Sarafian K等首 次筛选克隆出拟南芥V-PPase基因，研究结果表明，拟南芥V-PPase编码区为2310bp，编码 769个氨基酸。2000年，在拟南芥中克隆到了第2种类型的液泡焦磷酸酶，命名为AVP2。在上 述研究的基础上，研究者根据V-PPase的保守序列设计引物成功地从多种植物中克隆到焦 磷酸酶基因序列，经过多物种间的cDNA序列比对可知，其核酸序列非常保守，在其酶活性的 保守序列结构域中相似性可达到近90%。矿转运焦磷酸化酶(H+-PPase)属于液泡焦磷酸酶 的一种，在参与植物逆境胁迫响应中起重要作用。拟南芥A VP1编码一个H+-PPase焦磷酸酶， 主要在液泡膜上起H+转运作用，通过转运H+使液泡膜产生H+梯度，从而驱动Na+/H+离子栗等 反向转运。在拟南芥中过表达AVP1基因能够显著提高植株耐旱和耐盐碱能力。由此说明H+-PPase在植物逆境胁迫下通过调控H+梯度，从而调整细胞内外压差，对植物抗逆具有重要意 义。
[0006] 可见，目前对于植物抗逆基因的研究是近年来的热点领域，目前，这方面的研究工 作基本上是在模式植物拟南芥上进行的。对于重要作物(如水稻、玉米、小麦等）中此类基因 的研究较少，特别是有关玉米焦磷酸酶基因的功能研究尚未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的应用。 [0008]为了实现本发明目的，本发明提供的玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆 性中的应用，其中基因ZmPPase4编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0009] 本发明所述抗逆性包括耐盐碱性，即对盐碱胁迫的抗性。
[0010] 本发明所述植物包括但不限于拟南芥。
[0011] 前述的应用，通过在植物中过表达基因ZmPPase4的CDS序列，从而提高转基因植株 抗逆性。具体方法如下：
[0012] 提取玉米总RNA，反转录成cDNA，依据目的基因ZmPPase4的序列，设计PCR扩增引 物，从玉米cDNA扩增出如SEQ ID No.2所示的基因ZmPPase4的⑶S序列，并将所述⑶S序列构 建到植物表达载体上，转化植物，筛选转基因植株。
[0013]优选地，通过Gateway技术将所述⑶S序列构建到植物表达载体上，具体方法如下： 将所述CDS序列连接至入门载体pGWC上，得到的重组载体pGWC-ZmPPase4与载体 pEarleyGate202进行LR反应，即得重组表达载体pEar 1 eyGate202_ZmPPase4，并用 pEarleyGate202_ZmPPase4转化植物（图 1)。
[0014] ?0財广增所用引物为(3￡〇10如.3和4):
[0015] 正向引物F 5，-ATGGCGCCCGCTGTAGAAG-3'
[0016] 反向引物R 5'-CTACCTCCTCAGGCCCTCAAC-3'
[0017]携带有目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微 注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey， 1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0018] 本发明优选采用农杆菌介导的方法转化植物。
[0019] 优选地，利用草铵膦(口1108口11；[1101：111'；[0；[11，？?1')筛选转基因植株。
[0020] 本发明进一步提供玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4,基因ZmPPase4的⑶S序列为：
[0021] i)SEQ ID No .2所示的核苷酸序列；或
[0022] ii)SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0023] iii)在严格条件下与SEQ ID No.2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0024] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0025]本发明涉及玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的应用，将含有玉米 ZmPPase4基因的表达载体转入植物中，筛选出转基因植株，并进行了耐盐性鉴定。本发明的 ZmPPase4基因通过调控下游相关基因参与植物耐盐碱过程，对于培育高产的转基因农作物 具有重要意义。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例1中构建重组表达载体PEarleyGate202-ZmPPase4的流程图。
[0027]图2为本发明实施例3中转基因株系目的基因的PCR检测结果；其中，M:Marker;l: 正对照（以载体pEarleyGate202-ZmPPase4为PCR模板）；2:负对照（以野生型拟南芥DNA为 PCR 模板）；13、19、21、27、42、43、44、45、48、50、60和61:211^?3864不同转基因株系目的基因 扩增结果。
[0028]图3为本发明实施例4中转基因拟南芥与野生型植株在含有不同浓度NaCl的培养 基上生长情况比较结果。转35S: :ZmPPaSe4基因拟南芥种子点播在含有150mM NaCl的MS培 养基上，4°C春化3d后，置于22°C培养，10d后观察生长状况转基因株系在150mM NaCl的平板 上生长明显受到抑制，转基因株系(^-21、(^-37、(^-42长势明显优于訂，他(：1对幼苗根长也 有明显抑制作用。
[0029] 图4为本发明实施例5中高盐胁迫下转基因植株及野生型植株的表型比较结果;其 中，A为根长比较结果，B为鲜重比较结果。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0031]实施例1玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4的克隆及植物表达载体的构建
[0032] 1、提取玉米总RNA，反转录成cDNA，依据目的基因ZmPPase4的序列，设计PCR扩增引 物（3￡0 10如.3和4)，从玉米〇0嫩扩增出基因211^3864的〇)5序列（5￡0 10如.2)，并用琼 脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。
[0033] 2、将回收的片段与pGWC载体连接，然后后转化DH5a感受态细胞，获得阳性单克隆， 经测序鉴定得到与目的基因序列完全相同的单克隆，摇菌并提取该单克隆质粒，命名为 pGWC-ZmPPase4〇
[0034] 3、以pGWC_ZmPPase4为入门载体，pEar 1 eyGate202为表达载体，经过LR反应，获得 重组表达载体pEarleyGate202_ZmPPase4(图 1，即超表达载体35S: : ZmPPase4)。
[0035] 实施例2转基因拟南芥植株的获得
[0036] 1、构建好的超表达载体35S: :ZmPPase4转入农杆菌GV3101。
[0037] 2、用沾花浸染(floral dipping)的方法转化野生型拟南芥。
