一种特异性的l-丝氨酸适配体及其用图

一种特异性的l-丝氨酸适配体及其用图
【专利摘要】本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种特异性的L?丝氨酸适配体及其用途。本发明公开了一种特异性的L?丝氨酸核酸适配体，其为(a)包含选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的适配体；(b)包含选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列的适配体，其中一个或数个核苷酸被替换、缺失、插入或添加；或(c)选自下列的缀合物：上述适配体(a)的多缀合物、上述适配体(b)的多缀合物、以及上述适配体(a)和(b)的多缀合物，其中a或b的核苷酸序列中胸腺嘧啶可替换为尿嘧啶。本发明的适配体或复合物可用作诸如诊断试剂的试剂，用L?丝氨酸相关的疾病。本发明的适配体或复合物还可用于纯化和浓缩L?丝氨酸、标记L?丝氨酸，以及检测和定量L?丝氨酸。
【专利说明】
一种特异性的L-丝氨酸适配体及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于检测技术领域，具体涉及一种特异性的L-丝氨酸适配体及其用途。
【背景技术】
[0002] L-丝氨酸是人体非必须氨基酸，主要来自体内自身合成或外源摄入。多种研究表 明，在发生胃癌时，患者的肿瘤组织、血液中L-丝氨酸的含量显著升高。而中国专利申请 CN201310556941.9公开了，胃癌患者尿液中L-丝氨酸含量显著高于健康对照。这些都表明， L-丝氨酸有望作为胃癌尿液中的肿瘤标志物加以检测。
[0003] 由于L-丝氨酸检测常用仪器如GC-MS、LC-MS、匪R共振等属于分析化学的大型仪 器，难以应用于临床实践中。因此，急需一种临床简便易行的L-丝氨酸检测方法。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的在于提供一种特异性的L-丝氨酸适配体及其用途，以便于检测。
[0005] -种特异性的L-丝氨酸适配体，其为
[0006] (a)包含选自SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的适配体；
[0007] (b)包含选自SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的适配体，其中一个或数个核苷酸被替 换、缺失、插入或添加;或
[0008] (c)选自下列的缀合物：上述适配体(a)的多缀合物、上述适配体(b)的多缀合物、 以及上述适配体(a)和(b)的多缀合物；
[0009] 其中a或b的核苷酸序列中胸腺嘧啶可替换为尿嘧啶。
[0010] 进一步地，所述a或b或c的核苷酸序列中各啼啶核苷酸的核糖的2'位是相同的或 不同的，并且是氟原子或被选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代，和各嘌呤核苷酸 的核糖的2'位是相同的或不同的，并且是羟基或被选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或 基团取代。
[0011] 进一步地，所述a或b或c中任一项描述的适配体，其中所述适配体中包含的核苷酸 是被修饰的。
[0012] 另一方面，本发明还公开了包含a或b或c中任一项描述的适配体和功能性物质的 复合物；
[0013] 进一步地，所述复合物，其中所述功能性物质是亲和性物质、标记物、酶、药物递送 介质或药物；
[0014] 另一方面，本发明还公开了包含a或b或c中任一项描述的适配体或者所述复合物 的诊断试剂；
[0015] 另一方面，本发明还公开了包含a或b或c中任一项描述的适配体或者所述复合物 的L-丝氨酸检测探针；
[0016] 另一方面，本发明还公开了包含a或b或c中任一项描述的适配体或者所述的复合 物的用于纯化L-丝氨酸的固相载体；
[0017] 另一方面，本发明还公开了检测L-丝氨酸的方法，该方法包括a或b或c中任一项描 述的适配体或者所述的复合物;和
[0018] 纯化L-丝氨酸的方法，该方法包括使用a或b或c中任一项描述的适配体或者所述 的复合物。
[0019] 本发明的适配体或复合物可用作诸如诊断试剂的试剂，如诊断L-丝氨酸相关的疾 病。本发明的适配体或复合物还可用于纯化和浓缩L-丝氨酸、标记L-丝氨酸，以及检测和定 量L-丝氨酸。
【附图说明】
[0020] 图1. L-丝氨酸和超顺磁性聚多巴胺磁珠偶联模式图。
[0021]图2.偶联L-丝氨酸的超顺磁性聚多巴胺磁珠的扫描电镜图。
[0022]图3.适配体二级结构预测图。
[0023]图4.亲和实验测定适配体和L-丝氨酸磁珠亲和力。柱子高度代表结合在L-丝氨酸 磁珠上的适配体摩尔数。
