一种制备左旋多巴的方法
【专利摘要】本发明属于微生物酶法合成领域，涉及一种制备左旋多巴的方法，采用重组菌大肠埃希氏菌FDop（<i>Escherichia coli </i>FDop）发酵产生，FDop已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年2月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016064。具体包括如下步骤：（1）菌种活化，得到一级种子；（2）扩大培养，得到二级种子；（3）发酵培养：将所述二级种子接种到发酵培养基中，同时加入葡萄糖，转速350?450rpm，风量3?5L/min，控制pH6.0?6.5进行发酵，溶氧控制在15?30%，得到发酵液；（4）诱导：所述发酵液的OD600达到8?10，加入IPTG至终浓度为0.03?0.06mM，同时开始流加左旋酪氨酸溶液，诱导48?72小时，纯化得到左旋多巴。本发明制备左旋多巴的工艺易于控制，稳定性好，副产物少，左旋多巴的产率高。CCTCC NO: M 201606420160219
【专利说明】
一种制备左旋多巴的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种利用微生物发酵的方法，具体是一种制备左旋多巴的方法，属于 微生物酶法合成领域。
【背景技术】
[0002] 左旋多巴（3，4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-D0PA)的化学名称为3，4_二 羟基苯基丙氨酸，其结构式为：
作为一种重要的生物活性物质，L-D0PA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途 径过程中的重要中间产物。
[0003] 上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-D0PA的研究。为了提 高L-D0PA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-D0PA的工艺方法进行了大量研 究。
[0004] 酪氨酸酸裂解酶（Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名酪氨酸 酶，以磷酸吡咳醛(pyridoxal_phosphate，PLP)为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL 可以催化L-酪氨酸发生消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯 二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-D0PA。左旋多巴的前体 在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导 致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-D0PA的产率低。
[0005] 也有一些利用自然界中的细菌，如Escherichia、Proteus(变形菌属）、 Stizolobium hassjoo和Erwinia(欧文氏菌属）等，来合成L-D0PA，如左旋多巴酶法合成综 述报道，TPL大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6g/L的L-D0PA。又如，Jang-Young !^6等人克隆来源于￡8(：1161'；[(31113(30111(41'(](]11105)的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶(口-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH)，转化L-酪氨酸为L-D0PA，产物累积至 10g/ L，该技术申请了专利US5837504。研究者发现这些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌 株，但最终的L-D0PA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高 的L-D0PA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜 的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定 性差，副产物多，L-D0PA的产率低。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种制备左旋多巴的方法，采用一株用于发 酵生产左旋多巴的具备遗传稳定性高，产量高，副产物少的重组菌株FDop。
[0007] 采取的技术方案如下：一种制备左旋多巴的方法，采用重组菌大肠埃希氏菌FDop (Escherichia coli FDop)发酵产生，FDop已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为 2016年2月19日，保藏地址:武汉大学武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC N0:M 2016064。
[0008] 重组菌FDOP是通过将来源于粗糙链孢菌(Neurospora crassa)的酪氨酸酶基因 (Gene ID:M32843.1)导入左旋酪氨酸生产菌构建而成。
[0009] 进一步，重组菌roop的获得步骤包括:设计引物克隆酪氨酸酶基因，将克隆到的酪 氨酸酶基因连入表达载体中，构建表达质粒Tyrse，再将表达质粒Tyrse导入左旋酪氨酸生 产菌(Tyr)中，构建得到重组菌FDop。
[0010] 进一步，表达载体采用表达载体PKK223-3。
