一种提升安全性、用于表达密码子优化的Anti-MART-1 TCR基因的慢病毒载体的制备及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种提升了安全性，表达密码子优化的Anti?MART?1 TCR基因的慢病毒载体制备及其应用。该载体的安全性通过将原慢病毒载体的WPRE元件替换成OPRE元件实现，该元件的序列如SEQ ID No.:1所示，并于载体多克隆位点处插入密码子优化的Anti?MART?1 TCR核苷酸序列，序列如SEQ ID No.:2所示。OPRE元件对慢病毒的转染效率和包装滴度与WPRE相比均无显著影响；密码子优化后的Anti?MART?1 TCR基因与野生型基因的同源性为79%，在T细胞基因修饰中能显著提升Anti?MART?1 TCR的表达水平；经过基因修饰表达Anti?MART?1 TCR的T细胞与黑色素瘤细胞株共培养后，其IFN?γ的分泌水平也显著提高；该T细胞还能显著延长植入了黑色素瘤的荷瘤小鼠的生存时间，抑制黑色素瘤的增长。改造所得到的pRRLSIN.cPPT.MSCV?CoAnti?MART?1/GFP.OPRE载体可用于细胞治疗中TCR?T细胞的构建等用途。
【专利说明】
一种提升安全性、用于表达密码子优化的Ant i-MART-1 TCR基 因的慢病毒载体的制备及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因治疗和细胞治疗领域，具体地涉及一种提升安全性，用于表达密 码子优化的Anti-MART-1 TCR基因的慢病毒载体及其应用。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是是一种能产生黑色素的高度恶性肿瘤，多见于30岁以上成年人，常发 生于皮肤、粘膜和内脏器官。黑色素瘤在中国的发病率虽然低，但其恶性度高，转移发生早， 且预后多数较差，晚期可有淋巴道及血液转移，死亡率高，因此早诊断和早治疗非常重要。
[0003] 对黑色素瘤的治疗，除传统的手术、放疗和化疗之外，细胞治疗也是一种重要手 段。目前，国内针对黑色素瘤的细胞治疗方法主要包括CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和TIL(肿 瘤浸润淋巴细胞），但都存在一些问题:虽然CTL本身具有很好的靶向杀伤黑色素瘤的作用， 但其较难扩增的特性使其在黑色素瘤的治疗过程中很难发挥出色的效果;TIL是从黑色素 瘤组织中分离出的带有抗黑色素瘤活性的淋巴细胞，具有很好的杀伤黑色素瘤的活性以及 较好的扩增性，使其拥有较好的治疗效果;但TIL需要从病人经手术切除的黑色素瘤组织中 分离获取，而分离过程相对复杂，因此该方法的使用也受到了诸多限制。
[0004] 2013年《Science》杂志评选出了十大科技突破，其中肿瘤的免疫治疗就是十大突 破之首，其包括的TCR-T技术将靶向肿瘤细胞表面表位的T细胞受体通过基因工程手段导入 到T细胞中，促使这些T细胞与肿瘤细胞结合并对其进行杀伤。Anti-MART-1 TCR是最早用于 抗黑色素瘤的TCR之一，其靶向黑色素瘤相关抗原MART-1:27-35表位氨基酸序列，且与黑色 素瘤细胞有很好的亲和力（Johnson,Heemskerk et al.2006)〇
[0005] 将Anti-MART-1 TCR导入到T细胞中的基因工程手段以选用慢病毒居多。慢病毒可 以将外源DNA片段有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感 染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、 干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转导的细胞，如原 代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的DNA片段的转导效率， 能将目的DNA片段整合到宿主细胞基因组，可以方便快捷地实现目的DNA片段的长期、稳定 表达。