[0024]图5.核酸适配体apt-4亲和洗脱试验。横坐标为用于洗脱apt-4-L-丝氨酸复合物 的溶液，纵坐标为洗脱下来的apt-4摩尔数，其中1:L-丝氨酸、2:D-丝氨酸、3:L-丙氨酸、4: 甘氨酸、5: L-脯氨酸、6: L-苏氨酸、7 : L-酪氨酸、8: L-异亮氨酸、9: L-甲硫氨酸、10: L-缬氨 酸、11 :L-色氨酸、12:对羟基苯甲酸、13:马尿酸、15:乙酰丙酸，此外14:BSA、15:空白对照。
【具体实施方式】
[0025]适配体是指具有对于特定靶分子的结合亲和性的核酸分子。适配体还可以通过与 特定靶分子结合而抑制特定靶分子的活性。本发明的适配体可以是RNA、DNA、修饰的核酸或 它们的混合物。本发明的适配体还可以是直链状或环状的形态。
[0026]本发明的适配体优选为L-丝氨酸结合的适配体，其序列SEQ ID N0:1、2或5,并且 具有使用MF0LD程序或RNA structure5.6软件所预测的相同的二级结构(见图3)。
[0027]本发明的适配体的长度没有特别限制，通常可以是大约10至大约200个核苷酸，可 以是例如，不超过大约100个核苷酸，优选不超过大约50个核苷酸，更优选不超过大约40个 核苷酸，最优选不超过大约35个核苷酸。当核苷酸的总数目较小时，化学合成和大量生产将 较容易，就成本而言具有较大的优势。还考虑到化学修饰容易。
[0028] 本发明的适配体中包含的各核苷酸是相同的或不同的，并且可以是在核糖（例如 嘧啶核苷酸的核糖，嘌呤核苷酸的核糖）的2'位包含羟基的核苷酸（即，非取代的核苷酸）， 或者，通过任意原子或基团在核糖的2'位进行取代(修饰）的核苷酸(在本发明中有时称作 "取代的核苷酸"或"修饰的核苷酸"）。
[0029] 任意此类原子或基团的实例，可以提及被氢原子、氟原子或者-0-烷基(例如-0-甲 基）、-〇-酰基(例如-0-CH0基团）、氨基(例如-NH2基团）取代的核苷酸。本发明的适配体还可 以是修饰的核苷酸，其中至少一种(例如1、2、3或4种)核苷酸包括在核糖的2 '位的羟基，或 上述的任意原子或基团，例如，选自氢原子、氟原子、羟基和-0-甲基的至少两种(例如，2、3 或4种)基团。
[0030] 在本发明的适配体中，所有的嘧啶核苷酸是相同的或不同的，每个可以是在核糖 的2 '位被氟原子取代的核苷酸，或在核糖的2 '位被上述任意原子或基团（优选选自氢原子、 羟基和甲氧基的原子或基团）取代的核苷酸。
[0031] 在本发明的适配体中，所有的嘌呤核苷酸是相同的或不同的，每个可以是在核糖 的2 '位被羟基取代的核苷酸，或者在核糖的2 '位被上述任意原子或基团（优选选自氢原子、 甲氧基和氟原子的原子或基团）取代的核苷酸。
[0032] 本发明的适配体还可以是这样的适配体，其中所有的核苷酸在核糖的2'位都包含 羟基，或上述任意原子或基团，例如，选自氢原子、氟原子、羟基和-〇-甲基的相同基团。 [0033]本发明的适配体还可以具有"能够特异性结合L-丝氨酸"的特征。
[0034]本发明的适配体还可以是：
[0035] (a)包含选自SEQ ID N0:1、2或5的核苷酸序列(条件是胸腺嘧啶可以是尿嘧啶）的 适配体；
[0036] (b)包含选自SEQ ID N0:1、2或5的核苷酸序列(条件是胸腺嘧啶可以是尿嘧啶）的 适配体，其中一个或数个核苷酸被替换、缺失、插入或添加;或
[0037] (c)选自下列的缀合物：上述适配体(a)的多缀合物、上述适配体(b)的多缀合物、 以及上述适配体(a)和(b)的多缀合物。
[0038]上述(a)至(c)中优选的是这样的(a)至(c)，其中选自SEQ ID N0:1、2或5的核苷酸 序列。
[0039] 在上述(b)中，对于替换、缺失、插入或添加的核苷酸的数目没有限制。核苷酸的数 目可以是例如，不超过大约30个，优选不超过大约20个，更优选不超过大约10个，更优选不 超过大约5个，最优选为4、3、2或1个。
[0040] 在上述(c)中，可以通过串联结合达到缀合。在缀合时可以使用连接体。作为连接 体，有核苷酸链（例如1至大约20个核苷酸）和非核苷酸链（例如-(CH2 )n-连接体、-(CH2CH20) n-连接体、六甘醇连接体、TEG连接体、含肽的连接体、含-S-S-键的连接体、含_ C0NH-键的连接体、含-0P03-键的连接体）。上述多缀合物中提及的多个没有特别限制，只要 其是2个以上，例如可以是2、3或4个。
[0041] 上述(a)至（c)的各核苷酸，不论是相同还是不同，可以是在核糖（例如，嘧啶核苷 酸的核糖）的2'位包含羟基的核苷酸，或者在核糖的2'位被任意基团（例如氢原子、氟原子 或-〇-甲基)取代的核苷酸。
[0042] 例如，本发明的适配体可以是这样的适配体，其中上述(a)至（c)中包含的核苷酸 是这样的：
[0043] (i)各嘧啶核苷酸的核糖的2'位是相同的或不同的，并且被氟原子取代，或被任意 上述原子或基团、优选选自氢原子、羟基和甲氧基的原子或基团取代;和
[0044] (ii)各嘌呤核苷酸的核糖的2'位是相同的或不同的，并且被羟基取代，或被任意 上述原子或基团、优选选自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代。本发明还提供了上 述适配体。
