一种复合磁性纳米粒子Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>/MPS/PAA/NTA-Ni<sup>2+</sup>及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合磁性纳米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA?Ni2+及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用，属于纳米磁性材料和生物分析技术领域。本发明以平均水合粒径为100～400nm的Fe3O4磁性纳米粒为核，采用MPS表面修饰使其表面富含双键，通过PAA包覆得到平均水合粒径为100～600nm的多羧基结构磁性纳米粒子，然后进一步偶联NTA?Ni2+得到具有快速磁场响应性的复合磁性纳米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA?Ni2+。本发明制得的复合磁性纳米粒子可在纳米尺度上控制包覆层的厚度，制得的复合磁性纳米粒子尺寸分布均匀，磁性强，成本低，具有较高的富集和分离纯化组氨酸标签蛋白质的能力，对组氨酸标签蛋白质的纯化效率可高达40～70μg/mg复合磁性纳米粒子，且可重复使用。
【专利说明】
一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-N i2+及其制备方法 和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于纳米磁性材料和生物分析技术领域，具体涉及一种复合磁性纳米粒子 Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用。
【背景技术】
[0002] 传统的蛋白质分离纯化方法有电泳、层析、离心、透析、过滤等，其中金属螯合亲和 色谱方法被认为是最有效的方法之一。虽然金属螯合亲和色谱方法在组氨酸标签蛋白质分 离纯化方面有很多优势，但仍存在效率低、成本高、分离纯化步骤繁琐等缺点，从而无法达 到分离要求。金属螯合亲和色谱方法和磁分离技术相结合对蛋白质进行分离纯化已成为生 物医学研究以及生物工程技术领域的一个研究热点。它是通过对磁性纳米颗粒进行表面改 性，与能被目标蛋白质结合的配基偶联，利用外部磁场实现蛋白质的分离纯化。该法具有操 作简单、快速、高效富集和高重复使用率等优点。
[0003] 核壳结构复合磁性纳米粒子因具有分散性和稳定性好、易于表面功能化等优点得 到广泛应用。徐兵等采用NTA对铂铁合金纳米颗粒进行表面修饰，再螯合镍离子应用于分离 纯化组氨酸标签的重组蛋白，结果表明其纯化效率相比市售的商业磁性微球大大提高(Xu C，Xu K，Gu H,Zhong X,Guo Z，etal·Nitrilotriacetic Acid-Modified Magnetic Nanoparticles as a General Agent to Bind Histidine-Tagged Proteins · J. Am. Chem. Soc · 2004，126，3392 ·)，但由于合成的钼铁合金纳米颗粒只有10nm， 磁响应性较低，较难实现在外磁场操控下的快速吸附与移动，从而受到一定限制。美国专利 (USP4654267)公开了一种应用于蛋白质分离纯化的高分子磁性微球，但合成过程繁琐，所 得磁性微球的磁响应程度低。韩国的一个小组合成了修饰镍离子的磁性纳米粒子，成功的 应用于组氨酸标签蛋白质的分离纯化，但它的磁响应性很弱（2emu/g)，不利于提高蛋白质 的分离纯化效率。另外，Xie等以PEI为交联剂，在磁性纳米颗粒表面包覆上金壳，然后再用 NTA修饰并与Ni2+螯合，所得纳米复合物可以快速、选择性地分离出组氨酸标签蛋白质(Xie Η.-Y.,Zhen R.,etal.Fe3〇4/Au Core/Shel1 Nanoparticles Modified with Ni2+- Nitrilotriacetic Acid Specific to Histidine-Tagged Proteins , J. Phys. Chem. C2010,114,4825-4830.)，然而该纳米复合物表面单层结合组氨酸标签蛋白 质，吸附容量不高。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种复合磁性纳米粒子 Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用。本发 明制备方法简单，制得的Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子稳定性高、粒径分布 窄、可高效富集和快速分离纯化组氨酸标签蛋白质。
[0005] 为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明的一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+，是由磁性Fe3〇4纳米粒 子为核，通过MPS在其表面引入双键，再加入丙烯酸单体在Fe3〇4/MPS表面聚合形成聚丙烯酸 壳，最后与NTA-Ni2+偶联得到，所述复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的分子结构 式如下式一所示：
[0007]
[0008]其中：所述的MPS为(3_(异丁烯酰氧基)_丙基三甲氧基硅烷），所述的PAA为聚丙烯 酸，所述的NTA为次氮基三乙酸。
[0009] 进一步地，上述技术方案中所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+的 平均水合粒径为100nm~600nm。
[0010] 本发明的另一目的在于提供上述所述的复合磁性纳米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA- Ni2+的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0011 ]步骤一：溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：将六水合氯化铁 (FeCl3 · 6H20)、醋酸铵(NH4AC)和柠檬酸钠溶解于乙二醇中，在170°C下剧烈搅拌lh，冷却后 转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200°C反应8~16h，冷却至室温，磁分离或离心分离，将制得 的磁性Fe3〇4纳米粒子用无水乙醇洗涤3~4次后分散在无水乙醇中；