[0006] 目前主流的慢病毒载体均为自身失活型（SIN，Self-InaCtivati〇n)慢病毒载体， 其包含的元件主要有5'和3'LTR(长末端重复序列）、RRE(Rev响应元件）、cPPT(多聚嘌呤通 道序列）、启动子、筛选标记、WPRE等。其中WPRE元件（Woodchuck hepatitis Posttranscriptional Regulatory Element)的全称为土拨鼠肝炎转录后调控元件，常见 于目前主流的慢病毒载体，可促进终止基因转录；同时可以促进转录物出核，还可以通过上 调初级转录物的多聚腺苷化，从而稳定胞内mRNA总量，最终提高转移基因的表达效率，具有 重要的作用。据发明人分析，WPRE基因序列当中存在一些潜在的启动子，可能会导致其下游 的X蛋白片段序列（部分)表达，导致某些潜在致癌可能性的基因表达，其结构如图1所示。 Patel等将荧光素酶报告基因融合到该X蛋白的表达框并转导细胞后，在细胞内检测到荧光 素酶的活性(Patel and 01sen2005)，这足以说明WPRE中所带的部分X蛋白序列会在细胞内 表达。而根据报道，X蛋白的表达并不会直接致癌，而是在特定的环境下(如在致癌基因表达 的情况下），以弱辅助因子的形式间接起到致癌的作用，其中C端截短的X蛋白（如WPRE中的X 蛋白片段）比全长的乂蛋白有更强的致癌能力（16^^(1；[1108,8；[116七6七31.1997)。在肝细 胞肝癌中，X蛋白的开放阅读框通常都会出现截短，而这些截短的X蛋白与全长的X蛋白相 比，有更强的提升细胞增殖能力的活性(Tu，Bonura et al. 2001)。ThemiS等报道，将含有截 短X蛋白的WPRE的慢病毒载体导入到胎鼠体内后诱导了肝细胞肝癌的产生(Themis, Mike, et al.2005)，人们对WPRE是否具备足够的安全性又有了更多的疑问。
[0007]现有技术中，并未见针对WPRE进行改进提升慢病毒载体安全性的报道;另外，虽然 已经有将Anti-MART-1 TCR基因被导入到T细胞中并产生了抗黑色素瘤效果的报道，但这些 报道的效果远未达到最优，目前也未出现针对Anti-MART-1 TCR进行优化提升其效果的报 道。
[0008] 参考文献
[0009] Johnson,L.Aet al.(2006).^Gene transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes."The Journal of Immunology 177(9):6548-6559.
[0010] Themis，Mike，et al?(2005)?"Oncogenesis following delivery of a nonprimate lentiviral gene therapy vector to fetal and neonatal mice. Molecular Therapy 12.4:763-771.
[0011] Patel,M.and J.C.01sen(2005)//828.Optimizing the Woodchuck Hepatitis Virus Post-Transcriptional Regulatory Element(ffPRE)for Safety and Function in Lentiviral Vectors."Molecular Therapy 11:S322-S322.
[0012] Terradillos,0.,et al?(1997) ,The hepatitis B virus X gene potentiates c-myc-induced liver oncogenesis in transgenic mice .''Oncogene 14(4): 395-404.
[0013] Tu，H?，et al?(2001)?"Biological impact of natural COOH-terminal deletions of hepatitis B virus X protein in hepatocellular carcinoma tissues."Cancer research 61(21):7803-7810.
