一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字pcr定量方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，包括：(1)制备微柱阵列芯片；(2)抽取表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球，稀释后分步加入到目标磁珠的悬浊液中孵育，富集微球磁珠复合物，重悬；(3)取步骤(2)中的微球磁珠复合物的重悬液，通入到装置中冲洗，通过统计芯片上截留的微球磁珠复合物，得到目标磁珠的个数，从而达到对核酸高灵敏定量的目的。本发明芯片组装简单，成本低；在保留了BEAMing实验高灵敏度特点的同时使得BEAMing技术的目标磁珠计数方法更加方便易行，为核酸的高灵敏检测提供了一个简便、快速的实用工具。
【专利说明】
一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法
技术领域
[0001] 本发明属于乳滴数字PCR领域，特别涉及一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数 字PCR定量方法。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(PCR反应)是现代分子生物学实验的核心技术，其特异性扩增目 的核酸片段的方法提高了核酸分子检测的灵敏度，在诸多生物研究和疾病诊断中起着重要 的作用。根据PCR反应扩增原理衍生出了许多核酸定量技术，其中BEAMing(beads， emulsion,amplification,and magnetics)是一种基于磁珠固相扩增的乳滴数字PCR技术 [D.Dressman,H.Yan,G.Traverso,et.al.,Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2003，100:8817- 8822]。其基本流程是将修饰有引物的磁珠和单个靶标分子单独包裹在一个油包水腔体中， 靶标分子在磁珠表面进行复制，之后对乳滴破乳，收集磁珠并与统计有核酸扩增的磁珠个 数。通过扩增反应，BEAMing可以将单个靶标分子转化为单个磁珠表面上的上万个靶标分子 拷贝，放大了靶标分子的信号。由于单个靶标分子仅在一个磁珠表面进行扩增，一个目标磁 珠对应一个靶标分子拷贝，检测目标磁珠个数就可以了解溶液中靶标分子的拷贝数 [F.Diehl，M.Li，Y.He，et al.,BEAMing:single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions [J] .Nature Methods，2006，3:551_559 · ]DBEAMing 实验中的乳液 可以在普通的PCR仪中进行扩增，扩增出的目的产物可以分离提纯回收，因此在实验上更加 灵活和方便。
[0003]目前，BEAMing技术已被用于突变和mRNA等核酸片段的定量检测[X.Shi，C.Tang， ff.ffang,et al.,Digital quantification of gene expression using emulsion PCR [J]·Electrophoresis，2010,31:528-534.]、[Y.Tong，W·Zhu，X·Huang，et al·，PCR amplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion: application for high-throughput screening of transcription factor targets[J] .Nucleic Acids Research，2005,33(17):150.]、[I.Ti emann-Boege，C·Curt i s， D.N.Shinde,et al.,Product length,dye choice,and detection chemistry in the bead-emulsion amplification of millions of single DNA molecules in parallel [J] .Analytical Chemistry，2009,81(14) :5770-5776.]，由于BEAMing技术所用的磁珠直 径通常在3μπι以下，且数量很大。对信号磁珠的计数是BEAMing技术中的一个关键步骤。