[00?2] 步骤二:采用MPS对磁性Fe3〇4纳米粒子进行表面改性，具体步骤如下:将步骤一制 得的Fe3〇4纳米粒子进行磁分离后分散在无水乙醇和超纯水中，混合搅拌，加入浓氨水和正 硅酸四乙酯(TE0S)，室温下搅拌2~6h;再加入MPS于70°C下反应3~10h，将所得产物进行磁 分离，得到Fe3〇4/MPS，用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，制得Fe3〇4/MPS的乙腈分散液； [0013] 所述的Fe304、TE0S、MPS、浓氨水质量之比为l:0·2~2:2~10:10~60。
[0014] 步骤三:制备核壳Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：取上述步骤二 制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入丙烯酸(AA)、N，N-亚 甲基丙稀酰胺(bis-AM)、偶氮二异丁腈(AIBN)，通N2混合搅拌10~20min，然后加热至40~ 60°C并在此温度下保持3~6h，将所得产物进行磁分离，得到Fe3〇4/MPS/PAA，再用无水乙醇 洗涤3~4次，最后分散在超纯水中；
[0015]所述的Fe304/MPS、丙烯酸、N，N_亚甲基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈的质量之比为1:2 ~10:0.1~1:0·01~0·1〇
[0016] 步骤四：Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤 三所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，分别加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐（EDC)和N-羟基丁二酰亚胺（NHS)，室温搅拌，再加入次氮基三乙酸 (ΝΤΑ)，室温搅拌20~28h，然后进行磁分离，将所得产物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)用去离子水洗 涤3次，最后分散在超纯水中，最后加入六水合氯化镍(NiCl2 · 6H2O)，室温搅拌0.5~4h，磁 分离，用去离子水洗涤3次后分散在结合缓冲液中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳 米粒子?63〇4/]\0^/?44/犯'4-附2+;
[0017] 所述的？63〇4/]\0^/?厶厶40(：、顺5、1^\的质量比为：卩63〇4/]\0^4^厶40(：:顺5 :1^\ = 1:2 ~5:2 ~5:0.2 ~1〇
[0018] 进一步地，上述技术方案中步骤一所述制得的磁性Fe3〇4纳米粒子的平均水合粒径 为100~400nm，分布系数(PDI)为0.01~0 · 2，Zeta电位为0~-30mv，制得的磁性Fe3〇4纳米粒 子具有较强的磁性，稳定性高，且在水溶液中具有良好的分散性。
[0019] 进一步地，上述技术方案中步骤三所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA磁性纳米粒子的平均 水合粒径为100~600nm，PDI为0.1~0.3，Zeta电位为0~-35mv〇
[0020] 进一步地，上述技术方案中步骤四所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+复合磁性 纳米粒子的平均水合粒径为100~600nm，PDI为0.1~0.3，Zeta电位为0~-15mv。
[0021 ]进一步地，上述技术方案中步骤四所述的六水合氯化镍的加入量为Fe3〇4/MPS/ PAA/NTA质量的5~50倍。
[0022]更进一步地，上述技术方案中所述的六水合氯化镍的浓度为0.1~1.0M。
[0023] 进一步地，上述技术方案中步骤四所述的结合缓冲液为含有500mM NaCl和5mM咪 唑的20mM PBS缓冲液，pH为7.4。
[0024] 本发明还一目的在于提供上述所述复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+在 分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用，具体应用方法为:首先采用结合缓冲液配制lmg/mL 的组氨酸标签蛋白质溶液，取配制好的蛋白质溶液于EP管中，加入所述Fe3〇4/MPS/PAA/NTA- Ni2+复合磁性纳米粒子，室温孵育0.5~4h，磁分离，采用洗脱缓冲液洗脱2~3次后，收集上 清液，包括原液和洗脱液，分别用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计检测蛋白质浓度，得到分 离纯化效率。
[0025] 所述的洗脱缓冲液为含有500禮他(：1和25〇1111咪唑的2〇1111?83缓冲液，？!1为7.4。
[0026] 所述的复合磁性纳米粒子?63〇4/^3^^/1^\-附2+与蛋白质的质量比为1:0.03~ 0.1。
[0027]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0028] (1)本发明是以平均水合粒径为100~400nm的Fe3〇4磁性纳米粒为核，采用MPS表面 修饰使其表面富含双键，通过PAA包覆得到平均水合粒径为100~600nm的多羧基结构磁性 纳米粒子，然后进一步偶联NTA-Ni2+得到具有快速磁场响应性的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/ MPS/PAA/NTA-Ni2+；
[0029] (2)本发明的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的平均水合粒径为100~ 600nm，通过镍离子与组氨酸残基作用实现了对组氨酸标签蛋白质的高效富集和快速分离 纯化，本发明能在30秒内完成蛋白质的磁分离过程，大大简化了纯化操作过程，并且大大提 高了对组氨酸标签蛋白质的结合效率；
[0030] (3)本发明采用复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+为载体，保证了在外磁 场作用下快速分离特性，使整个分离纯化过程简便、高效;而且，本发明采用了多羧基超支 化聚丙烯酸分子与NTA-Ni2+偶联，具有更高效螯合金属离子的能力，从而保证了对组氨酸标 签蛋白质的高效富集和纯化效率;经本发明制备得到的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/ NTA-Ni2+的平均水合粒径为100~600nm，对组氨酸标签蛋白质的纯化效率可高达40~70yg/ mg复合磁性纳米粒子，可作为一种新型高效的纯化蛋白载体。