[0011]制备左旋多巴的方法，具体包括如下步骤：（1)菌种活化:挑单FDop菌落，接种于种 子培养基中，加Amp至10011^/1，35-37°(：，200-250印111，培养12-1611，得到一级种子；（2)扩大 培养:将所述一级种子接种到种子培养基中，加Amp至100mg/L，35-37°C，200-250rpm，培养 12-16h，得到二级种子;（3)发酵培养:将所述二级种子接种到发酵培养基中，同时加入葡萄 糖，转速350-450rpm，风量3-5L/min，控制pH6.0-6.5进行发酵，溶氧控制在15-30%，得到发 酵液；（4)诱导:所述发酵液的0D600达到8-10，加入IPTG至终浓度为0.03-0.06mM，同时开始 流加左旋酪氨酸溶液，诱导48-72小时，纯化得到左旋多巴。
[0012]进一步，步骤(4)中，左旋酪氨酸溶液的流加流速为0.3-0.8g/L。
[0013] 进一步，步骤(3)中，采用氨水控制pH6.0-6.5。
[0014]进一步，所述种子培养基包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5g/L、氯化钠10g/L。 [0015]进一步，发酵培养基包括十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵 1 g/L、氯化钠0 ? 5g/L、七水硫酸镁0 ? 246g/L。
[0016]进一步，获得重组菌roop的具体步骤包括： 1.将L-酪氨酸生产菌(Tyr)制备成感受态细胞 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得Tyr菌感受态。
[0017] 2.全基因合成酪氨酸酶基因片段 根据NCBI数据库中Gene ID:M32843.1提供的序列，合成粗糙链孢菌（Neurospora crassa)来源的酪氨酸酶全基因片段。
[0018] 3 ?构建酪氨酸酶表达质粒Tyrse 将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至PKK223-3质粒，酶切位点Ec〇RI、HindIII。
[0019] 4 ?表达质粒Tyrse导入感受态细胞 1) 感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; 2) 超净台中取1微升的质粒Tyrse加入感受态，轻弹混勾，立刻插入冰水浴25min，静置； 3) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; 4) 加700微升左右的LB培养基，150rpm，37度，60min复苏； 5 )3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素（100mg/ L)LB 平板，37°C 培养 16h。
[0020]通过实施上述技术方案，本发明具有如下有益效果:本发明制备左旋多巴的工艺 易于控制，稳定性好，副产物少，左旋多巴的产率高。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。
[0022] 实施例1: 一、 制备重组菌FDop 1、将L-酪氨酸产生菌(大肠杆菌工程菌)制备成感受态细胞 使用TAKARA感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得Tyr菌感受态。
[0023] 2、全基因合成酪氨酸酶基因片段 根据Gene ID:M32843.1提供的序列，合成粗糙链孢菌(Neurospora crassa)来源的酪 氨酸酶全基因片段。
[0024] 3、构建酪氨酸酶表达质粒Tyrse 将酪氨酸酶全基因片段与强启动子片段亚克隆至表达载体PKK223-3质粒，酶切位点选 用EcoRI、HindIII。
[0025] 4、表达质粒Tyrse导入感受态细胞 (1)感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min; (2 )超净台中取1微升的质粒Tyrse加入感受态，轻弹混勾，立刻插入冰水浴25min，静 置； (3) 将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min; (4) 加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏； 3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素（100mg/L) LB平板，37°C培养16h; 二、 利用重组菌FDop发酵产生左旋多巴 1) 挑重组菌FDop单菌落接种于含4ml种子培养基的试管，加Amp至100mg/L，37°C， 220rpm，培养12h，得到一级种子;采用的种子培养基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、 氯化钠l〇g/L、纯水； 2) -级种子接种于100ml种子培养基的三角瓶内，加Amp至100mg/L，37°C，220rpm，培养 4h，得到二级种子； 3) 二级种子接种8L发酵培养基中，同时加入基础葡萄糖4 g/L，转速400rpm，风量4L/ min，氨水控制pH6.0发酵，溶氧控制20%;发酵培养基:十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二 氢钾3g/L、氯化铵1 g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246 g/L、纯水； 4) 基糖耗完，补加葡萄糖6g/L，控制加入速度0.6-1.2g/L，得到发酵液； 5) 待发酵液的0D600达到8-10时，开始加IPTG至终浓度0.05mM，同时开始流加L-酪氨酸 溶液(质量含量为30%)，控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L。
[0026] 6)发酵至左旋多巴不再增加，约48-50小时，停止发酵，左旋多巴含量达50g/L。
[0027] 实施例2: 一、制备重组菌FDop 同实施例1。
