一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、pcr检测方法及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用。本发明利用设计的小麦赤霉病致病镰刀菌特异性引物对病原菌DNA进行PCR扩增，可从小麦赤霉病病原镰刀菌中得到条带单一的特异片段。本发明的检测方法操作简单，耗时少，通量大，可应用于疑似患病的麦穗、种子中快速、准确地检测小麦赤霉病病原菌。
【专利说明】
一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法 及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于作物病害预警检测及防治技术领域，涉及一种分子快速检测的方法与 应用，具体涉及一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物、PCR检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 小麦作为一种重要的粮食作物，全球种植广泛。在我国，小麦是第二大粮食作物， 其种植面积与产量仅次于水稻，也是我国重要的商品粮和战略性的主要粮食品种。小麦病 害的发生导致产量与品质下降，给小麦的生产带来很大的困难。小麦赤霉病（Fusarium head blight，FHB)是小麦生产中的三大病害之一，对小麦生产的影响巨大且分布广泛，很 多国家的小麦产区均有发生，是一种世界性病害，尤其是温暖潮湿的地区。赤霉病主要发生 在我国的中部及长江中下游地区，在长江中下游地区发病较重，由于耕作制度与气候的变 化，小麦赤霉病的流行区域已开始向山东等北部地区转移。小麦赤霉病的发生与流行带来 了巨大的安全隐患，病原菌产生的毒素威胁着人畜的健康。
[0003]小麦赤霉病是由镰刀菌属(Fusarium. spp)引起的一种真菌性病害，病原菌包括禾 谷镰刀菌（F. graminearum)、燕麦镰刀菌（F. avenaceum)、黄色镰刀菌（F. culmorum)、梨 孢镰刀菌(F.poae)、雪腐镰刀菌(F. nivale)，其中禾谷镰刀菌是全世界范围内主要的致病 菌，也是我国小麦赤霉病的主要病原菌，禾谷镰孢菌为致病优势种，约占94.5%。在生产上能 快速准确地鉴定出小麦赤霉病致病菌对防治该病至关重要。对于小麦赤霉病的鉴定，传统 的方法主要依据病原菌的形态特征，采集发病样品，进行组织分离，观察致病菌的形态及产 孢方式等。由于形态鉴定的周期较长，步骤繁琐，对于镰刀菌的预警检测以及生产上对于小 麦赤霉病的防治存在着一定的局限性。随着分子生物学技术的快速发展，分子鉴定被逐步 应用在真菌的分类上。与传统的形态鉴定方法比较，分子鉴定简单，快速，具有较高特异性 和灵敏性。用于镰刀菌属系统学研究的主要基因位点有0_加13111111，抑嫩，￡?-1€ [，这些靶标 基因具有较高的物种特异性。但实际运用中，以上方法对于镰刀菌种间的鉴定也存在着一 定的局限性，不能将镰刀菌鉴定到种。因而对于田间小麦赤霉病致病镰刀菌的快速、准确地 鉴定，需要针对镰刀菌属的特异性靶标位点来开展。针对田间赤霉病的快速检测，生产上存 在着不同的检测方法与体系，但主要针对禾谷镰刀菌单一致病菌，由于田间小麦赤霉病的 致病菌种类较多，因此需要一种能够快速检测出小麦赤霉病致病镰刀菌的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要解决的问题是提供了一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引 物、PCR检测方法及其应用，本发明可以直接从发病的麦穗或带菌的种子中检测出小麦赤霉 病的致病镰刀菌。所述小麦赤霉病致病菌分子快速检测的方法应用于田间小麦赤霉病的早 期诊断以及病菌的监测和鉴定。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现： 本发明提供了一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物，所述引物的序列为： F1:5，-ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG-3，； R1:5 '-TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG-3 '。
[0006] 本发明还提供了利用所述的特异性引物检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方 法，它包括以下步骤： (1) 分离小麦中的病原菌； (2) 提取病原菌的基因组DNA; (3) PCR反应程序； (4) PCR扩增产物通过电泳分析，当PCR产物呈现1655 bp条带时，即检测到赤霉病病 原镜刀囷。
[0007] 进一步的:所述步骤(1)中的病原菌取自小麦麦粒或小麦染病组织。
[0008] 进一步的：所述步骤（1)中分离病原菌的步骤为;切取小麦染病组织，置于乙醇中 浸泡，然后移入升汞溶液中浸泡，再转移到无菌水中漂洗;最后将漂洗后的染病组织移至培 养基上，进行培养3-5d。
[0009] 进一步的：所述PCR反应的体系为25yL，反应液为：10Xbuffer 2.5yL，dNTP 1此， 引物F1 和R1 各 lyL，Taq酶 0 ? 5yL，DNA 模板 3yL，ddH20 16yL。