【附图说明】
[0031]图1为本发明实施例4制得的Fe3〇4纳米粒子的透射电镜图；
[0032]图2为本发明实施例1制得的磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA的透射电镜图；
[0033]图3为本发明实施例1制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的透射电 镜图；
[0034]图4为本发明应用试验例3中Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+分离纯化目标蛋白质得到的 SDS-PAGE图，其中：Lane M:蛋白质分子量标记物;Lane 1:复合磁性纳米粒子进行分离前； Lane 2:复合磁性纳米粒子进行分离后;Lane 3:洗脱液;Lane4，5，6，7:重复使用4次的洗脱 液。
【具体实施方式】
[0035]以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理 解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0036] 本发明下述实施例1 -5中的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+，是由磁性 Fe3〇4纳米粒子为核，通过MPS在其表面引入双键，加入丙烯酸单体在Fe3〇4/MPS纳米粒子表 面聚合形成聚丙烯酸壳，然后与NTA-Ni2+偶联得到，所述复合磁性纳米粒子Fe3〇 4/MPS/PAA/ NTA-Ni2+的分子结构式如下式所示：
[0037]
[0038]其中：所述的MPS为(3_(异丁烯酰氧基)_丙基三甲氧基硅烷），所述的PAA为聚丙烯 酸，所述的NTA为次氮基三乙酸。
[0039] 实施例1
[0040] 本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒径为 247.9nm〇
[0041 ] 上述所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成， 包括如下步骤：
[0042] 步骤一：溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯 化铁(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸铵(NH4AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下剧烈搅拌lh，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200 °C，反应8h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe3〇4纳米粒子，将制得的产物用无 水乙醇洗涤3~4次，最后分散在无水乙醇中；
[0043] 上述制得的磁性核Fe3〇4纳米粒子平均水合粒径为147.6nm，分布系数（PDI)为 0· 126，Zeta 电位为 _24.5mv;
[0044] 步骤二:采用MPS对磁性Fe304纳米粒子进行表面改性(修饰），具体步骤如下：取含 30mg上述步骤一制得的Fe3〇4纳米粒子的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇， 10mL去离子水，混合搅拌，加入lmL密度为0.898g/mL的浓氨水和60yL密度为0.93g/mL的正 硅酸四乙酯（TE0S)，室温下搅拌4h;再加入90yL纯度为97 %、密度为1.045g/mL的MPS，在70 °C下反应5h，将所得产物进行磁分离后得到Fe3〇4/MPS，用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈 中，得到浓度为5mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0045] 步骤三:制备核壳Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下:将6mL上述步 骤二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入90yL纯度2 98%、密度为1.05g/mL的丙烯酸(AA)，0.01g N，N-亚甲基丙烯酰胺(bis-AM)、0.002g偶氮二 异丁腈(AIBN)，通犯混合搅拌15min，然后加热至50°C并在此温度下保持4h，将所得产物进 行磁分离，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在超纯水中；
[0046] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为207.3腦，^)1为0.196,26丨&电位为- 21.6mv；
[0047] 步骤四：Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入25mg 1-(3-甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌0.5h，然后加入25mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，搅拌 1.5h，室温搅拌，再加入4mg NTA，室温搅拌24h，将所得产物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)进行磁分 离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍20mL，室温搅拌2h， 磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，5mM 咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+;
[0048] 上述制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2 +的平均水合粒径为 247 · 9nm，PDI 为0 · 265，Zeta 电位为-12 · 7mv〇
[0049] 实施例2
[0050] 本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+的平均水合粒径为 338nm〇