【发明内容】
[0014] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提升安全性，用于表达密码子 优化的Anti-MART-1 TCR基因的慢病毒载体，并将其应用到细胞治疗所涉及的T细胞基因修 饰中。
[0015] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0016] 将WPRE元件替换为0PRE元件APRE元件的来源与WPRE元件相同，为土拨鼠肝炎病 毒车专录后调控元件（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element，WHV-PRE)dOPRE选取了 WHV-PRE中的不含X蛋白序列的片段，并突变其中潜在的起 始密码子(ATG)，如图1所示。0PRE元件核苷酸序列如SEQ ID No.:l所示。WPRE元件核苷酸序 列如SEQ ID No. :5所示。
[0017] 使用密码子优化的CoAnti-MART-1 TCR(即Codon Optimized Anti-MART-1 TCR) 基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. :2所示。
[0018] 本发明通过基因二级结构优化对野生型Anti-MART-1 TCR基因（SEQ ID No. :4)进 行改造，改造后基因序列与野生型序列同源性为79%，其编码的蛋白质共614个氨基酸，氨 基酸序列如SEQ ID No.:3所示。
[0019] 将0PRE元件和密码子优化后的CoAnti-MART-1 TCR基因序列整合到 pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP载体的方法如图3所示，包括如下步骤：
[0020] S10、对WPRE元件进行改进得到0PRE元件;对Anti-MART-1 TCR进行密码子优化。委 托合成所述0PRE元件和经密码子优化的CoAnti-MART-1 TCR基因序列，得到含有pUC-〇PRE 载体和pUC-C〇Ant i -MART-1载体的大肠杆菌菌液；
[0021] S20、培养S10中所得到的含有pUC-OPRE载体和pUC-CoAnti-MART-1载体的大肠杆 菌，并提取其中所包含的载体；
[0022] S30、用Sal I和Kpn I限制性内切酶分别处理pUC-OPRE和pRRLSIN.cPPT.MSCV/ GFP. WPRE载体，回收0PRE片段和线性化的pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. WPRE载体，然后按0PRE 片段:线性化pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. WPRE载体的摩尔比3:1的比例混合后用DNA连接酶连 接，得到pRRLSIN ? cPPT ? MSCV/GFP ? 0PRE 载体；
[0023] S40、用BstB I和Sal I限制性内切酶分别处理pUC-CoAnti-MART-1和 pRRLSIN. cPPT .MSCV/GFP ? 0PRE载体，回收CoAnti-MART-1 基因片段和线性化的 pRRLSIN. cPPT .MSCV/GFP .0PRE 载体，然后按CoAnti-MART-1 基因片段：线性化 pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. 0PRE载体的摩尔比3:1的比例混合后用DNA连接酶连接，得到本发 明所需的 pRRLSIN ? cPPT ? MSCV-CoAnt i-MART-1 ? 0PRE 载体。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下:本发明通过置换传统慢病毒载体当中 可能存在的表达X蛋白的WPRE为不含X蛋白的0PRE，提升了慢病毒的安全性，该0PRE优化后 的慢病毒载体的基因转导效率及包装产生的病毒滴度同未经改造的WPRE慢病毒载体相比 没有显著差异；同时对Anti-MART-1 TCR基因进行了密码子优化，优化后的该基因与野生型 基因的同源性为79 %。该密码子优化的Ant i-MART-1 TCR在人T细胞内的表达水平较野生型 提高约19.3% ;与黑色素瘤细胞株共培养后，IFN- y表达升高23.4%以上;并且能更好地抑 制黑色素瘤在小鼠体内的增长，显著延长荷瘤小鼠的生存期。
【附图说明】
[0025] 图1为WPRE和0PRE元件序列示意图；
[0026] 图2为一实施方式所述慢病毒表达载体的结构示意图；
[0027] 图3为一实施方式所述慢病毒表达载体的构建方法的流程图；
[0028] 图4为所述慢病毒表达载体的主要元件及其排列结构；
[0029] 图5为包装的慢病毒的滴度测定结果。WPRE:用pRRLSIN. cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体 包装的慢病毒;0PRE:用pRRLSIN. cPPT.MSCV/GFP. 0PRE载体包装的慢病毒。可以看到，利用 这两种载体包装出的慢病毒的滴度无显著差异(P>〇. 05)，说明将载体的WPRE元件替换为 0PRE元件对慢病毒的包装没有显著影响；
