枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用【专利摘要】本发明涉及枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，可作为抑菌剂的有效成分，在葡萄酒酿造过程中促进酒精发酵阶段的酵母生长和酯类与酸类物质合成，抑制OTA合成，并且可以有效抑制曲霉、青霉、葡萄穗菌的生长，有效去除皮渣和酒液中的霉菌污染，并降低酒液中OTA残留量，对成品酒的感官品质提升有一定作用，在葡萄酒生产中作为抑菌剂的有效成分有着很好的应用潜力。CCTCCNO：M20720920071228【专利说明】枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用
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[0001]本发明属于生物
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，具体涉及枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒生产中的用途。【
背景技术：
】[0002]目前，S02是唯一在葡萄酒生产中普遍应用的添加剂。S02在葡萄酒工艺中的作用一般具有选择性杀菌，作为一种杀菌剂，不同微生物对S02的耐受力是有不同的，其中细菌最为敏感，加入so2后最先被杀死，起到抑菌作用，同时，酿酒酵母对so2耐受力则比较强，可以通过so2来选择发酵微生物，同时通过抑制微生物活动，推迟发酵开始时间，从而有利于发酵基质中悬浮物的沉淀，净化发酵基质，此外，so2还可以抑制氧化酶，调节发酵基质达到合适的酸度，改善葡萄酒的味甘质量，因此，合理适量使用二氧化硫，可以对葡萄酒的成分和质量产生相当程度的积极影响，在葡萄酒生产中发挥着巨大的作用，但是过量和不当使用也会带来一些问题，尤其是二氧化硫对人体的健康影响日益受人重视，因此葡萄酒科研和生产实践中也在不断研究尝试减少二氧化硫的使用。一方面是更加严格的工艺环境控制，一方面是为其寻找替代品，遗憾的是，至今人们仍然没有找到同so2-般高效、廉价，能够充分达到so2工艺效果的替代添加剂或添加剂组合。[0003]也有关于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的相关报道，但是，目前，枯草芽孢杆菌作为重要的植物根围促生细菌(PGPR)，在植物病害生物防治中起重要作用。枯草芽孢杆菌能够防治植物病害源于其能够产生多种抗菌物质，但是，从未见报道将枯草芽孢杆菌作为S02的替代品，能够有效抑制葡萄酒发酵前期的炭黑曲霉等污染。【
发明内容】[0004]为了克服上述葡萄酒生产中所存在的问题，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒生产中的应用，其能够有效抑制葡萄酒发酵过程中的霉菌以及炭黑曲霉的污染以及0ΤΑ的合成且抑菌效果良好，能够改善葡萄酒的品质与口感。[0005]本发明涉及的枯草芽孢杆菌保藏名称为:Bacillussubtilis421，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2007年12月28日，保藏号：CCTCCΝ0:Μ207209。[0006]枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，可作为抑菌剂的有效成分，在葡萄酒酿造过程中促进酒精发酵阶段的酵母生长和酯类与酸类物质合成，抑制0ΤΑ合成，并且抑菌。[0007]上述枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中可以有效抑制曲霉、青霉、葡萄穗菌的生长。[0008]上述枯草芽孢杆菌抑菌脂肽的添加量是200~400mg/L。[0009]本发明的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒生产中能够有效抑制葡萄酒发酵过程中的0ΤΑ产生菌，以及其它霉菌的污染，并且其抑菌效果优于50mg/L的二氧化硫，有效去除皮渣和酒液中的霉菌污染，并降低酒液中OTA残留量，同时，枯草芽孢杆菌抑菌脂肽能够促进酒精发酵过程中的酵母生长和酯类与酸类物质的合成，对成品酒的感官品质提升有一定作用，在葡萄酒生产中作为抑菌剂的有效成分有着很好的应用潜力。【附图说明】[0010]图1为各样品在自然发酵中黑色曲霉的污染量对比图。[0011]图2为各样品在自然发酵中其他霉菌的污染量对比图。[0012]图3为各样品在添加炭黑曲霉发酵中炭黑曲霉的污染量对比图。[0013]图4为各样品在添加炭黑曲霉发酵中其他霉菌的污染量对比图。[0014]图5为各样品在自然发酵过程中酵母生长量对比图。[0015]图6为各样品在自然发酵过程中可溶性固形物含量对比图。[0016]图7为各样品在自然发酵过程中还原糖含量对比图。