[0051 ] 上述所述的复合磁性纳米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni 2+采用如下方法制备而成， 包括如下步骤：
[0052] 步骤一：溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯 化铁(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸铵(NH4AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下剧烈搅拌lh，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200 °C，反应10h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe3〇4纳米粒子，将制得的产物用 无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在无水乙醇中；
[0053] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒径为175.2nm，PDI为0.065,26丨 &电位为_ 27.7mv〇
[0054] 步骤二:采用MPS对磁性Fe304纳米粒子进行表面改性(修饰），具体步骤如下：取含 30mg上述步骤一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子 水，混合搅拌，加入lmL密度为0.898g/mL的浓氨水和60yL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯 (TE0S)，室温下搅拌4h;再加入90yL纯度为97 %、密度为1.045g/mL的MPS，在70 °C下反应5h， 将所得产物进行磁分离，得到Fe3〇4/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度 为4.5mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0055] 步骤三：制备核壳Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：将7mL上述步 骤二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入150yL纯度2 98%、密度为1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.018叱1亚甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 异丁腈(AIBN)，通犯混合搅拌15min，然后加热至55°C并在此温度下保持4h，将所得产物进 行磁分离，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在超纯水中；
[0056] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为328.5腦，^)1为0.169,26丨&电位为- 30.4mv；
[0057] 步骤四：Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入30mg 1-(3-甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌0.5h，然后加入30mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，搅拌 1.5h，室温搅拌，再加入5mg NTA，室温搅拌24h，将所得产物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)进行磁分 离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍20mL，室温搅拌 0.5h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液（20mM PBS，pH = 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2 + ，
[0058] 上述制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒径为338nm， 分布系数(PDI)为0.145,26七3电位为-11.811^。
[0059] 实施例3
[0060] 本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的平均水合粒径为 328.5nm〇
[0061 ] 上述所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成， 包括如下步骤：
[0062] 步骤一：溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯 化铁(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸铵(NH4AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下剧烈搅拌lh，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200 °C，反应12h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe3〇4纳米粒子，将制得的产物用 无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在无水乙醇中；
[0063] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒径为215.8随1，？01为0.022,26七3电位为- 9.79mv；