[0030]图6为经慢病毒转导的⑶8+T淋巴细胞经培养后，检测GFP表达情况的结果。WPRE: 用pRRLSIN. cPPT ? MSCV/GFP ? WPRE载体包装的慢病毒；0PRE :用pRRLSIN. cPPT ? MSCV/ GFP. 0PRE载体包装的慢病毒。其中，a:培养T细胞时间为6天;b:培养T细胞时间为30天。可以 看到，分别用这两种载体包装出的慢病毒转导CD8+T淋巴细胞，不管是经6天培养还是30天 培养，其GFP表达水平均无显著差异(p>0.05)，说明将载体的WPRE元件替换为0PRE元件对 GFP的表达没有显著影响；
[0031] 图7为Anti-MART-1 TCR基因密码子优化前后mRNA二级结构的对比。其中，a.密码 子优化前，b.密码子优化后。可以看到，密码子优化前，mRNA的二级结构中含有多个发夹结 构和颈环结构;密码子经优化后，mRNA的二级结构中的颈环结构基本消失，发夹结构也大幅 减少，可以促进mRNA的翻译；
[0032] 图8为Anti-MART-1 TCR基因密码子优化前后在CD8+T细胞中表达效果的对比；可 以看到，经密码子优化后，Anti-MART-1 TCR基因在⑶8+T细胞中的表达水平比优化前的高 19.3% ；
[0033] 图9为培养经慢病毒处理的⑶8+T细胞14天后，应用流式细胞术和Tetramer技术检 测Anti-MART-1 TCR在CD8+T细胞表面的表达情况；以及应用流式细胞术和Anti-Va2抗体检 测Ant i-MART-1 TCR在细胞内的表达情况。可以看到，转导了 OPRE-CoAnt i-MART-1慢病毒的 T细胞的Anti-MART-1 TCR在⑶8+T细胞表面的表达水平和在T细胞内的表达水平分别比转 导了WPRE-CoAnti-MART-1 慢病毒的T细胞的高22? 9%和90? 1 % ;
[0034]图10为第一次用0KT-3对慢病毒处理的⑶8+T细胞进行刺激24h并分别与黑色素瘤 526和624细胞株共培养后的相关实验结果。其中，a. CD8+T细胞的MART-1表达水平情况， b.ELISA检测IFN-y表达情况的结果。*表示与WPRE-CoAnti-MART-1实验组相比，p〈0.05。可 以看到，转导了〇PRE-CoAnti-MART-l慢病毒的T细胞的Anti-MART-1 TCR表达水平比转导了 WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞高30.5%;经0KT-3刺激并分别与黑色素瘤526和624细 胞株共培养后，转导了〇PRE-CoAnti-MART-l慢病毒的T细胞的IFN-y比转导了WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞分别高49.7%和69.9% ;
[0035]图11为第二次用0KT-3对慢病毒处理的⑶8+T细胞进行刺激24h并分别与黑色素瘤 526和624细胞株共培养后的相关实验结果。其中，a. CD8+T细胞的MART-1表达水平情况， b.ELISA检测IFN-y表达情况的结果。*表示与WPRE-CoAnti-MART-1实验组相比，p〈0.05。可 以看到，转导了〇PRE-CoAnti-MART-l慢病毒的T细胞的Anti-MART-1 TCR表达水平比转导了 WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞高7.3% ;经0KT-3刺激并分别与黑色素瘤526和624细 胞株共培养后，转导了〇PRE-CoAnti-MART-l慢病毒的T细胞的IFN-y比转导了WPRE-(^1^-獻1?1'-1慢病毒的1'细胞分别高23.7%和7.7% ;
[0036] 图12为接种黑色素瘤的荷瘤小鼠在分别回输经OPRE-CoAnti-MART-1和WPRE- CoAnti-MART-1慢病毒转导的T细胞后，黑色素瘤体积的变化情况。*表示与WPRE-CoAnti-MART-1实验组相比，p〈0.05。
【具体实施方式】
[0037]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方 法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.， Russell,David ff.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY, Cold Spring Harbor)〇
[0038] 本发明所使用的慢病毒载体pRRLSIN ? cPPT ? MSCV/GFP ? WPRE由购自Addgene的商业 化的pRRLSIN. cPPT. PGK-GFP ? WPRE改造而来，即将PGK启动子替换为MSCV启动子。
[0039] 本发明所使用的常规黑色素瘤526和624细胞株均为美国国立癌症所研究员 Dr ? Rosenberg 所赠。
[0040] 本发明所使用的其他试剂和制剂，如293FT细胞、流式细胞术抗体等均为市售商 品。