流式 细胞技术是BEAMing常用的计数方法，然而昂贵的仪器和试剂限制了该技术的推广^有研究 将磁珠分散在聚丙稀酰胺凝胶中制成磁珠阵列用于人工计数[J. Boulanger，L.Muresan， I.Tiemann-Boege,Massively parallel haplotyping on microscopic beads for the high-throughput phase analysis of single molecules[J]. Summaries of Technical Papers of Annual Meeting Architectural Institute of Japan D Environmental Engineering，2012，7(4): 292-294.]，然而随机的磁珠排列以及有限的显微镜视野也对计 数造成了不便。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR 定量方法，该方法芯片组装简单，成本低;在保留了 BEAMing实验高灵敏度特点的同时使得 BEAMing技术的目标磁珠计数方法更加方便易行，为核酸的高灵敏检测提供了一个简便、快 速的实用工具。
[0005] 本发明的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，包括：
[0006] (1)将硅片清洗、涂胶后采用深反应离子刻蚀在硅片上刻蚀出微柱阵列，微柱阵列 之间的间距随行数减小，采用等离子去胶工艺去除残胶后得到硅片模具;将硅片模具硅烷 化，将配制好的PDMS浇筑在硅片模具上，PDMS加热固化后剥离即得到微柱阵列芯片；
[0007] (2)抽取表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球，稀释后分步加入到BEAMing实验中 生物素修饰的目标磁珠的悬浊液中孵育，富集微球磁珠复合物，重悬；
[0008] (3)取步骤(2)中的微球磁珠复合物的重悬液，通入到微柱阵列芯片中冲洗，通过 统计芯片上截留的微球磁珠复合物，得到目标磁珠的个数。
[0009] 所述步骤(1)中的清洗为采用体积比10:1的出5〇4/出02清洗溶液清洗。
[0010] 所述步骤(1)中微井阵列之间的间距变化范围为50~6μπι。
[0011] 所述步骤(2)中聚苯乙烯微球的直径比微柱阵列最小间距大，目标磁珠的直径比 微柱阵列最小间距小。
[0012] 所述步骤(2)中的重悬为采用PBST溶液重悬。
[0013] 所述PBST溶液的组成为pH 7.4的PBS溶液和0.01 % Tween 20。
[0014] 所述步骤(3)中的冲洗为采用PBST溶液冲洗。
[0015]本发明包括了由微柱阵列芯片设计制备及表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球 的分离和计数。通过表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球捕获BEAMing实验中生物素修饰 的目标磁珠，利用磁场将微球磁珠复合物富集并和游离微球分离，然后利用微柱阵列芯片 拦截微球磁珠复合物，可以方便地达到统计磁珠数量的目的。微柱阵列芯片采用基于微球 尺寸和微柱间尺寸差异的拦截原理，而规则的内部结构降低了后期软件统计微球数量的难 度。链霉亲和素(Streptavidin，SA)修饰微球在溶液中具有较好的分散性，可以有效结合一 端带有生物素的目标磁珠，形成复合物。磁铁可以有效分离磁珠微球复合物和游离微球。微 柱阵列芯片的孔径可以拦截微球滤过多余磁珠，同时规则的排列有利于后续的统计。本发 明降低了 BEAMing检测计数的成本，提高了检测效率。
[0016] 有益效果
[0017] (1)本发明计数简单，微球与磁珠充分结合，每个微球上具有相对固定的磁珠吸附 量，只要统计微球数便可知道整个溶液中磁珠数量的大致范围；微柱阵列的规则排布降低 了统计微球的难度，便于未来软件自动化计数；
[0018] (2)BEAMing具有乳滴PCR多反应腔的特点，可以很容易达到几十万级甚至百万级 的反应腔数，同时又不增加实验操作难度；
[0019] (3)根据检测要求和通量的不同，还可以增加微柱数和芯片面积，改变微球直径大 小参数和微柱间距等，并且可以对微球进行不同基团修饰，做到多重检测；
[0020] (4)本发明检测成本低，制备操作简单，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明微柱阵列芯片内部的示意图；
[0022]图2为本发明微柱阵列芯片拦截微球的示意图；
[0023]图3为微乳滴与磁珠分布不意图；