[0045] 本发明的适配体可以是这样的适配体，其中每个核苷酸的糖残基(例如核糖)被修 饰，糖残基中被修饰的实例有:糖残基的2'位、3'位和/或4'位的氧原子替换为另一种原子 等等。作为修饰的种类有:氟化、〇-烷基化(例如〇-甲基化、〇-乙基化）、〇_芳基化、S-烷基化 (例如S-甲基化、S-乙基化）、S-芳基化、胺化(例如-NH2)。可以通过本身已知的方法进行糖 残基中的此类改变（参见，例如Sproat 等人，（1991 )Nucl .Ac id .Res ? 19,733-738; Cotton 等 人，（1991 )Nucl. Acid .Res. 19,2629-2635 ;Hobbs 等人，（1973)Biochemistry 12，5138-5145)〇
[0046] 本发明的适配体还可以具有改变的（例如化学替换)核酸碱基(例如嘌呤或嘧啶）， 此类改变的实例有：5_位的嘧啶改变、6-和/或8-位的嘌呤改变、用环外胺（extracyclic amine)的改变、用4-硫尿苷的替换、用5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的替换。本发明的适配体中 包含的磷酸基团（phosphate group)可以改变以赋予对核酸酶和水解的抗性。例如P (0) 0基 团可以用 P(〇)S(硫代酯（thioate))、P(S)S(二硫代酯）、P(0)NR2(酰胺化物）、P(0)R、R(0) OR'、⑶或CH2 (甲缩醛(f ormaceta 1))或3 ' -胺(-NH-CH2-CH2-)替换[其中每个R或R'单元独 立地是H或者是取代或非取代的烷基(例如甲基、乙基）]。
[0047] 连接基团是例如-0-、-N_或-S-，并且核苷酸可以通过这些连接基团结合至相邻的 核苷酸。
[0048] 改变还可以包括这样的改变:例如在3 '和5 '加帽。
[0049]改变还可以通过进一步向末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dT、核酸、核苷、十 四酰、石胆酸-油烯基(1^1：110(3〇1；[(3-01671)、二十二酰((10(30831171)、月桂酰、硬脂酰、棕榈 酰、油酰、亚油酰（linoleoyl)、其它脂质、留族化合物、胆固醇、咖啡因、维生素、色素、荧光 物质、抗癌剂、毒素、酶、放射活性物质、生物素等来进行。对于此类改变，参见例如美国专利 5,660,985和5,756,703。
[0050]本发明的适配体可以按照本说明书中的公开和本领域中本身已知的方法化学合 成。适配体与靶分子结合的方式是多种多样的，例如基于磷酸基团的负电荷的离子键、基于 核糖的疏水键和氢键、基于核酸碱基的氢键和堆积相互作用（stacking interaction)。特 别地，基于磷酸基团的负电荷的离子键(其以与构成核苷酸的数目相同的数目存在)是较强 的，并且与存在于蛋白质表面的赖氨酸和精氨酸的正电荷结合。因此，不参与直接与靶分子 结合的核酸碱基可以被替换。特别地，由于主干(stem)结构的部分已经形成碱基对并且朝 向双螺旋结构的内侧，所以核酸碱基不可能直接与靶分子结合。因此，即使碱基对被替换为 另一碱基对，适配体的活性通常也不会降低。在其中不形成碱基对的结构中（例如环结构）， 只要核酸碱基不参与直接与靶分子的结合，就可能进行碱基替换。关于核糖的2'位的修饰， 核糖的2'位的官能团甚少直接与靶分子相互作用，但是在很多情况下，其没有相关性，可以 被另一种修饰的分子替换。因此，除非参与直接与靶分子结合的官能团被替换或删除，否则 适配体通常会保持其活性。另外，重要的是，整体的立体结构不会发生巨大改变。
[0051 ] 可以使用SELEX方法或其改进形式FluMag-SELEX法（例如，El 1 ington等人，（1990) Nature，346，818-822; Tuerk等人，（1990)Science，249，505-510)来制备适配体。在SELEX方 法中，通过增加轮次(round)的数目或使用竞争性物质，对于靶分子显示出更强结合力的适 配体被浓缩并被选择。因此，通过调节SELEX的轮次的数目和/或改变竞争状态，可以在一些 情况下获得具有不同结合力的适配体、具有不同结合形态的适配体、具有相同结合力或结 合形态但是具有不同碱基序列的适配体。SELEX方法包括通过PCR进行扩增的过程;在该过 程中通过使用锰离子等引起突变，从而可以进行具有丰富的多样性的SELEX。
[0052] 适配体由于可化学合成因而容易改变。对于适配体而言，通过使用MF0LD程序来预 测二级结构，或者通过使用X射线分析或NMR分析来预测立体结构，从而可以在一定程度上 预测哪些核苷酸可以被替换或缺失，以及在哪里可以插入新的核苷酸。可以容易地化学合 成具有新序列的预测的适配体，并且可以使用现有的测定系统来确认该适配体是否保持活 性。