[0041 ] 实施例一 WPRE序列的改造
[0042]由于WPRE上有潜在的启动子和部分X蛋白的序列，因此需对这两部分进行剔除。选 取土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件DNA序列901-1482bp位置的片段，并突变其中潜在的起 始密码子(ATG)即可得到0PRE片段，如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.:l所示。委托上 海生工生物工程股份有限公司合成0PRE元件，基因合成服务中使用pUC57载体作为亚克隆 载体，得到PUC-0PRE载体。
[0043] 实施例二 pRRLSIN ? cPPT ? MSCV/GFP ? WPRE 载体的改造
[0044] 用Sal I和Kpn I内切酶处理pUC-〇PRE载体和pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体， 分别回收300bp左右的0PRE序列和6800bp左右的pRRLSIN ? cPPT ? MSCV/GFP ? WPRE载体片段， 然后将0PRE序列与pRRLSIN. cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体片段按摩尔比3:1的比例混合后用 DNA连接酶进行连接。连接完成后用Sal I和Kpn I内切酶进行酶切鉴定，能成功酶切出 500bp左右片段的连接产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果正确的即 为pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. 0PRE载体，其结构如图2所示。
[0045]实施例三慢病毒的包装
[0046] 培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到10cm培养皿中，每个皿接种5 X 106 个细胞，加入DMEM无双抗培养基培养细胞约18h后至融合度达到80-90 %后，取慢病毒载体 10辟、辅助载体口]/1)1^/^1?1^41^￥-1^￥和。]\〇-6载体各5辟，用1^。〇€6(^&111；[116 2000转导至 293FT细胞中，转导后4-6h更换成DMEM完全培养基。48h后收集含病毒的上清培养基，6000g 离心10min后，取上清液再用0.45mi过滤头进行过滤，获得慢病毒液。
[0047]实施例四慢病毒滴度测定
[0048] 第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2 X 105个细胞，每个孔加入500 此培养基，37 °C、5 % C02培养过夜；
[0049]第二天，按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为UIO^IO^IO^IO'IO^IO^IO7 和1〇8,用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将1〇〇此梯度稀释的所述重 组慢病毒的溶液与1〇〇此多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转导，转导开始 后24h，吸去培养基并换成500yL含5U DNasel的新鲜培养基，37°C下培养30min以去除可能 附着于细胞表面的残余载体DNA，然后将培养基换成lmL正常培养基，继续培养48h;
[0050]第四天，吸去所述多孔板的每个孔中的培养基，加入500yL胰酶-EDTA溶液消化细 胞，在37°C反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的 细胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA;以及分别对得到的所述 每孔细胞的总cDNA进行荧光定量PCR，得到每孔细胞的Ct值，选择与对照组Ct值差异最小但 超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度：
[00511 T = RX20X103,其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
[0052] 实施例五 pRRLSIN. cPPT .MSCV/GFP ? 0PRE 载体的验证
[0053] 按实施例三的步骤将 pRRLSIN .cPPT.MSCV/GFP. WPRE 和 pRRLSIN .cPPT.MSCV/ GFP. 0PRE载体分别包装成慢病毒，然后根据实施例四中的步骤测定包装所得慢病毒的滴 度，结果如图5所示。可以看到，所获得的病毒的滴度无显著差异(p>0.05)，说明将载体的 WPRE元件替换为0PRE元件对包装病毒的滴度没有显著影响。