[0064]步骤二:采用MPS对磁性Fe304纳米粒子进行表面改性(修饰），具体步骤如下：取含 30mg上述步骤一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子 水，混合搅拌，加入0.5mL密度为0.898g/mL的浓氨水和30yL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙 酯(TE0S)，室温下搅拌4h;再加入120yL纯度为97 %、密度为1.045g/mL的MPS，在70 °C下反应 7h，将所得产物进行磁分离，得到Fe3〇4/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓 度为4.2mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0065] 步骤三:制备核壳Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下:将7mL上述步 骤二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入150yL纯度2 98%、密度为1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.018叱1亚甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 异丁腈(AIBN)，通犯混合搅拌15min，然后加热至50°C并在此温度下保持4h，将所得产物进 行磁分离，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在超纯水中；
[0066] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为321.7腦，^)1为0.169,26丨&电位为- 21.2mv；
[0067] 步骤四：Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入30mg(3-甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)搅拌0.5h，然后加入30mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS)，搅拌 1.5h，室温搅拌，再加入5mg NTA，室温搅拌24h，将所得产物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)进行磁分 离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍10mL，室温搅拌 0.5h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液（20mM PBS，pH = 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2 + ，
[0068] 上述制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2 +的平均水合粒径为 328.5歷，分布系数(？01)为0.231，26七3电位为-6.311^。
[0069] 实施例4
[0070] 本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的平均水合粒径为 433.9nm〇
[0071 ] 上述所述的复合磁性纳米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni 2+采用如下方法制备而成， 包括如下步骤：
[0072] 步骤一：溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯 化铁(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸铵(NH4AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下剧烈搅拌lh，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200 °C，反应16h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe3〇4纳米粒子，将制得的产物用 无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在无水乙醇中；
[0073] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒径为322.3nm，PDI为0.137，Zeta电位为- 13.39mv；
[0074]步骤二:采用MPS对磁性Fe304纳米粒子进行表面改性(修饰），具体步骤如下：取含 30mg上述步骤一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子 水，加入1.5mL密度为0.898g/mL的浓氨水)和50yL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TE0S)， 室温下搅拌4h;再加入150yL纯度为97 %、密度为1.045g/mL的MPS，在70 °C下反应4h，将所得 产物进行磁分离，得到Fe3〇4/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为 4.5mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0075] 步骤三:制备核壳Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下:将7mL上述步 骤二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入180yL纯度2 98%、密度为1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.018叱1亚甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 异丁腈(AIBN)，通犯混合搅拌15min，然后加热至50°C并在此温度下保持6h，将所得产物进 行磁分离，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在超纯水中；
[0076] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为426.4nm，roi为0.212，Zeta电位为- 20mv;