[0053]如果通过重复如上所述的尝试误差法鉴定出对于获得的适配体与靶分子结合具 有重要意义的区域，则活性在很多情况下保持不变，即使向其序列两端添加新的序列。新序 列的长度没有特别限制。
[0054]关于修饰，与序列同样可以进行众多设计或改变。
[0055] 如上所述，适配体可以进行众多设计或改变。本发明还提供了制备适配体的方法， 其能够对包含特定序列（例如，与选自主干区域、内环区、发夹环区和单链区的部分对应的 序列:如有需要，以下简称为固定序列）的适配体进行众多的设计或改变。
[0056] 例如，此类适配体的制备方法包括制备包含固定序列的适配体:通过使用如下所 示的核苷酸序列组成的单一种类的核酸分子:-(N)a_固定序列-(N)b_[其中(N)a代表由"a" 个N的单元组成的核苷酸链；（N)b代表由"b"个N的单元组成的核苷酸链;N的单元中的每一 个，无论相同或不同，是选自A、G、C、U和T(优选A、G、C和U)的核苷酸。每个"a"和"b"，无论相 同或不同，可以是任何数字，并且可以是例如1至大约100,优选1至大约50,更优选1至大约 30,进一步优选1至大约20或1至大约10]，或多个种类的核酸分子(例如，a、b数目不同的核 酸分子库等），以及分别对应于引物序列（i)和(ii)的引物对。
[0057] 本发明还提供了包含本发明的适配体和与其结合的功能性物质的复合物。在本发 明的复合物中，适配体与功能性物质之间的结合可以是共价键或非共价键。本发明的复合 物可以是这样的复合物，其中本发明的适配体与一个或多个(例如2或3个)相同种类或不同 种类的功能性物质结合在一起。所述功能性物质没有特别限制，只要其另外赋予本发明的 适配体一定的功能，或者能够改变(例如改善)本发明的适配体可以具有的某些特性。所述 功能性物质的实例有:蛋白、肽、氨基酸、脂质、糖、单糖、多核苷酸和核苷酸。所述功能性物 质的实例有:亲和性物质（例如生物素、链霉亲和素、对于靶互补序列具有亲和性的多核苷 酸、抗体、谷胱甘肽琼脂糖、组氨酸）、标记用物质（例如，荧光物质、发光物质、放射性同位 素）、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）、药物递送介质（例如，脂质体、微球体、肽、聚 乙二醇类）、药物（例如，用于导弹疗法(missile therapy)的那些药物，例如刺孢霉素和倍 癌霉素;氮芥类似物，例如环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、异环磷酰胺或曲磷胺;氮丙啶，例如噻 替派;亚硝基尿，例如卡莫司汀；烷基化试剂，例如替莫唑胺或达卡巴嗪；叶酸样代谢拮抗 剂，例如甲氨蝶呤或雷替曲塞;嘌呤类似物，例如硫代鸟嘌呤、克拉屈滨或氟达拉滨;嘧啶类 似物，例如氟尿嘧啶、替加氟或吉西他滨；长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱或长春瑞 滨，及其类似物;鬼白毒素衍生物，例如依托泊苷、紫杉烷、多西紫杉醇或紫杉醇;蒽环类，例 如多柔比星、表柔比星、伊达比星和米托蒽醌，及其类似物;其它细胞毒性抗生素，例如博莱 霉素、丝裂霉素；铂化合物，例如顺铂、卡铂和奥沙利铂;喷司他丁、米替福新、雌莫司汀、拓 扑替康、伊立替康和比卡鲁胺），和毒素(例如篦麻蛋白毒素、liatoxin和Vero毒素）。在一些 情况下，这些功能性分子最后被除掉。此外，分子可以是可被酶识别并切割的肽，所述酶例 如凝血酶、基质金属蛋白酶(MMP)和因子X，并且可以是可被核酸酶或限制酶切割的多核苷 酸。
[0058] 本发明还提供了其中固定了本发明的适配体或复合物的固相载体。固相载体的实 例有:基板、树脂、平板(例如多孔平板）、滤器、药筒、柱、多孔材料。基板可以是用于DNA芯 片、蛋白质芯片等中的那些;例如，镍-PTFE(聚四氟乙烯)基板、玻璃基板、磷灰石基板、硅基 板、氧化铝基板等，以及通过使用聚合物等包覆这些基板而制备的基板。树脂的实例有:琼 脂糖颗粒、二氧化硅颗粒、丙烯酰胺与N，N'_亚甲基双丙烯酰胺的共聚物、聚苯乙烯交联的 二乙烯基苯颗粒、使用表氯醇交联的葡聚糖颗粒、纤维素纤维、芳基葡聚糖与N，N'_亚甲基 双丙烯酰胺的交联聚合物、单分散系的合成聚合物、单分散系的亲水性聚合物、琼脂糖 (Sepharose)、Toyopearl等，还包括通过将各种官能团结合至这些树脂而制备的树脂。本发 明的固相载体可用于例如L-丝氨酸的纯化、检测和定量。
[0059]可以通过本身已知的方法将本发明的适配体或复合物固定到固相载体上。例如， 有一种方法是，将亲和性物质(例如上述的那些)或预先确定的官能团导入本发明的适配体 或复合物，然后利用所述亲和性物质或预先确定的官能团将所述适配体或复合物固定在固 相载体上。本发明也提供了这样的方法。预先确定的官能团可以是能够进行偶联反应的官 能团；例如，氨基、疏基、羟基和羧基。本发明还提供了其中导入了此类官能团的适配体。
[0060] 本发明的适配体或复合物还可以用作检测探针，特别是用于检测L-丝氨酸的探 针。标记适配体的方法没有特别限制，可以应用本身已知的方法。此类方法包括例如，使用 放射性同位素进行标记、使用荧光色素或荧光蛋白进行标记，等等。