[0024] 图4为上清液和沉淀中微球形态;其中，左图为上清液中的微球，右图为磁珠微球 复合物；
[0025] 图5为不同模板浓度溶液样本的芯片拦截结果。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0027] 实施例1
[0028] 1 · 1 BEAMing 实验
[0029] 本实施例的引物序列如表1所示。引物1的5 '端带有双生物素基团修饰，可以稳定 地结合在磁珠表面且不会在后续热循环反应中脱离，将SA修饰磁珠 Dynabeads M_270(美国 Invitrogen公司）与引物 1 在结合缓冲液(5mM pH 7.5Tris-HCl，0.5mM EDTA，1M NaCl)中室 温孵育15min，过量的引物1可以保证磁珠表面SA位点饱和。之后利用磁场富集磁珠并用重 悬液(20mM pH 8.4Tris-HCl，50mM KC1)清洗三次，最后用重悬液重悬。反应油乳混合液由 7% (wt/vol )ABIL WE09(德国Evonik Degussa公司），20% (vol/vol)矿物油（美国Sigma公 司）和73% (vol/vol)Tegosoft DEC(德国Evonik Degussa公司）组成。反应预混液成分(40μ L体系）如表2所示。在一个1.5mL离心管中依次加入一颗5mm钢珠，油乳混合液和反应预混 液，盖紧管盖放入Tissuelyser-24全自动样品研磨仪(上海净信科技公司）中振荡形成油包 水液滴体系。扩增反应在标准PCR仪（日本Takara公司）中进行，反应条件包括:94°C2min热 启动激活酶活性，98°C15s变性，60°C45s退火，72°C75s延伸，共45个从变性到延伸循环进行 DNA扩增。扩增完成之后，取出PCR反应管，收集乳液至1.5mL离心管中，加入破乳缓冲液 (10mM Tris-HCl(pH 7.5)，l%Triton-X 100，l%SDS，100mM NaCl，lmM EDTA)，充分振荡混 勾后放入离心机(德国Eppendof公司）中3200g离心3min，吸去上层油相之后重复以上步骤 一次。富集磁珠，移除管内液体后加入结合缓冲液重悬。至此带有目标核酸拷贝信息的磁珠 制备完毕。
[0030] 表1引物序列
[0031]
[0032] 表2反应预混液成分
[0033]
[0034] 1.2微柱阵列芯片制作
[0035]微柱阵列芯片制作包括两个部分:硅片模具的制作和PDMS模具的制作。
[0036] 1.2.1硅片模具的制作
[0037] 将硅片置于煮沸的清洗溶液(H2S〇4: H202 = 10 :1 )中不断晃动浸泡lOmin。取出硅 片，放入去离子水清洗腔中喷淋清洗并甩干。将LC100A正胶旋均匀涂在清洗后的硅片上。涂 完后前烘，去除光刻胶中的水分，增大胶与硅片表面的粘附性，然后利用曝光显影工艺，将 掩膜版上的图案转移到光刻胶上，暴露出硅片上被刻蚀的部分。利用深反应离子刻蚀 (DRIE)在硅片上刻蚀出一系列的微柱阵列，微柱之间的间距随着行数不断减小，变化范围 为50~6μπι，最后用等离子去胶工艺去除残胶。至此，硅片模具制作完成。
[0038] 1.2.2 PDMS模具的制作
[0039]对制作好硅片模具硅烷化，然后取PDMS预聚体和固化剂按10:1的比例配制PDMS。 将配制好的PDMS浇筑在硅片模具上，静置1~2h，90 °C加热lh。待PDMS完全固化后剥离，微井 阵列转化为微柱阵列，然后用蓝膜包覆，手动切割打孔。最后将载玻片与芯片通过等离子体 键合。至此芯片组装完成。
[0040] 1.3聚苯乙烯微球表面修饰链霉亲和素(市售）
[0041 ] 1.4检测流程
[0042] 抽取SA修饰微球，用结合缓冲液稀释，分五次逐步加入到制备好的磁珠悬浊液中 充分吹打，放在恒温震荡仪中孵育30min，随后6000rpm离心5min，吸去上清液。加入TOST溶 液(pH 7.4PBS溶液，0.01 %Tween 20)重悬，吹打混匀。富集磁珠，吸去上清液。用PBST溶液 重悬。
[0043] 微柱阵列芯片进样过程采取负压进样，利用进样仪将PBST溶液通入到装置中，以 10mL/h的速率冲洗装置。取微球和磁珠 TOST重悬液，用TOST溶液重悬，通入到装置中。混合 液进样完成后，用PBST冲洗装置两次。为了防止进样过程气体混入，导致混合液在装置内分 布不均，每一步的液体选择在前一步即将完成时加入。最后的冲洗可以先放到显微镜下观 察，若有磁珠残留，则可以增加冲洗次数。
[0044] 2结果讨论
[0045] 2.1检测原理