[0077] 步骤四：Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入40mg(3-甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)搅拌0.5h，然后加入40mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS)，搅拌 1.5h，室温搅拌，再加入7mg NTA，室温搅拌28h，将所得产物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)进行磁分 离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍15mL，室温搅拌lh， 磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，5mM 咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+;
[0078] 上述制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni2 +的平均水合粒径为 433 · 9nm，PDI 为0 · 287，Zeta 电位为-4.3mv〇
[0079] 实施例5
[0080] 本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni2+的平均水合粒径为 561nm〇
[0081 ] 上述所述的复合磁性纳米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+采用如下方法制备而成， 包括如下步骤：
[0082] 步骤一：溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯 化铁(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸铵(NH4AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下剧烈搅拌lh，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200 °C，反应16h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe3〇4纳米粒子，将制得的产物用 无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在无水乙醇中；
[0083] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒径为285.6nm，PDI为0.176,26七&电位为_ 15.4mv；
[0084] 步骤二:采用MPS对磁性Fe304纳米粒子进行表面改性(修饰），具体步骤如下：取含 30mg上述步骤一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子 水，加入lmL密度为0 · 898g/mL的浓氨水)和60yL密度为0 · 93g/mL的正硅酸四乙酯(TE0S)，室 温下搅拌4h;再加入150yL纯度为97 %、密度为1.045g/mL的MPS，在70 °C下反应6h，将所得产 物进行磁分离，得到Fe3〇4/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为4.3mg/ mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0085] 步骤三:制备核壳Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下:将7mL上述步 骤二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入200yL纯度2 98%、密度为1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.028叱1亚甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 异丁腈(AIBN)，通犯混合搅拌15min，然后加热至60°C并在此温度下保持4h，将所得产物进 行磁分离，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3~4次，最后分散在超纯水中；
[0086] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为517.1nm，roi为0.227,2〇丨&电位为_ 24.5mv；
[0087] 步骤四：Fe3〇4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA_Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入50mg(3-甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)搅拌0.5h，然后加入50mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS)，搅拌 1.5h，室温搅拌，再加入10mg NTA，室温搅拌24h，将所得产物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)进行磁分 离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍20mL，室温搅拌2h， 磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，5mM 咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+;
[0088] 上述制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒径为561nm， PDI 为0 · 265，Zeta 电位为_3 · 39mv。
[0089] 应用试验例1
[0090] 将上述实施例1制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+应用于分离纯 化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下:取lmg组氨酸标签蛋白质，溶解于lmL结合缓冲液 中（20mM PBS，pH= 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得浓度为lmg/mL的组氨酸标签蛋白质 溶液;取50yL所述组氨酸标签蛋白质溶液于EP管中，加入上述实施例1制得的含lmg复合磁 性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的悬浮液，室温孵育2h，磁分离，用洗脱缓冲液（20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脱2~3次，收集上清液包括原液和分离液，分别用 SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)检测蛋白质浓度。