[0054]利用MyltenyiBiotec的磁珠技术从黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞(PBL)中分离 CD8+T淋巴细胞，然后按照每个T细胞3TU的比例加入慢病毒进行转导，32°C离心2h后，将细 胞置于37 °CC02培养箱进行培养。分别取培养6天和30天的T细胞，流式细胞术检测GFP的表 达情况，结果如图6所示。可以看到，不管是培养6天（图6a)还是培养30天（图6b)的T细胞， GFP的表达水平无显著变化(p>0.05)，说明将载体的WPRE元件替换为0PRE元件对GFP的表达 没有显著影响。
[0055]以上结果说明，0PRE元件可以很好地取代WPRE元件执行其功能，对包装慢病毒滴 度和外源基因的表达都没有显著影响(P>〇. 05)。
[0056] 实施例六Anti-MART-1 TCR的密码子优化
[0057] 根据野生型Anti-MART-1 TCR基因序列（SEQ ID No. :4)分析其密码子使用情况以 及转录形成mRNA的二级结构。密码子优化的过程中遵从以下原则：
[0058] ①不减少野生型Anti-MART-1 TCR所编码的氨基酸数和改变氨基酸的相对位置；
[0059] ②减少Anti-MART-1 TCR的基因序列对应的mRNA的二级结构中可能存在的稳定结 构区域，特别是在5'和3'端附近；
[0060] ③平衡Anti-MART-1 TCR局部AT含量，防止出现连续的高A-T含量的序列（如 ATTTA、AATAAA)导致转录的提前终止，并提升GC碱基的含量；
[0061 ] ④根据pRRLSIN. cPPT .MSCV/GFP .0PRE载体的序列信息，去除密码子优化过程总产 生的限制性内切酶酶切位点。
[0062] 密码子优化后Anti-MART-1 TCR命名为CoAnti-MART-1 TCR，其基因序列上有21 % 的核苷酸发生改变。对密码子优化前后的Anti-MART-1 TCR mRNA结构进行分析，可以看到 经密码子优化后，mRNA的二级结构变得更为简单，且mRNA 5'端的折叠没有形成发卡结构， 如图7所示，从而有利于在蛋白翻译的过程中核糖体与mRNA顺利结合并迅速地开始翻译，因 此能有效提高基因表达产物的水平。
[0063] 实施例七重组慢病毒载体的构建
[0064] 委托上海生工生物股份有限公司按照SEQ ID No. :2和SEQ ID No. :4所示序列合 成经密码子优化和野生型的Anti-MART-1 TCR基因，基因合成服务中使用pUC57载体作为亚 克隆载体，得到 pUC-CoAnt i-MART-1 载体和 pUC-Ant i-MART-1 载体。
[0065] 用BstB I和Sal I内切酶分别处理pUC-CoAnti-MART-1载体和 pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. 0PRE载体，分别回收 1800bp左右的CoAnt i-MART-1 TCR基因序列 和6800bp左右的pRRLSIN. cPPT .MSCV/GFP. 0PRE载体片段，然后将CoAnti-MART-1 TCR基因 序列与pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. OPRE载体片段按摩尔比3:1的比例混合后用DNA连接酶进 行连接。连接完成后用BstB I和Sal I内切酶进行酶切鉴定，将能成功酶切出1800bp左右片 段的连接产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果正确的载体即为 pRRLSIN.cPPT.MSCV-CoAnti-MART-l.OPRE 载体。按照上述步骤再构建 CoAnti-MART-1 与 pRRLSIN ? cPPT ? MSCV/GFP ? WPRE 载体重组的 pRRLSIN ? cPPT ? MSCV-CoAnt i-MART-1 ? WPRE 载体 和 Anti-MART-1 与 pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP .OPRE 载体重组的 pRRLSIN. cPPT.MSCV-Anti-MART-1. WPRE载体，其结构如图2所示，整体构建流程如图3所示。
[0066]实施例八慢病毒转导T细胞
[0067]按实施例三和实施例四的步骤将实施例七所述重组慢病毒载体分别包装成慢病 毒并测定滴度，分别得到 WPRE-CoAnti-MART-l、OPRE-CoAnti-MART-l 和 0PRE-Anti-MART-1 慢病毒。这些慢病毒的滴度均大于106TU/mL，可以用于后续实验。
[0068]利用MyltenyiBiotec的磁珠技术从黑色素瘤患者的外周血淋巴细胞(PBL)中分离 ⑶8+T淋巴细胞，然后按照每个T细胞3TU的比例分别加入上述慢病毒进行转导，32°C离心2h 后，将细胞置于37 °C C02培养箱进行培养。
[0069] 实施例九Anti-MART-1 TCR基因密码子优化前后的效果对比
[0070] 取转导了 OPRE-CoAnti-MART-1 和 0PRE-Anti-MART-1 慢病毒并培养 10 天后的 T 细 胞，流式细胞术检测其密码子优化前后的Anti-MART-1 TCR水平，发现密码子优化后Anti-MART-1 TCR的表达水平提高了 19.3%，如图8所示。