[0061] 本发明还提供了检测和定量L-丝氨酸的方法。特别地，本发明可以将L-丝氨酸与 其它家族蛋白区别开并检测及定量。本发明的检测和定量方法可以包括，使用本发明的适 配体(例如，通过使用本发明的复合物和固相载体)来测定L-丝氨酸。可以通过与免疫学方 法相同的方式进行检测和定量L-丝氨酸的方法，不同之处在于，使用本发明的适配体，而非 使用抗体。因此，通过使用本发明的适配体(代替抗体)作为探针，通过与酶免疫测定(EIA) (例如，直接竞争性ELISA、间接竞争性ELISA、夹心式ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫 测定(FIA)，Western印迹法（例如在Western印迹法中用以代替二抗）、免疫组织化学染色 法、细胞分选法等方法相同的方式可以进行检测和定量。这些方法可用于例如，测定生物体 或生物样品中的L-丝氨酸的量，以及用于诊断与L-丝氨酸相关的疾病。
[0062] 本文提及的所有公开物中的公开内容，包括专利和专利申请说明书，通过引用并 入本发明，达到明文记载所有这些公开物的程度。
[0063] 以下通过下面的实施例更详细地描述本发明，但是，这些实施例并不限制本发明 的范围。
[0064]材料与方法 [0065] 1实验试剂
[0066] (1)单链寡聚核苷酸文库：包括未修饰的引物及荧光材料FAM和Biotion修饰的引 物，均由上海生工公司合成。使用前，用双蒸水充分溶解，配制成1 OuM的工作液，-20 °C保存。
[0067] (2)磁珠分选系统Umacs及亲和素包被顺磁性磁珠:购买自美天妮公司，-4 °C保存。
[0068] (3)D-Hank's平衡盐溶液：准确称量NaCl 8g，KCl 0.4g，NaHC03 0.35g， Na2HP04.12H20 0.12g，KH2P04 0.06g，容量瓶定容至 1000mL，调节PH值为7.2-7.4.
[0069] (4)结合缓冲液:D-Hank's溶液中加入0.5mM MgC12。
[0070] (5)洗脱缓冲液：25mM Tris-HCl，10mM EDTA，3.5M urea，PH 8.0〇
[0071] (6)L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-异 亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸均为标准品，购买自国药集团化学试剂有限公司；马尿酸、乙 酰丙酸、对羟基苯甲酸均为分析纯，购买自百灵威科技;BSA为生化试剂，购买自国药集团化 学试剂有限公司。
[0072] 2实验仪器
[0073] 多功能酶标仪Safire 2型（瑞士Tecan公司）
[0074] SIM-F123型制冰机（日本SANYO公司）
[0075]恒温水浴箱(上海医疗器械厂）
[0076] Tanon5500图像分析系统
[0077] 全光谱微孔板分光光度计(Ep〇Ch，BiTeCh，USA)
[0078] _80°C低温冰箱（美国Thermo Forma公司）
[0079] -20°C冰箱（美国Thermo Forma公司）
[0080] 纯水器(Mili-Q50型Millipore公司，美国）
[0081 ] 2yL，20yL，200yL，1000yL微量移液器(Gi 1 son公司，法国）
[0082]以下通过实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步说明。
[0083]实施例1 :L_丝氨酸和超顺磁性聚多巴胺磁珠的偶联
[0084] 氨基酸分子和顺磁性磁珠的偶联由英芮成公司（Enriching)完成。偶联的机理是 聚多巴胺表面的邻苯二酚和邻苯二醌之间存在一个化学平衡，在弱碱性环境下，聚多巴胺 表面邻苯二醌能够和丝氨酸的伯胺形成稳定的碳氮键，拉动化学平衡向右移动，从而实现 L-丝氨酸和超顺磁性聚多巴胺磁珠的结合(图1)。
[0085]扫描电镜检测，如图2所示，图A为未结合L-丝氨酸的空白磁珠。图B为结合L-丝氨 酸小分子的磁珠，箭头所指为L-丝氨酸分子，可以发现L-丝氨已经结合到顺磁性磁珠上。 [0086]同时，采用红外光谱仪检测磁珠(Fe304)、包裹聚多巴胺磁珠(Fe304@PDA)、结合L-丝氨酸的聚多巴胺磁珠(Fe304@PDA@S erine)，发现结合L-丝氨酸的聚多巴胺磁珠磁珠由于 脂肪胺C-N单键的存在而在波长1080处出现一个明显的锋(箭头所指），表明丝氨酸已经成 功连接到磁珠上，最后溶解于D-Hank' s缓冲液中4°C保存。
[0087]为了减少非特异性结合，我们用同样方法制备了甘氨酸磁珠用于负筛选。
[0088]实施例2: L-丝氨酸核酸适配体的筛选 [0089] 1.初始随机DNA文库的构建