[0017]图8为各样品在自然发酵过程中酒精含量对比图。[0018]图9为各样品在自然发酵过程中总酸含量对比图。[0019]图10为各样品在自然发酵过程中甘油含量对比图。[0020]图11为各样品在自然发酵过程中果糖含量对比图。[0021]图12为各样品在自然发酵过程中葡萄糖含量对比图。[0022]图13为各样品在自然发酵过程中葡萄糖0ΤΑ产量对比图。[0023]图14为未添加炭黑曲霉时各样品所得葡萄酒挥发性物质种类及其相对含量对比图。【具体实施方式】[0024]现结合附图和实验数据对本发明的技术方案进行进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施情形。[0025]实施例选取的原料葡萄是采集于陕西省径阳县赤霞珠酿酒葡萄（CabernetSauvignon)，固形物含量为23°Brix，还原糖含量250.10g/L，pH值为3·54,总酸（以酒石酸计)含量为6.19g/L，用于发酵干红葡萄酒(v/v，12%)。[0026](1)枯草芽孢杆菌抑菌脂肽的制备[0027]枯草芽孢杆菌发酵液发酵40~48h后，6000rpm，10min离心去除菌体，上清液缓慢搅拌加入饱和度为60%的硫酸铵粉末，待其全部溶解后，4°C过夜静置，lOOOOrpm离心10min收集沉淀，将沉淀用适量的浓度为0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解，并用透析袋(截留量为l〇〇〇Da)除盐。若浓度过低，则采用聚乙二醇8000浓缩，或将得到的蛋白液真空冷冻干燥成粉末状，_20°C保存，即得盐析样品。对得到的盐析样品先调节pH值为3.0,在121°C处理30min，将样品真空冷冻得到干粉，即为抑菌脂肽粗品，4°C放置备用。[0028]实施例中所用枯草芽孢杆菌保藏名称为:Bacillussubtilis421，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2007年12月28日，保藏号：CCTCCΝ0:Μ207209。[0029](2)酿酒酵母菌液的制备[0030]将保存于斜面的酿酒酵母菌SP划线接种于YH)固体培养基上，28°C培养48h后，用接种环挑取2环接种于YEH)液体培养基中，160rpm/min摇床培养48h后，离心收集菌体，用灭菌的蒸馏水冲洗菌体2-3次，用血球计数板对得到的酵母菌液计数并调整至1X108菌/mL，_4°C放置，备用。[0031](3)枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造过程中的应用[0032]干红葡萄酒的酿造过程采用目前酒厂普遍使用的酿酒操作步骤，具体参考Grazioli等(2006)和Leong等(2006b)报道的方法。[0033](3.1)将葡萄除梗破碎，得到葡萄汁、葡萄皮和葡萄籽的混合物(pomaces)。每个处理采用7kg的葡萄，破碎后装入10L的广口玻璃罐中发酵。[0034](3.2)向葡萄汁混合物中添加枯草芽孢杆菌抑菌脂肽和果胶酶、酿酒酵母，枯草芽孢杆菌抑菌脂肽的添加量为200~400yg/mL，果胶酶的添加量为40mg/L，酿酒酵母的添加量为200mg/L，酿酒酵母粉需提前放在38~40°C的水浴锅中活化1~2h。[0035](3.3)由于葡萄本身的还原糖含量为160g/L，不足以发酵得到酒精度为12%(v/v)的葡萄酒，在发酵24h后，每lkg葡萄汁混合物需补加42g蔗糖。[0036](3.4)浸渍(maceration)和酒精发酵，控制发酵罐的温度在20~25°C之间，发酵3~6天后，进行皮渣分离操作，先将底层的液体用导管引入新的罐中，再用无菌纱布将剩余的葡萄皮和葡萄籽等固体与发酵液分离，酒精发酵结束后，可进行第一次倒罐，去除酒渣。[0037]添加抑菌脂肽的原理与常规工艺中添加S02时相同，根据葡萄的重量和出汁率，以及所需的浓度计算出所需要的抑菌脂肽重量或体积。[0038]本发明的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造过程中的可促进酒精发酵阶段的酵母生长和酯类与酸类物质合成，抑制0ΤΑ合成，并且有效抑制曲霉、青霉、葡萄穗菌等产毒霉菌的生长，还可以作为葡萄酒抑菌剂的有效活性成分。[0039]其中，酯类物质具体是：乙酸乙酯(EthylAcetate)、乙酸异丁酯(Aceticacid,2-methylpropylester)、丁酸乙酯（Butanoicacid,ethylester)、2_甲基丁酸乙酯(Butanoicacid,2-methyl-,ethylester)、异戊酉爱乙酯（Butanoicacid,3-methyl-,ethylester)、乙酸异戊酯（1-Butanol，3-methyl-，acetate)、丙酸正戊酯（Propanoicacid,pentylester)、正己酉爱乙酯（Hexanoicacid,ethylester)、乙酉爱己酯（Aceticacid，hexylester)、辛酸乙酯（Octanoicacid,ethylester)、癸酸乙酯（Decanoicacid,ethylester)、丁二酸二乙酯（Butanedioicacid,diethylester)、乙酸苯乙酯（Aceticacid，2_phenylethylester)、月桂酸乙酯（Dodecanoicacid,ethylester)、十六酸乙酯(Hexadecanoicacid,ethylester)等。