[0046] 本方法选用直径为2.8μπι的表面修饰有SA的Dynabeads M-270磁珠作为扩增反应 的固相载体，并与过量的带双生物素基团的引物1饱和结合。由于磁珠的数量远远大于待检 测核酸分子的数量，根据泊松分布可以很容易使单个磁珠与祀标分子共存在一个微乳滴液 腔中进行扩增反应。预混液中的带生物素的引物2参与靶标分子的扩增使目标磁珠上带上 生物素，引物3的存在提高了磁珠表面目标分子的扩增效率。SA修饰聚苯乙烯微球可以有效 地捕获目标磁珠，缓慢加入微球可以使微球充分与目标磁珠结合。故磁珠微球复合物会随 着磁珠一起在磁场下富集，游离微球则随着上清液一起吸除。微球直径为l〇ym，设计的微柱 阵列间距最小为6μπι。微球与扩增磁珠的复合物会因尺寸大而被截留在通道内（图2)，游离 的磁珠则会随着液体流出芯片。通过统计芯片上截留下来的微球，就可以知道溶液中目标 磁珠大致个数。
[0047] 2.2乳液的热稳定性及试剂配比
[0048] 乳液热稳定性是PCR扩增实验很重要的一个因素，分别在热循环前和热循环后吸 取0.5yL乳液平铺在载玻片中，倒置显微镜（日本OLYMPUS公司)400 X倍数观察，如图3所示， 乳滴在热循环前后的状态没有发生变化，其分散性和均匀性良好，说明该乳液具有良好的 热稳定性。
[0049] 2.3定量结果分析
[0050] 实验采用分步多次加入微球的方法来保证SA微球能与目标磁珠充分结合，在本实 验中每一步加入的微球数量约在500个左右，其具体加入的数量亦可根据实际情况做调整。 充分孵育之后，利用磁铁聚集磁珠，吸取上清液放置在显微镜下观察，上清中的微球如图4 左图所示，说明加入的微球总量已足够完全捕获磁珠。图4右图所示与磁珠微球复合物由于 磁场富集作用聚集在管底，游离微球则与上清液一起分离。
[0051] 为了验证该方法的可行性，选取了一段长度为66bp的CDNA片段作为检测标的。将 含有该序列的cDNA溶液按两倍梯度稀释之后分别用该方法对这三个溶液样本进行了检测， 并做了空白对照实验，图5为芯片中截取部分微球拦截结果。三张芯片共分别截取到287个， 148个和85个微球，转化为核酸拷贝数约为5740，2960和1700个拷贝，而空白对照试验无微 球截获。该结果与稀释倍数相对照呈现了较好的线性关系，表明本方法具有可行性。
【主权项】
1. 一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，包括： (1) 将硅片清洗、涂胶后采用深反应离子刻蚀在硅片上刻蚀出微柱阵列，微柱阵列之间 的间距随行数减小，采用等离子去胶工艺去除残胶后得到硅片模具;将硅片模具硅烷化，将 配制好的PDMS浇筑在硅片模具上，PDMS加热固化后剥离即得到微柱阵列芯片； (2) 抽取表面修饰链霉亲和素的聚苯乙烯微球，稀释后分步加入到BEAMing实验中生物 素修饰的目标磁珠的悬浊液中孵育，富集微球磁珠复合物，重悬； (3) 取步骤(2)中的微球磁珠复合物的重悬液，通入到微柱阵列芯片中冲洗，通过统计 芯片上截留的微球磁珠复合物，得到目标磁珠的个数。2. 根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特 征在于:所述步骤(1)中的清洗为采用体积比10:1的出50 4/出02清洗溶液清洗。3. 根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特 征在于:所述步骤(1)中微井阵列之间的间距变化范围为50~6μπι。4. 根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特 征在于:所述步骤(2)中聚苯乙烯微球的直径比微柱阵列最小间距大，目标磁珠的直径比微 柱阵列最小间距小。5. 根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特 征在于:所述步骤(2)中的重悬为采用PBST溶液重悬。6. 根据权利要求5所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特 征在于:所述PBST溶液的组成为pH 7.4的PBS溶液和0.01 % Tween 20。7. 根据权利要求1所述的一种基于微球和微柱阵列芯片的乳滴数字PCR定量方法，其特 征在于:所述步骤(3)中的冲洗为采用PBST溶液冲洗。
【文档编号】C12Q1/68GK105838801SQ201610297439
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】毛红菊, 程祖乐, 王琨, 夏文薇, 金庆辉, 赵建龙
【申请人】中国科学院上海微系统与信息技术研究所