[0028] 二、利用重组菌ro〇P发酵产生左旋多巴 1)挑重组菌FDop单菌落接种于含4ml种子培养基的试管，加Amp至100mg/L，35°C， 250rpm，培养16h，得到一级种子;采用的种子培养基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、 氯化钠l〇g/L、纯水； 2) -级种子接种于100ml种子培养基的三角瓶内，加Amp至100mg/L，37°C，200rpm，培养 6h，得到二级种子； 3) 二级种子接种8L发酵培养基中，培养转速350rpm，风量3L/min，氨水控制pH6.5发酵， 溶氧控制30%，得到发酵液;发酵培养基:十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯 化铵1 g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246 g/L、葡萄糖1 Og/L、纯水； 4) 待发酵液的0D600达到8时，开始加IPTG至终浓度0.06mM，同时开始流加L-酪氨酸溶 液(质量含量为30%)，控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L; 5) 发酵至左旋多巴不再增加，约60-65小时，停止发酵，左旋多巴含量达58g/L。
[0029] 实施例3: 一、制备重组菌FDop 同实施例1。
[0030] 二、利用重组菌ro〇P发酵产生左旋多巴 (1) 挑重组菌TOop单菌落接种于含4ml种子培养基的试管，加Amp至100mg/L，36°C， 200rpm，培养15h，得到一级种子;采用的种子培养基:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、 氯化钠1 〇g/L、纯水； (2) -级种子接种于100ml种子培养基的三角瓶内，加Amp至100mg/L，36°C，200rpm，培 养5h，得到二级种子； (3) 二级种子接种8L发酵培养基中，同时加入基础葡萄糖4 g/L，转速450rpm，风量5L/ min，氨水控制pH6.5发酵，溶氧控制30%;发酵培养基:十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二 氢钾3g/L、氯化铵1 g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246 g/L、纯水； (4) 基糖耗完，补加葡萄糖6g/L，控制加入速度1.0-1.2g/L，得到发酵液； (5) 待发酵液的0D600达到9时，开始加IPTG至终浓度0.03mM，同时开始流加L-酪氨酸溶 液(质量含量为30%)，控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L。
[0031] (6)发酵至左旋多巴不再增加，约72小时，停止发酵，左旋多巴含量达55g/L。
【主权项】
1. 一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，采用重组菌大肠埃希氏菌FDop (Escherichia coli FDop)发酵产生，FD0P已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为 2016年2月 19日，保藏编号为CCTCC N0:M 2016064。2. 根据权利要求1所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，重组菌ro〇P是通过将酪 氨酸酶基因导入左旋酪氨酸生产菌构建而成。3. 根据权利要求2所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述酪氨酸酶基因来源 于粗糖链抱菌(Neurospora crassa)。4. 根据权利要求1所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1)菌种 活化:挑单FDop单菌落，接种于种子培养基中，加 Amp至100mg/L，35-37 °C，200-250rpm，培养 12-16h，得到一级种子；（2)扩大培养：将所述一级种子接种到种子培养基中，加 Amp至 100mg/L，35-37°C，200-250rpm，培养4-6h，得到二级种子；（3)发酵培养:将所述二级种子接 种到发酵培养基中，同时加入葡萄糖，转速350-450rpm，风量3-5L/min，控制pH6.0-6.5进行 发酵，溶氧控制在15-30%，得到发酵液;（4)诱导:所述发酵液的0D600达到8-10，加入IPTG至 终浓度为〇 . 03-0.06mM，同时开始流加左旋酪氨酸溶液，诱导48-72小时，纯化得到左旋多 巴。5. 根据权利要求4所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤(4) 中，左旋酪氨酸溶液的流加流速为0.3-0.8g/L。6. 根据权利要求4所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤(3) 中，采用氨水控制PH6.0-6.5。7. 根据权利要求2或3所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，重组菌ro〇p的获得 步骤包括:设计引物克隆酪氨酸酶基因，将克隆到的酪氨酸酶基因连入表达载体中，构建表 达质粒Tyrse，再将表达质粒Tyrse导入左旋酪氨酸生产菌(Tyr)中，构建得到重组菌FDop。8. 根据权利要求7所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述表达载体采用表达 载体 PKK223-3。
【文档编号】C12P13/22GK105821091SQ201610287966
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】储消和, 吴黎诚, 余炜, 方明山, 徐顺清, 周卫国, 张拥军
【申请人】浙江绿创生物科技有限公司, 浙江野风药业股份有限公司