[0040]酸类物质具体是：乙酸（Aceticacid)、异丁酸（Propanoicacid,2-methyl-)、己酸（Hexanoicacid)、辛酸（OctanoicAcid)等。[0041]为了验证上述效果，将本发明的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽与s〇2对葡萄酒酿造的影响进行对比，具体如下：[0042]选择浓度为200yg/mL和400yg/mL的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽(简称抑菌脂肽），添加到不同酿酒体系中，统一添加40mg/L果胶酶和200mg/L酵母菌以外，其它处理方法如表1所不。[0043]具体分为三大类处理：（1)二氧化硫处理组，模拟常规葡萄酒发酵过程:加入50mg/L二氧化硫，无炭黑曲霉(A)和有加炭黑曲霉(F);(2)单独的抑菌脂肽类处理组:在无炭黑曲霉时，单独使用不同浓度的抑菌脂肽(B、C、D);以及在有炭黑曲霉时，单独使用不同浓度的抑菌脂肽(E、G、H);(3)二氧化硫与脂肽共同处理组：分别在无炭黑曲霉（I)和有炭黑曲霉(J)存在时，同时添加二氧化硫和脂肽。[0044]对于各处理，样品采集从未破碎的葡萄（记为Oh)开始直到酒精发酵结束（192h)。其中，主要采样点和操作有Oh-葡萄果粒;3h-除梗破碎;8h-添加S02或抑菌脂肽、果胶酶、酿酒酵母和炭黑曲霉090614(AspergilluscarbonariusCCTCCAF2011004,菌株分离自葡萄表面，产生0ΤΑ能力较强，现保存于中国典型培养物保藏中心）；24-144h酒精发酵过程采样;168h-皮渣分离操作；192h-酒精发酵结束。[0045]表1酿酒过程各处理组添加物及其含量[0046][0047](1)对霉菌污染的影响[0048]按照酿酒葡萄表面真菌数量的统计方法（Abrunhosaetal.2001;PittandHocking2009)对表1中各处理样品的真菌污染量总数进行测定，结果参见图1~4。[0049]如图1和3所示，在所有处理和对照中，黑色曲霉污染量均在发酵开始的前12小时内快速增加，之后迅速下降，对不进行任何处理的对照相比，抑菌脂肽能够显著抑制这些黑色曲霉的前期增长，并加速其后期的降低速度，增大其降低幅度;而二氧化硫虽然也能促进黑色曲霉污染量的降低，但其对黑色曲霉的前期生长会有一定的促进作用；二氧化硫的使用会在一定程度上削弱抑菌脂肽对这些霉菌前期生长的抑制作用。对青霉菌、葡萄穗菌等其它霉菌而言（图2和4可知），与对照相比，二氧化硫和抑菌脂肽均可显著抑制霉菌的生长，导致其在发酵过程中迅速下降，而且其抑制效果随抑菌脂肽浓度的增大而增强，二氧化硫与抑菌脂肽复合使用时，对于这些霉菌的抑制作用有协同效应。由此说明，抑菌脂肽在整个发酵过程中对黑色曲霉和其它类霉菌的污染量都具有较好的控制作用，效果优于单独添加S〇2的处理。[0050](2)对酵母生长的影响[0051]在自然发酵过程中对上述各处理样品的酵母生长情况进行检测，结果如图5所示。[0052]由图5可知，与不进行任何处理的对照相比，所有抑菌脂肽处理对发酵过程中的酵母菌生长均表现为前期抑制，后期促进，并且其作用程度表现为一定的浓度依赖性;二氧化硫则表现为前期促进，后期抑制；二氧化硫与抑菌脂肽复配使用，总体表现为前期促进，后期增加酵母菌总量。[0053](3)对葡萄酒的可溶性固形物含量、还原糖含量、酒精含量和总酸含量的影响[0054]参照GBT15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对表1中各样品所得葡萄酒的酒精含量、还原糖含量进行测定，采用手持糖度计法对其可溶性固形物含量进行测定，采用pH计测定各样品的pH，结果分别如图6(可溶性固形物含量）、图7(还原糖含量）、图8(酒精含量)和图9(总酸含量）。[0055]由图6~9表明，与不进行任何处理的对照相比，抑菌脂肽处理均能降少发酵液中的固形物和还原糖消耗量，以及同时期乙醇的合成量;而二氧化硫的使用对这些指标无显著影响，但其与抑菌脂肽混合使用时，可以在一定程度上缓解抑菌脂肽对上述指标的降低作用。同时，抑菌脂肽对发酵液中总酸含量的影响表现为早期降低，后期增加，终产品时无显著差异;二氧化硫的影响与之相反，但发酵结束后各处理间均无显著差异。[0056](4)对葡萄酒液中甘油、果糖和葡萄糖的影响[0057]参照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2544-2010《甘油含量的测定高效液相色谱法》对表1中各处理样品所得葡萄酒中的甘油、葡萄糖和果糖含量进行测定，结果如图10(甘油含量）、图11(果糖含量)以及图12(葡萄糖含量)所示。