[0010] 进一步的：所述PCR反应的程序为：94°C预变性5min ;94°C变性45s，53°C退火 45s，72°C延伸lmin，进行35个循环;72°C总延伸lOmin。
[0011] 进一步的：所述1655bp的序列如SEQ ID No:l所示。
[0012] 本发明还提供了所述的特异性引物在制备用于检测小麦赤霉病病原镰刀菌的试 剂中的应用。
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及技术效果:本发明利用了镰刀菌属特异 性CYP51C基因（如SEQ ID No: 1所示)作为检测靶标，通过比对分析小麦赤霉病致病镰刀菌 与其他镰刀菌的CYP51C序列，设计一对特异性引物F1和R1，通过基本PCR操作，利用扩增的 有无以及特异性条带的大小来鉴定出小麦赤霉病病原的存在。通过本发明技术方案可以对 发病小麦进行定性检测，明确小麦赤霉病的存在及分布，为及时有效防治小麦赤霉病提供 理论依据。
[0014] 与已有的赤霉病鉴定方法比较，本发明的独特之处在于： 1. 采用1对引物进行PCR扩增，操作方法和体系较简便； 2. PCR扩增产物为一条带，结果特异，不需要多条带鉴定病原菌； 3. 病原菌鉴定范围较广，并非针对一种致病菌，鉴定方法适用于田间小麦赤霉病多种 病原菌的鉴定； 4. 本发明检测方法灵敏度较高，所需DNA较少，20ng DNA便可检测到结果，确保从麦穗 中检测出致病菌。
【附图说明】
[0015]图1是利用本发明设计的特异性引物的PCR扩增结果，其中M: DL2000 DNA Marker 1:禾谷镰刀菌;2:燕麦镰刀菌;3:腐皮镰刀菌;4:尖孢镰刀菌株;5:链格孢菌株； 图2是本发明实施例2中不同地区田间采集菌株的PCR扩增结果，M: DL2000 DNA Marker，1-9菌株信息详见表1; 图3是本发明实施例3中麦粒0嫩的?0財广增结果1:012000 0嫩1&^1?^，1-9菌株信息 详见表1。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。
[0017] -、已知菌株的PCR鉴定 1、囷株DNA提取 取禾谷镰刀菌株、燕麦镰刀菌株、腐皮镰刀菌株、尖孢镰刀菌株和链格孢菌株，上述菌 株为本实验室保存，也可以采用商品化的菌株。
[0018] 1)挑取上述5种菌株的菌丝于PDA培养基，25°C培养4d，利用CTAB法提取DNA; 2) 用灭菌牙签刮取PDA平板上的少量病原菌菌丝，置于研钵中用液氮磨至粉状，装入 2.0 ml的离心管中； 3) 加入700 yl 2%的CTAB抽提液，将离心管置于65°C的水浴槽中，每隔lOmin振荡混匀 一次，60min后取出，冷却至室温； 4) 加入等体积的酸与氯仿（1:1)，剧烈震荡，充分混勾，室温静置2min，12000rpm，离心 15min； 5) 小心吸取上清，加入到新的1.5ml离心管中，再次加入等体积的酚与氯仿（1:1)，剧 烈震荡，充分混勾，室温静置2min，12000rpm，离心15min; 6) 吸取上清与一新1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，将离心管慢慢上下摇动几 次，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物，-20°C放置20min; 7) 常温下12000rpm，离心15min，使DNA沉淀，弃上清，用70%的乙醇洗涤沉淀，轻轻转 动，用手指轻弹管底，7500rpm，室温离心5min，弃去上清，室温下晾干DNA; 8) 加入50 yl ddH20溶解，上清即为提取的DNA溶液，可用于PCR模板。
[0019] 2、设计致病镰刀菌引物 根据镰刀菌属CYP51C基因序列，设计一对检测赤霉病的特异性引物： 上游引物 Fl:5'_ ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG _3'（SEQ ID No:2); 下游引物 Rl:5'_ TCAITCTACTGTCTCGCGTCGACG-3'（SEQ ID No:3)。由北京擎科生物公 司合成。
[0020] 3、PCR 扩增 PCR反应体系为25yL，反应液为：10 X buf f er2 ? 5yL，dNTPlyL，引物(F1和R1)各lyL，Taq 酶0 ? 5yL，DNA 模板 lyL( 20ng)，ddH2018yL。
[0021] PCR扩增程序:94°C预变性 5min ;94°C变性45s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，进 行35个循环;72°C总延伸lOmin。
[0022] 4.PCR扩增产物在1%的琼脂凝胶中用1 XTAE buffer电泳分析，凝胶成像系统观察 条带大小。
[0023]结果鉴定:利用本发明设计的特异性引物，以已知菌株为模板，PCR扩增结果如图1 所示，1-2泳道扩增出特异性条带，3-5泳道扩增不出特异性条带，与已知结果符合(禾谷镰 刀菌，燕麦镰刀菌是小麦赤霉病的致病菌）。
[0024]二.不同地区田间采集菌株的PCR扩增及鉴定结果 1.病原菌的分离 采用组织分离法对小麦赤霉病的病原菌进行分离，田间采集菌株信息见表1。切取病健 交界处的病组织4_5mm的小块，置于75%乙醇中浸泡5s，接着将病组织移入0.1%升汞溶液中 浸泡3-5min，再将病组织转移到无菌水中漂洗3遍，最后将组织移到TOA培养基上，将培养皿 放置25 °C培养箱中培养3-5d，菌落直径3cm即可进行DNA提取实验。
[0025] 2.病原菌基因组DNA少量提取(CTAB法）。