[0090] 起始随机文库为含有91个碱基的lOnmol单链DNA(ssDNA)文库，经由HPLC纯化(上 海生工），中间45个随机序列，两边为固定引物序列，5'-AACCG CCCAA ATCCC TAAGA GTC(N) 45CACAG ACACA CTACA CACGC ACA-3.FAM修饰引物5'-CY3-AACCG CCCAA ATCCC TAAGA GTC-3'和Biotin修饰引物5'-Biotin-TGTGC GTGTG TAGTG TGTCT GTG-3用于PCR扩增双标 记的ssDNA分子。
[0091] 2.核酸适配体的筛选过程
[0092] L-丝氨酸和超顺磁性聚多巴胺磁珠（简称L-丝氨酸磁珠或正筛磁珠)在筛选前首 先用100yL结合缓冲液清洗2次。lOOpmol随机ssDNA文库(首轮lOnmol)在200yL结合缓冲液 中95°C变性5min，冰浴10min，常温放置5min。筛选时，首先将随机ssDNA文库和甘氨酸磁珠 (反筛磁珠)孵育，收集未结合到磁珠上的ssDNA并和L-丝氨酸磁珠孵育。随后用结合缓冲液 清洗磁珠，接着以2 0 0 y L洗脱缓冲液9 5 °C 10 m i n洗脱结合到磁珠上的s s D N A，并利用 Safire2.0酶标仪检测其荧光强度，激发波485nm，吸收波538nm。将收集到的ssDNA乙醇沉 淀，并重新重悬于超纯水中，作为PCR反应的模板，以FAM修饰上游引物和Motion修饰下游 引物进行PCR扩增.扩增产物分选出单链DNA作为下一轮筛选的次级文库。随着筛选过程的 进行，为了增加筛选的强度，洗脱的时间（从1到3minut es)、洗脱液体积(从100此到200此）、 洗脱次数(从1次到4次）、反筛磁珠量(从0到8mg)逐渐增加，而正筛磁珠用量(从1 Omg到3mg) 逐渐递减(表1)。
[0093] 表1. SELEX筛选过程中筛选条件的变化。
[0095] 3.文库的PCR扩增
[0096]取含有单链DNA 0. lyg的上清液作为模板，配制如下PCR反应体系：模板0 . lyg， DNAmix25yL，FAM修饰上游引物2yL，Biot ion修饰下游引物2yL，加灭菌水至50yL。
[0097] PCR反应条件:95°C加热预变性5min后，95°C变性3〇8,62°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8， 35个循环，72°C延伸10min，4°C保温至结束。Tm设定为62°C。2.5 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增 结果。
[0098] 4.分选次级文库
[0099]上述DNA PCR产物为双链DNA，必须分离出单链后才能作为下一轮筛选文库。本实 验采用磁珠分选法。经过PCR后的双标记双链DNA(dsDNA)，一条链带有FAM荧光，另一条带有 Biot ion分子。带有Biot ion标记的dsDNA和亲和素包被的磁珠按照一定的比例反应15min， 0-他]11<:'8溶液洗3遍，然后加入11]1〇1凡似011变性10111；[11，将?4]\1标记的880嫩和13;[01:;[011标记 的ssDNA分开，最后用HC1中和分离出的FAM ssDNA，该文库即用于每一轮筛选过程的监测和 下一轮适配体的筛选。
[0100] 5.克隆测序
[0101] 经过12轮筛选，得到了一组高亲和力适配体。利用无修饰引物进行PCR扩增后，切 胶纯化回收，进行克隆测序。
[0102] (1)连接:在一个标准的10L反应体系中，加入50ng pUCm-T载体、0.2pmol PCR产 物，1L 10 X ligationBuffer和lLT4DNAligase，用水补足至 10yL，16 - 23°C连接 1 一2小时。
[0103] (2)转化：1 OOiiL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。加入5L 连接液，轻轻混匀，冰上放置3〇1^11。45°(：水浴热激90s，冰上放置15-20min。随后加400此 S0C培养基，37°C200 - 250rpm振荡培养1小时。随后室温下4000rpm离心5min，用枪头吸掉 400yL上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。将细菌均匀涂布在预先用20yL 100mM IPTG和 100yL20mg/mL X-gal涂布的氨苄青霉素平板上。平板在37°C下正置1小时吸收过多的液体， 然后倒置培养过夜。
[0104] (3)选择在IPTG/X-gal平板上的白色菌落，用牙签挑至含氨苄霉素的液体培养基， 37 °C培养过夜。
[0105] (4)用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，用PstI单酶切，琼脂糖凝胶电泳检测 片段大小，确定是否含有目的片段。用M13通用引物进行测序。
[0106] 6.适配体序列的选择和结构预测