[0091]经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为40yg/mg磁性纳米粒 子。
[0092] 应用试验例2
[0093] 将上述实施例2制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+应用于分离纯 化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下:取lmg组氨酸标签的蛋白质，溶解于lmL结合缓冲 液中（20mM PBS，pH=7 · 4，500mM NaCl，5mM咪唑）中制得浓度为lmg/mL的组氨酸标签蛋白质 溶液;取50yL所述组氨酸标签蛋白质溶液于EP管中，加入含lmg上述实施例2制得的复合磁 性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的悬浮液，室温孵育3h，磁分离，用洗脱缓冲液（20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脱2~3次，收集上清液包括原液和分离液，分别用 SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)检测蛋白质浓度。
[0094]经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为47yg/mg磁性纳米粒 子。
[0095] 应用试验例3
[0096] 将上述实施例3制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+应用于分离纯 化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下：
[0097] 取lmg组氨酸标签的蛋白质，溶解于lmL结合缓冲液中（20mM roS，pH = 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得浓度为lmg/mL的组氨酸标签蛋白质溶液;取50yL所述组氨酸标签蛋 白质溶液于EP管中，加入含lmg上述实施例3制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA- Ni2+的悬浮液，室温孵育4h，磁分离，用洗脱缓冲液（20mM PBS，pH = 7.4，500mM NaCl，250mM 咪唑)洗脱2~3次，收集上清液包括原液和分离液，分别用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计 (NANODROP 2000c，Thermo，U· S·A)检测蛋白质浓度。
[0098]经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为53yg/mg磁性纳米粒 子。
[0099] 应用试验例4
[0100] 将上述实施例4制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+应用于分离纯 化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下:取lmg组氨酸标签的蛋白质，溶解于lmL结合缓冲 液中（20mM roS，pH = 7 · 4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得浓度为lmg/mL的组氨酸标签蛋白 质溶液;取50yL所述组氨酸标签蛋白质溶液于EP管中，加入含lmg上述实施例4制得的复合 磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的悬浮液，室温孵育2h，磁分离，用洗脱缓冲液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脱2~3次，收集上清液包括原液和分离液，分别用 SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)检测蛋白质浓度。
[0101]经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为60yg/mg磁性纳米粒 子。
[0102] 应用试验例5
[0103] 将上述实施例5制得的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+应用于分离纯 化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下:取lmg组氨酸标签蛋白质，溶解于lmL结合缓冲液 中（20mM PBS，pH= 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得浓度为lmg/mL的组氨酸标签蛋白质 溶液;取50yL所述组氨酸标签蛋白质溶液于EP管中，加入含lmg上述实施例5制得的复合磁 性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的悬浮液，室温孵育4h，磁分离，用洗脱缓冲液（20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脱2~3次，收集上清液包括原液和分离液，分别用 SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)检测蛋白质浓度。
[0104]经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为65yg/mg磁性纳米粒 子。
[0105] 另外，本发明还采用动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS90)对实施例1制备 的磁性纳米粒子的平均粒径、分布系数和Zeta电位进行测定，结果见表1。表1结果表明，随 着磁性核Fe3〇4表面被包覆，其平均粒径逐渐增大，且PDI均小于0.3，这说明该纳米粒子尺寸 分布窄，具有单分散性;另外，Zeta电位都为负值，由于静电相斥作用，该磁性纳米粒子不易 聚集，因此具有较好的稳定性。由此可见，本专利所得复合磁性纳米粒子具有较好的纳米特 性，满足生物医学应用的要求。
[0106] 表1实施例1制得的磁性纳米粒子的平均粒径、分布系数(PDI)和Zeta电位
[0107]
【主权项】