[0038] 3、将转化后得到的T0代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长约 两周后，用0.5%。的草铵膦喷洒T0代拟南芥筛选转化植株。
[0039] 4、由于所用的转化超表达载体中带有抗草铵膦的Bar基因，转化时可随目的基因 一起转入植物体，因此喷施PPT后大部分未转化植株死亡，而转化植株仍然能够正常生长。 转化植株按照不同株系分别收获n代种子。
[0040] 5、收获各转基因株系T2代种子后，用0.5%的NaCIO对种子进行消毒处理。然后点 种于含有〇. 5%〇PPT的MS培养基平板中（每个转基因株系需要约45粒种子），以野生型为负对 照。
[0041] 6、春化三天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在 含0.5%qPPT的MS培养基中无法存活;T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发 生基因分离与自由组合，因此会有一部分无草铵膦抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转 基因株系的种子能全部在含PPT的MS培养基中存活。
[0042]实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0043] 1、以提取的阳性植株的总DNA为模板，用如SEQ ID No.4和5所示的引物进行PCR扩 增，阳性植株能够扩增出645bp的条带，而假阳性植株则无PCR扩增产物。野生型植株不能扩 增出目的条带。（图2)
[0044] 2、收获各转基因株系T2代种子后，用0.5%的NaCIO对种子进行消毒处理。然后点 种于含有〇. 5%〇PPT的MS培养基平板中（每个转基因株系需要约45粒种子），以野生型为负对 照。
[0045] 3、春化三天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在 含0.5%〇PPT的MS培养基中无法存活。
[0046] 4、T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合， 因此会有一部分无卡那霉素抗性的种子出现；只有T2代为纯合体转基因株系的种子能全部 在含卡那霉素的MS培养基中存活。
[0047] 实施例4转基因植株及野生型植株的抗逆性比较
[0048] 将转35S: :ZmPPase4基因拟南芥株系点播在含有0mM、125mM、150mM的NaCl的MS平 板上，4°C春化3天后，置于22°C，16小时光照/8小时黑暗的培养箱中，5天后观察表型并进行 分析。结果见图3,从结果可以看出，野生型拟南芥在高盐胁迫下叶子萎蔫发黄程度严重，而 转基因株系0E-21、0E-37、0E-42长势较好。转基因株系及野生型在正常MS培养基中表型无 明显差别。
[0049] 实施例5高盐胁迫下转基因植株及野生型植株的表型比较
[0050] 将转35S: :ZmPPase4基因拟南芥T3纯合株系（(^-21、(^-37、(^-42)及野生型（訂） 拟南芥种子，灭菌后分别点播于含有125mM、150mM NaCl的MS固体培养基上，4°C春化3天，将 培养皿置于培养室，16h光/8h暗条件下垂直培养，过表达基因ZmPPase4植株在含有125mM、 150mM NaCl的MS培养基上培养14天后。分别测量不同植株的根长及鲜重，每个转基因株系 测量10株，3次重复。结果见图4,从结果可以看出，转35S: :ZmPPase4基因拟南芥在125mM的 NaCl培养基上，WT根长只有3-4cm，过表达基因ZmPPase4的转基因株系根长为6cm，在更高浓 度（150mM)的NaCl条件下，WT根长只有2.5〇11，野生型訂在15〇1111的他(：1的1^培养基上出现白 化及萎蔫表型。正常的MS培养基上转基因株系与野生型植株无明显差异。同样，经过125mM、 150mM NaCl胁迫处理后转基因株系鲜重与WT相比具有显著差异，说明高浓度NaCl胁迫可以 严重抑制植株生长，而转基因株系具有明显的耐盐性。
[0051]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 玉米焦磷酸酶基因 ZmPPase4在提高植物抗逆性中的应用，其中基因 ZmPPase4编码蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成 的具有同等功能的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗逆性包括耐盐碱性。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥。4. 根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过在植物中过表达基因 ZmPPase4的⑶S序列，从而提高转基因植株抗逆性。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，提取玉米总RNA，反转录成cDNA，依据目的 基因 ZmPPase4的序列，设计PCR扩增引物，从玉米cDNA扩增出如SEQ ID No . 2所示的基因 ZmPPase4的CDS序列，并将所述CDS序列构建到植物表达载体上，转化植物，筛选转基因植 株。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过Gateway技术将所述CDS序列构建到植 物表达载体上，具体方法如下：将所述CDS序列连接至入门载体pGWC上，得到的重组载体 pGWC_ZmPPase4与载体pEarleyGate202进行LR反应，即得重组表达载体pEarleyGate202_ ZmPPase4，并用pEar leyGate202_ZmPPase4 转化植物。7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR扩增所用引物为： 正向引物F 5 ' -ATGGCGCCCGCTGTAGAAG-3 ' 反向引物R 5 ' -CTACCTCCTCAGGCCCTCAAC-3 '。8. 根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，采用农杆菌介导的方法转化植 物。9. 根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，利用草铵膦筛选转基因植株。10. 玉米焦磷酸酶基因 ZmPPase4，其特征在于，基因 ZmPPase4的⑶S序列为： i) SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID No.2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。
【文档编号】C12N15/82GK105821017SQ201610200926
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】郑军, 陈勋基, 焦珍珍, 王国英
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所