[0107] 将测序结果核酸适配体序列进行分类分析，并应用RNA structure5.6软件对测序 结果进行DNA二级结构预测分析，并计算相应的能量值G，能量负值越大表示该序列结构越 稳定。
[0108]结果：
[0109] 随着每一轮筛选的进行，结合在靶标L-丝氨酸磁珠上的SSDNA的荧光强度逐渐增 强，在第7轮筛选后达到最高峰值，随后5轮筛选则没有明显变化。表明在筛选到第7轮后，特 异性适配体即已得到富集。
[0110] 核酸适配体筛选序列的测序及二级结构预测 我们将筛选获得的核酸适配体序列70个克隆进行测序，得到21个不同的序列，拷 贝数最多的6个序列被挑选出来并用于下一步研究(表2)。利用软件RNA structure5.6软件 进行DNA二级结构预测分析，并计算相应的能量值，负值越高表明该适配体结构越稳定。6个 适配体二级结构预测图见图3,其能量负值介于5-11之间，均表现出较高的二级结构稳定 性，而又以apt-4、apt_14和apt-25二级结构稳定性更高，该组适配体用于下一步鉴定检测。 [0112] 衷2筛诜剞的话配休测序结里
[0114]实施例3:亲和实验
[0115] 4mg L-丝氨酸修饰磁珠在结合缓冲液中清洗5次。40pmol适配体溶解在200此结合 缓冲液中，90°C变性5min，随后冰浴15min，常温平衡5min。随后将准备好的适配体和清洗过 的L-丝氨酸修饰磁珠25°C摇床温育30min。反应结束后，移除未结合的适配体，用200yL结合 缓冲液5次清洗适配体-L-丝氨酸磁珠复合物。最后，结合在L-丝氨酸磁珠的适配体在200此 洗脱缓冲液中95 °C变性洗脱1 Omin，得到富集。
[0116]加入的总适配体、未结合的适配体、洗脱的适配体的荧光Safire2.0酶标仪在如下 条件下测定:激发波485nm/发射波535nm;time Is;样品体积lOOyL/孔，置于黑色96孔板中。 适配体浓度根据标准曲线进行计算。
[0117] 对6个核酸适配体和L-丝氨酸磁珠的亲和力均进行了测定，其结果如图4所示，柱 子高度代表结合在L-丝氨酸磁珠上的适配体摩尔数。其值越大表明该核酸适配体和L-丝氨 酸亲和力越强。在下图中以apt-4、apt_14和apt-25亲和力较高，而对照随机核苷酸文库则 几乎没有亲和力（图4)。
[0118] 实施例4:核酸适配体平衡解离常数(Kd值)的测定
[0119] 为了测定单个核酸适配体和靶标丝氨酸分子的亲和力，按照如上方法进行亲和实 验，但是核酸适配体的浓度在每次实验中逐渐增加（50-800nM)，而L-丝氨酸磁珠的量则固 定不变(4mg)。结合在磁珠上的核酸适配体最后热变性洗脱，并测定相应荧光。根据测定结 果及公式Y = B max X/(KD+X)计算适配体和祀标结合的KD值。
[0120] 平衡解离常数Kd表示处于平衡状态时配体和受体的解离程度，Kd越大说明解离越 多，代表受体和配体之间亲和力越弱，Kd越小说明解离越少，代表受体和配体亲和力越强。 利用GraphPad Prism 5软件中的曲线模拟功能进行非线性回归分析，将结合在L-丝氨酸磁 珠的核酸适配体荧光强度值输入软件后自动模拟曲线测得各核酸适配体的Kd值。各核酸适 配体的平衡解离常数Kd值如表3所示，可知平衡解离常数值在33.24-114.2nM之间，以适配 体apt-4值最小，表明其和祀标L-丝氨酸磁珠的结合力最强。
[0121] 表3适配体平衡解离常数测定
[0123] 实施例5:亲和洗脱法(affinity elution)测定核酸适配体结合游离L-丝氨酸分 子的特异性
[0124]在本研究中，我们筛选到了针对L-丝氨酸包被的顺磁性多聚多巴胺磁珠的特异性 核酸适配体，现在我们要验证该核酸适配体不但结合L-丝氨酸包被的顺磁性多聚多巴胺磁 珠，同时也结合溶液中游离的L-丝氨酸小分子，并且我们要验证该核酸适配体的特异性，即 该核酸适配体是否和其它小分子结合。因此我们在这边进行了亲和洗脱法来验证核酸适配 体的特异性。我们挑选Kd值最小的apt-4和13种游离小分子化合物溶液进行亲和洗脱试验， 13种小分子化合物:L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨 酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-缬氨酸、马尿酸、乙酰丙酸、对羟基苯甲酸。
[0125] 核酸适配体apt-4首先和4mg L-丝氨酸磁珠25°C结合反应30min，随后结合缓冲液 清洗。接着将核酸适配体-L-丝氨酸磁珠复合物分别和含有5mM游离小分子的200此结合缓 冲液25°C下孵育15min。磁性分离含有洗脱适配体的上清液(affinity elution)。随后L-丝 氨酸磁珠用lOOul X 2次结合缓冲液清洗，并收集清洗液(washing pool)。最后，结合在L-丝 氨酸磁珠上的剩余适配体95°C下热变性lOmin洗脱(heat elution)。测定每部分洗脱液 (affinity elution,washing pool,heat elution)的焚光强度，并根据标准曲线计算对应 浓度。