[0058]由图10~12表明，与不进行任何处理的对照相比，抑菌脂肽的使用对发酵前期的甘油合成有抑制作用，但对其后期积累有促进作用，并以二氧化硫与抑菌脂肽复配使用的促进作用最大;二氧化硫则对发酵液中甘油的早期合成和终产品的积累有降低作用。抑菌脂肽的使用对发酵液中果糖的消耗表现为早期增强，后期减弱；二氧化硫则在早期和后期均表现为延缓作用，但作用不明显。二氧化硫对发酵过程中葡萄糖消耗无显著影响;抑菌脂肽则表现为低深度促进，高深度抑制；与二氧化硫的混合使用则对这种抑制作用有一定的抵消作用。[0059](5)对0ΤΑ合成的影响[0060]按照常规提取方法对表1中各处理样品在酿造过程中的0ΤΑ含量进行提取，并采用HPLC荧光检测法进行检测，所得结果如图13所示。[0061]由图13可知，与不进行任何处理的对照相比，二氧化硫和抑菌脂肽均可显著降低终最产品中0ΤΑ污染量，但二氧化硫在前期会促进0ΤΑ合成，而抑菌脂肽则不会。同时，二氧化硫会在一定程度上降低抑菌脂肽对0ΤΑ合成的抑制和去除作用。相对而言，高浓度抑菌脂肽对0ΤΑ早期合成的抑制作用更为明显。然而，从酒精发酵结束后的最终结果来看，所有处理和对照在酒精发酵结束后的0ΤΑ含量均能降低到比较相近的最低水平。[0062](6)对皮渣和发酵液中霉菌污染量和0ΤΑ含量的影响[0063]表2不同处理的皮渣中曲霉菌污染量及其0ΤΑ含量[0064][0065]a_，未检测到；b+，检测到detectable;。土，三个重复的标准差；[0066]如表2所示，所有含有抑菌脂肽的处理(包括抑菌脂肽与二氧化硫的混合使用）和对照中，经皮渣分离以后，上清液和皮渣中均无霉菌污染检出，说明抑菌脂肽的使用可以完全消除葡萄酒加工废弃料中霉菌带来的二次污染。然而，二氧化硫反倒会增加霉菌在皮渣中的残留量。就0ΤΑ残留量而言，无任何处理的酒液和皮渣中均有较高的0ΤΑ浓度，而二氧化硫的使用可以降低酒液中0ΤΑ含量，但增加了皮渣中0ΤΑ含量;抑菌脂肽则可以同时降低酒液和皮渣中0ΤΑ残留量。由此说明，二氧化硫对于霉菌污染和0ΤΑ产生的抑制作用均不如抑菌脂肽。[0067](7)对葡萄酒挥发性物质种类及其相对含量的影响[0068]用固相顶空微萃取-气相色谱和质谱联用仪（Headspacesolidphasemicroextractioncoupledtogaschromatographymassspectrometer?HS-SPME-GC-MS)测定表1中不同处理条件下得到的葡萄酒样品中挥发性物质的种类和含量，具体方法参照Rodriguez-Bencomo等（2011)报道。检测结果见图14。[0069]由图14可知，在无炭黑曲霉添加时，二氧化硫的使用增加了酒中醇类含量，但降低了酒中酯类、酸类、烷烃类含量;抑菌脂肽处理则可以降低酒中醇类和烷烃类含量，同时增加酯类和酸类物质含量，相对不经任何处理组，二氧化硫和抑菌脂肽的使用能够增加酒中醇类含量，降低酒中酯类和酸类物质含量。由此说明抑菌脂肽的使用有助于促进酒中酯类和酸类等物质的合成，而降低酒中醇类物质合成。【主权项】1.枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中作为抑菌剂的有效成分的应用。3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中促进酒精发酵阶段的酵母生长和酯类与酸类物质合成的应用。4.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中抑制OTA合成的应用。5.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中抑菌的应用。6.根据权利要求5所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中抑制曲霉、青霉、葡萄穗菌。7.根据权利要求1~6任一项所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：枯草芽孢杆菌的名称为Bacillussubtilis421，保藏编号为：CCTCCNO:M207209,保藏日期为2007年12月28日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。8.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌抑菌脂肽在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌抑菌脂肽的添加量是200~400mg/L。【文档编号】C12G1/022GK105838534SQ201610369346【公开日】2016年8月10日【申请日】2016年5月30日【发明人】师俊玲,蒋春美【申请人】西北工业大学