[0071] 实施例十WPRE与0PRE对密码子优化的Anti-MART-1 TCR在T细胞中表达的对比
[0072] 取转导了 WPRE-CoAnti-MART-1 和 OPRE-CoAnti-MART-1 慢病毒并培养 14 天后的 T 细 胞，应用流式细胞术和Tetramer技术检测T细胞表面Ant i-MART-1 TCR的表达水平，发现转 导了OPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞比转导了WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞的 高22.9% ;应用流式细胞术和Anti-Va2抗体检测T细胞内Anti-MART-1 TCR的表达水平，发 现OPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞比转导了WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞的高 90.1%。如图9所示。
[0073] 实施例^^一WPRE与0PRE对IFN- y表达情况的影响
[0074] 分别取转导了 WPRE-CoAnti-MART-1 和 OPRE-CoAnti-MART-1 慢病毒并培养了 14 天 后的T细胞，流式细胞术检测Ant i-MART-1 TCR的表达水平，结果如图10a所示。可以看到，转 导了 OPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞的Ant i-MART-1 TCR表达水平比转导了 WPRE-(：〇八11衍-嫩1?1'-1慢病毒的1'细胞高30.5%。
[0075] 上述T细胞经0KT-3刺激24h，取部分细胞与黑色素瘤526和624细胞株共培养16h 后，应用ELISA检测INF-y表达水平的变化，结果如图10b所示。可以看到，OPRE-CoAnti-MART-1实验组经刺激并与黑色素瘤526和624细胞株共培养后，产生IFN-y的水平分别比 WPRE-CoAnti-MART-1实验组高49.7%和69.9%，差异具有统计学意义(p〈0.05)。
[0076]继续培养这些T细胞12天，再次通过流式细胞术检测MART-1的表达水平，结果如图 11a所示，可以看到，转导了OPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞的Anti-MART-1 TCR表达水 平比转导了 WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒的T细胞高7.3 %。将上述T细胞再次进行0KT-3刺激 24h并与黑色素瘤526和624细胞株共培养后，ELISA检测INF-y表达水平的变化，结果如图 lib所示。可以看到，OPRE-CoAnti-MART-1实验组经刺激并与黑色素瘤526细胞株共培养后， 产生IFN-y的水平比WPRE-CoAnti-MART-1实验组的高23.4%，差异有统计学意义（p〈 0.05);与黑色素瘤624细胞株共培养后，OPRE-CoAnti-MART-1实验组产生IFN-y的水平较 WPRE-CoAnti-MART-1实验组高7.7%，结果无显著差异(p>0.05)。
[0077]实施例十二体内抑瘤试验
[0078]取转导了 WPRE-CoAnti-MART-1 和 OPRE-CoAnti-MART-1 慢病毒并培养了 14 天后的 T 细胞和未经处理的T细胞（对照组），回输到已在皮下接种黑色素瘤的裸鼠体内，检测黑色 素瘤体积的变化，其结果如图12所示。可以看到，接种于对照组裸鼠皮下的黑色素瘤体积在 细胞回输后第10天左右即开始迅速增大，至第30天时已超过800mm 3;回输了WPRE-CoAnti-MART-1慢病毒转导的T细胞的裸鼠，其皮下黑色素瘤的体积在细胞回输后的15天时间内没 有明显变化，随后也开始增大，至第30天时达到400mm 3;回输了OPRE-CoAnti-MART-1慢病毒 转导的T细胞的裸鼠，其皮下黑色素瘤的体积在细胞回输后的30天时间内基本没有变化，与 其他两组相比具有显著差异(P〈〇.〇5)。以上结果说明0PRE与密码子优化的Anti-MART-1的 组合能比其他组合有更好的抑瘤效果。在本实施例中，所述肿瘤体积的换算公式为:肿瘤块 长(L)X 宽(W)2。