[0126] 结果表明，L-丝氨酸小分子能够较强地将L-丝氨酸磁珠上的适配体apt-4洗脱，而 其它小分子溶液洗脱能力较弱。图5表明该apt-4能以较高的特异性结合游离的L-丝氨酸小 分子，而对其它小分子的结合力则较弱。
[0127] 本研究中，我们采用FluMag-SELEX法进行核酸适配体的筛选，筛选了一组6个特异 性核酸适配体，其和靶标结合的平衡解离常数KD值介于33.24 - 203.4nmol/L，展现出良好 的亲和力，该适配体不仅能结合L-丝氨酸包被的顺磁性磁珠，尚能特异性结合游离的L-丝 氨酸小分子。而和其它小分子的亲和力弱，这些核酸适配体探针有望用于后续胃癌患者尿 液L-丝氨酸分子的检测，进而应用于临床诊断。 说明书序列表 <110>上海航富医疗科技有限公司 <120> -种特异性的L-丝氨酸适配体及其用途 <130>说明书序列表 <160> 5 <170> Patcnlln version 3.3 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> ariiilcial scqucnc <220> <223> ariiilcial scqucnc <400〉 1
[0128] acgcatitgl gtcgllggcg lallgccgla aacgtaclag ctgla 45 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> artiiicial scquenc <223> ariiilcial scqucric <400^ 2 igggacaaca Icagacaggi cgiUgatgt cagallggcc aggie 45 <210> 3 <21卜--45 <212> DNA. <213> artillcial scqucnc <223> artificial sequent；. <400> 3 gaiagtgtca gagcgccttg glgagaaaga ttcaectccg geata 45 <2:10> 4 <211> 45 <212> DNA <213> arlillciai sequenc <223> artificial sequenc:
[0129] <4〇0> 4 laccgccgcg gctacgglga aiggiactic gcgcggtigc ccgla 45: <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> arlillciai scqucnc <223〉 artificial sequenc <400> S cigatgiacc gtggetgcaa agccgctcgt gaatttcgtt tccgt 45
【主权项】
1. 一种特异性的L-丝氨酸适配体，其为下列之一 (a) 包含选自SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的适配体； (b) 包含选自SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的适配体，其中一个或数个核苷酸被替换、缺 失、插入或添加;或 (c) 选自下列的缀合物：上述适配体(a)的多缀合物、上述适配体(b)的多缀合物、以及 上述适配体(a)和(b)的多缀合物 其中a或b的核苷酸序列中胸腺嘧啶可替换为尿嘧啶。2. 如权利要求1所述的L-丝氨酸适配体，其特征在于所述a或b或c的核苷酸序列中各嘧 啶核苷酸的核糖的2'位是相同的或不同的，并且是氟原子或被选自氢原子、羟基和甲氧基 的原子或基团取代，和各嘌呤核苷酸的核糖的2'位是相同的或不同的，并且是羟基或被选 自氢原子、甲氧基和氟原子的原子或基团取代。3. 如权利要求1所述的L-丝氨酸适配体，其特征在于所述a或b或c中任一项描述的适配 体，其中所述适配体中包含的核苷酸是被修饰的。4. 一种包含权利要求1所述L-丝氨酸适配体中任一项描述的适配体和功能性物质的复 合物。5. 如权利要求4所述的复合物，其特征在于所述功能性物质是亲和性物质、标记物、酶、 药物递送介质或药物。6. 用于诊断L-丝氨酸相关疾病的试剂，所述试剂包含权利要求1所述适配体或权利要 求4所述的复合物。7. 包含权利要求1所述适配体或权利要求4所述复合物的L-丝氨酸检测探针。8. 包含权利要求1所述适配体或权利要求4所述复合物的用于纯化L-丝氨酸的固相载 体。9. 检测L-丝氨酸的方法，该方法包括使用包含权利要求1所述适配体或权利要求4所述 复合物。10. 纯化L-丝氨酸的方法，该方法包括使用包含权利要求1所述适配体或权利要求4所 述复合物。
【文档编号】C07C227/40GK105821046SQ201610349650
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】张汇若, 韩飞
【申请人】上海敬元投资有限公司