[0026] 3. PCR扩增程序 选用致病镰刀菌引物为： 上游引物 Fl:5'_ ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG -3'； 下游引物Rl:5'_ TCAITCTACTGTCTCGCGTCGACG-3'。由北京擎科生物公司合成。
[0027] PCR反应体系为25yL，反应液为：10 Xbuffer2.5yL，dNTPlyL，引物(F1和R1)各lyL， Taq酶0 ? 5yL，DNA模板lyL( 20ng)，ddH2018yL。
[0028] PCR扩增程序:94°C预变性 5min ;94°C变性45s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，进 行35个循环;72°C总延伸lOmin。
[0029] 4.PCR扩增产物在1%的琼脂凝胶中用1 XTAE buffer电泳分析，凝胶成像系统观察 条带大小。
[0030]结果鉴定:利用本发明的特异性引物，以不同地区田间采集菌株为模板，PCR扩增 结果如图2所示，1-9泳道扩增出特异性条带，扩增的特异性条带为CYP51C基因，其序列如 SEQ ID No: 1所示，与已知结果符合(禾谷镰刀菌，燕麦镰刀菌是小麦赤霉病的致病菌）。 [0031] 表1田间小麦菌株(麦粒)信息
三.麦粒的PCR扩增及结果 1.麦粒DNA提取 小麦麦粒采集信息见表1，取病麦粒，用液氮冻干并研磨粉碎，用CTAB法提取DNA。
[0032] 2.PCR扩增程序 致病镰刀菌的特异性引物为： 上游引物 Fl:5'_ ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG -3'； 下游引物Rl:5'_ TCAITCTACTGTCTCGCGTCGACG-3'。由北京擎科生物公司合成。
[0033] PCR反应体系为25yL，反应液为：10 Xbuffer2.5yL，dNTPlyL，引物(F1和R1)各lyL， Taq酶0 ? 5yL，DNA模板3yL( 20ng)，ddH2016yL。
[0034] PCR扩增程序:94°C预变性 5min ;94°C变性45s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，进 行35个循环;72°C总延伸lOmin。
[0035] 3.PCR扩增产物在1%的琼脂凝胶中用1 XTAE buffer电泳分析，凝胶成像系统观察 条带大小。
[0036]结果鉴定:利用本发明的特异性引物，以不同地区田间采集发麦粒为模板，PCR扩 增结果如图3，1-9泳道扩增出特异性条带，与已知结果符合。
[0037]以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施 例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替 换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种检测小麦赤霉病病原镰刀菌的特异性引物，其特征在于所述引物的序列为： FI:5，-ATGGAATCGCTCTACGAGACTCTG-3，； R1:5 '-TCATTCTACTGTCTCGCGTCGACG-3 '。2. 利用权利要求1所述的特异性引物检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特 征在于它包括以下步骤： (1)分离小麦中的病原菌； (2 )提取病原菌的基因组DNA; (3) PCR反应程序； (4) PCR扩增产物通过电泳分析，当PCR产物呈现1655 bp条带时，即检测到赤霉病病 原镜刀囷。3. 根据权利要求2所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于:所 述步骤(1)中的病原菌取自小麦麦粒或小麦染病组织。4. 根据权利要求3所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于:所 述步骤（1)中分离病原菌的步骤为;切取小麦染病组织，置于乙醇中浸泡，然后移入升汞溶 液中浸泡，再转移到无菌水中漂洗;最后将漂洗后的染病组织移至培养基上，进行培养3-5d〇5. 根据权利要求2所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于:所 述PCR反应的体系为25yL，反应液为：10 X buf f er 2.5yL，dNTP lyL，引物F1和R1各lyL，Taq 酶0.5yL，DNA 模板3yL，ddH20 16yL。6. 根据权利要求5所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于:所 述PCR反应的程序为:94°C预变性5min ;94°C变性45s，53°C退火45s，72°C延伸lmin，进行 35个循环；72°C总延伸lOmin。7. 根据权利要求2所述的检测小麦赤霉病病原镰刀菌的PCR检测方法，其特征在于:所 述1655bp的序列如SEQ ID No:l所示。8. 权利要求1所述的特异性引物在制备用于检测小麦赤霉病病原镰刀菌的试剂中的应 用。
【文档编号】C12N15/11GK105821141SQ201610338167
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】黄金光, 钱恒伟, 迟梦宇, 孙晓梅, 赵颖
【申请人】青岛农业大学