[0079]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种安全性提升的、抗黑色素瘤的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为将 pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的WPRE元件被替换为更加安全的OPRE元件，并且插入了 抗黑色素瘤表面抗原的TCR片段，命名为pRRLSIN.cPPT.MSCV-CoAnti-MART-l.OPRE载体。2. 根据权利要求1所述的慢病毒载体，所述插入的抗黑色素瘤基因片段为经密码子优 化的Anti-MART-lTCR(CoAnti-MART-l，核苷酸序列如SEQ ID No. :2所示），其特征在于，所 述0PRE元件的核苷酸序列如SEQ ID No.:l所示。3. -种如权利要求1~2中任一项所述的慢病毒表达载体的制备方法，其特征在于，包 括如下步骤： 委托合成所述0PRE元件（SEQ ID No.:l)和经密码子优化的Anti-MART-ITCR基因序列 (SEQ ID No. :2)，得到含有pUC-OPRE质粒和pUC-CoAnti-MART-Ι质粒的大肠杆菌菌液； 培养所述含有PUC-0PRE质粒和pUC-C〇Anti-MART-l质粒的大肠杆菌，并提取其中所包 含的质粒； 用Sal I和Κρη I限制性内切酶分别处理pUC-OPRE和pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE质 粒，回收0PRE片段和线性化的pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. WPRE质粒，然后将两者按0PRE片段： 线性化pRRLSI N. cPPT. MSCV/GFP. WPRE质粒的摩尔比3:1的比例混合后用DNA连接酶连接，得 到pRRLSIN · cPPT · MSCV/GFP · 0PRE 质粒； 用BstB I和Sal I限制性内切酶分别处理pUC-CoAnti-MART-1 和pRRLSIN.cPPT.MSCV/ GFP. 0PRE质粒，回收Ant i-MART-Ι 基因片段和线性化的 pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. 0PRE质粒， 然后将两者按CoAnti-MART-1基因片段：线性化pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. OPRE质粒的摩尔 比3:1的比例混合后用DNA连接酶连接，得到所述的pRRLSIN.cPPT.MSCV-CoAnti-MART-i.OPRE质粒。4. 一种重组慢病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 取所述慢病毒表达载体10yg、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体各5yg混合 后转染到293FT细胞中，转染后4h~6h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保 留上清并将所述上清用〇.45μπι过滤头过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。5. 根据权利要求9所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，还包括在得到所述重组 慢病毒的溶液后，对所述重组慢病毒的溶液的滴度进行检测的步骤，具体为： 第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2 X 105个细胞，每个孔加入500yL培 养基，37 °C、5 % C02培养过夜； 第二天，按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为κιο^ιο^ιο^ιο'ιο^ιο^π^ριο8， 用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将l〇〇yL梯度稀释的所述重组慢病 毒的溶液与l〇〇yL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开始后24h， 吸去培养基并换成500yL含5U DNasel的新鲜培养基，37°C下培养30min以去除可能附着于 细胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成lmL正常培养基，继续培养48h; 第四天，吸去所述多孔板的每个孔中的培养基，加入500yL胰酶-EDTA溶液消化细胞，在 37°C反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细胞， 抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA;以及分别对得到的所述每孔细 胞的总cDNA进行荧光定量PCR，得到每孔细胞的Ct值，选择与对照组Ct值差异最小但超过2 的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度： T = RX20X103,其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
【文档编号】C12N15/66GK105821080SQ201610299138
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】杨世成, 毛侃琅, 吕卫东
【申请人】深圳精准医疗科技有限公司