1. 一种复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2%其特征在于:所述复合磁性纳米粒 子是由磁性Fe3〇4纳米粒子为核，通过MPS在其表面引入双键，再加入丙締酸单体在Fe3〇4/ MPS表面聚合形成聚丙締酸壳，最后与NTA-Ni2+偶联得到，所述复合磁性纳米粒子Fe3〇4/ MPS/PAA/NTA-Ni2+的分子结构式如下式一所示：其中：所述的MPS为(3-(异下締酷氧基)-丙基Ξ甲氧基硅烷），所述的PAA为聚丙締酸， 所述的NTA为次氮基Ξ乙酸。2. 根据权利要求1所述的复合磁性纳米粒子化3化/MPS/PAA/NTA-Ni2%其特征在于:所述 的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒径为100皿~600皿。3. -种根据权利要求1或2所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制备方 法，其特征在于:所述方法包括如下步骤： 步骤一:溶剂热法制备磁性Fe3〇4纳米粒子，具体步骤如下：将六水合氯化铁、醋酸锭和 巧樣酸钢溶解于乙二醇中，在170°C下剧烈揽拌化，冷却后转移至聚四氣乙締反应蓋中，于 200°C反应8~16h，冷却至室溫，磁分离或离屯、分离，将制得的磁性化3〇4纳米粒子用无水乙 醇洗涂3~4次后分散在无水乙醇中； 步骤二:采用MPS对磁性Fe3〇4纳米粒子进行表面改性，具体步骤如下:将步骤一制得的 Fe3化纳米粒子进行磁分离后分散在无水乙醇和超纯水中，混合揽拌，加入浓氨水和正娃酸 四乙醋，室溫下揽拌2~化;再加入MPS于70°C下反应3~lOh，将所得产物进行磁分离，得到 化304/MPS，用无水乙醇洗涂3次后分散在乙腊中，制得化304/MPS的乙腊分散液； 所述的化3〇4、了605、]\0^、浓氨水质量之比为1:0.2~2:2~10:10~60。 步骤Ξ:制备核壳化地4/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：取上述步骤二制得 的化304/MPS的乙腊分散液转移至Ξ口烧瓶中，超声分散，依次加入丙締酸、N，N-亚甲基丙締 酷胺、偶氮二异下腊，通化混合揽拌10~20min，然后加热至40~60°C并在此溫度下保持3~ 6h，将所得产物进行磁分离，得到Fe3〇4/MPS/PAA，再用无水乙醇洗涂3~4次，最后分散在超 纯水中； 所述的化3化/MPS、丙締酸、N，N-亚甲基丙締酷胺、偶氮二异下腊的质量之比为1:2~10: 0.1 ~1:0.01 ~0.1。 步骤四：Fe3化/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni2+偶联，具体步骤如下：取步骤Ξ所 述制得的化304/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，分别加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐和N-径基下二酷亚胺，室溫揽拌，再加入次氮基Ξ乙酸，室溫揽拌20~2她，然 后进行磁分离，将所得产物化3〇4/mps/paa/nta用去离子水洗涂3次，最后分散在超纯水中， 最后加入六水合氯化儀，室溫揽拌0.5~4h，磁分离，用去离子水洗涂3次后分散在结合缓冲 液中，于4°C下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+; 所述的Fe3〇4/MPS/PAA、l-(3-甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-径基下二酷亚 胺、次氮基Ξ乙酸的质量比分别为1:2~5:2~5:0.2~1。4. 根据权利要求3所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制备方法，其特 征在于:步骤一所述制得的磁性化3〇4纳米粒子的平均水合粒径为100~400nm，分布系数PDI 为 0.01 ~0.2，Ze1:a 电位为 0 ~-30mv。5. 根据权利要求3所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制备方法，其特 征在于:步骤Ξ所述制得的化304/MPS/PAA磁性纳米粒子的平均水合粒径为100~600nm，分 布系数PDI为0.1~0.3，Ze化电位为0~-35mv。6. 根据权利要求3所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制备方法，其特 征在于:步骤四所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+复合磁性纳米粒子的平均水合粒径为 100~600nm，分布系数PDI为0.1~0.3，Ze化电位为0~-15mv。7. 根据权利要求3所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制备方法，其特 征在于:步骤四所述的六水合氯化儀的加入量为化304/MPS/PAA/NTA质量的5~50倍。8. -种根据权利要求1所述的复合磁性纳米粒子Fe3化/MPS/PAA/NTA-Ni2+在分离纯化组 氨酸标签蛋白质中的应用，其特征在于:首先采用结合缓冲液配制Img/mL的组氨酸标签蛋 白质溶液，取配制好的蛋白质溶液于EP管中，加入所述化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+复合磁性纳 米粒子，室溫解育0.5~地，磁分离，采用洗脱缓冲液洗脱2~3次后，收集上清液，包括原液 和洗脱液，分别用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计检测蛋白质浓度，得到分离纯化效率。9. 根据权利要求8所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+在分离纯化组氨酸 标签蛋白质中的应用，其特征在于：所述的洗脱缓冲液为含有500mM化C1和250mM咪挫的 20mM PBS缓冲液，pH值为7.4。10. 根据权利要求8所述的复合磁性纳米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+在分离纯化组氨 酸标签蛋白质中的应用，其特征在于:所述的复合磁性纳米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+与 蛋白质的质量比为1:0.03~0.1。
【文档编号】C08F222/38GK105837766SQ201610163717
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月22日
【发明人】郭惠玲
【申请人】湖北工业大学