检测热带念珠菌的试剂盒、引物和方法

检测热带念珠菌的试剂盒、引物和方法
【专利摘要】本发明提供了一种实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒、引物以及方法，所述检测试剂盒包括有序列组成为SEQID NO.1和SEQID NO.2的内引物，序列组成为SEQID NO.3和SEQID NO.4的外引物，序列组成为SEQID NO.5的环引物。本发明所述的试剂盒和检测方法特异性强，与非目标菌不存在交叉反应；灵敏度高，可达1.28pg/ul；重复性好，阳性样品三个重复管都几乎同时出峰，实验结果稳定可靠。
【专利说明】
检测热带念珠菌的试剂盒、引物和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物的检测方法，特别是涉及检测热带念珠菌的试剂盒、引物和方 法。
【背景技术】
[0002] 热带念珠菌(Candida tropicalis)为条件致病菌，在自然界广泛存在，也可寄居 在人体皮肤、阴道、口腔、消化道等部位。当人体抵抗力下降或皮肤局部环境发生变化时，热 带念珠菌即可大量繁殖，引起相应部位的感染乃至系统性感染。其致病因子包括其生物膜、 菌丝等，因而其感染率高。
[0003] 目前，多使用显色法从众多种念珠菌中区分热带念珠菌，但是，显色法耗时长，其 中，某些显色法中，热带念珠菌的检测易与光滑念珠菌混淆，不能准确地对热带念珠菌进行 快速的检测。因此，建立快速、有效的检测热带念珠菌的方法尤为重要。
[0004] 环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本 学者Notomi等提出一种全新的核酸扩增技术，该技术具有特异性强、灵敏度高、检测成本低 和操作步骤简便等优点。近年来，越来越多的研究人员将该方法运用于细菌、病毒等微生物 的检测或对该方法进行改进。而实时荧光检测技术采用完全闭管操作，排除了其他干扰因 素，因而具有高灵敏性的优点。目前，已有关于将两种技术相结合的新技术一一实时荧光环 介导恒温扩增（Real-Time fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification, ReaLamp)检测方法的相关研究，但在国内尚未有将此新技术应用于热带念珠菌的检测方面 的发明。
[0005] 本发明拟建立热带念珠菌的ReaLamp检测试剂盒、引物和方法，并从其特异性、灵 敏度、重复性等方面对该方法进行评价，以期将该发明应用于临床检测中。

【发明内容】

[0006] 基于此，本发明的目的之一是提供一种实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠 菌的试剂盒。
[0007] 实现上述目的的技术方案如下：
[0008] -种实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒，包括有序列组成为 SEQIDN0.1和SEQIDN0.2的内引物，序列组成为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列 组成为SEQIDN0.5的环引物。
[0009] 在其中一个实施例中，还包括有荧光染料I。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种检测热带念珠菌的引物。
[0011] 实现上述目的的技术方案如下：
[0012] 一种检测热带念珠菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID NO. 1和SEQID N0.2的内引物，序列组成为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列组成为SEQIDN0.5的 环引物。
[0013] 本发明的另一个目的是提供一种检测热带念珠菌的方法。
[0014] 实现上述目的的技术方案如下：
[0015] 采用实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒，包括以下步骤：
[0016] 1)提取待检测样品的基因组；
[0017] 2)加待检测样品、所述内引物、外引物、和环引物，以及加焚光染料I后构成反应体 系，进行环介导恒温扩增；
[0018] 3)检测扩增产物。
[0019] 在其中一个实施例中，SEQID N0.1、SEQID N0.2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID 从).5的浓度比为8:8:1:1:4。
[0020] 在其中一个实施例中，SEQID N0.1、SEQID N0.2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID NO. 5 在反应体系中的浓度分别为 1.6ymol/L、1.6ymol/L、0.2ymol/L、0.2ymol/L、0.8ymol/ L〇
[0021] 本发明具有以下优点:本发明针对热带念珠菌5.8S和26S rRNA基因之间的ITS2区 序列设计筛选得到特异性的LAMP引物，对热带念珠菌的靶标基因具有很好的扩增效率。对 非热带念珠菌进行ReaLamp的扩增，均未出现非特异性的扩增，说明该引物对热带念珠菌有 较好的扩增能力。而且，本发明所述的实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂 盒灵敏度高，扩增引物对纯培养物中的热带念珠菌的灵敏度可达到1.28pg/ul。进行重复性 试验，结果显示具有很好的重复性。本发明所述的实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念 珠菌的试剂盒即检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好，操作简单、快捷、便于批量检 测等特点，为热带念珠菌的检测提供了新的发展方向。此外，本发明采用荧光染料I，可对其 扩增过程进行实时监控;另外本发明采用恒温扩增，不需热循环仪，对仪器的要求不高。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例3中环引物加快反应速度验证实验的结果示意图；
[0023] 图2为实施例4中热带念珠菌特异性检测实验结果示意图；
[0024] 图3为实施例5中热带念珠菌灵敏度检测实验结果示意图；
[0025] 图4为实施例6中热带念珠菌重复性检测实验结果示意图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明针对热带念珠菌5.8S和26S rRNA基因之间的ITS2区序列设计引物，从中筛 选到5条特异性引物，在链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下恒温反应60min， 通过对荧光信号的实时监测来判断热带念珠菌基因是否有扩增。
[0027]应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0028]菌株来源:菌株由广州医科大学附属第三医院检验科微生物室分离、VITEK 2全自 动微生物鉴定仪鉴定并于_70°C保存。
[0029]实验用菌株如下：白色念珠菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、金黄色 葡萄球菌、无乳链球菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、马尔尼非青霉菌、克柔念珠菌。
[0030] 主要仪器与试剂：
[0031 ]仪器：实时焚光恒温扩增仪（Applied Biosystems 7500)，Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度计，VITEK 2全自动微生物鉴定仪，超净工作台，EP管，微型离 心机，加样枪，振荡器，水浴锅。
[0032]试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒，真菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技 有限公司），DNA扩增试剂盒(购自广州迪澳生物科技有限公司），超纯水等。
[0033] 实施例1
[0034] 本发明的实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒中的引物如表1所 示。该引物根据热带念珠菌5.8S和26S rRNA基因之间的ITS2区序列，利用Primer Explorer V4软件设计。引物序列由英潍捷基上海贸易有限公司合成提供。
[0035] 表1热带念珠菌ReaLamp检测体系引物
[0036]
)
[0037]该检测试剂盒中还包括链置换DNA聚合酶，常规PCR反应液等。
[0038]本实施例选择的荧光染料为荧光染料I。
[0039] 实施例2
[0040]本发明采用环介导恒温扩增技术扩增热带念珠菌5.8S和26S rRNA基因之间的 ITS2区序列，实时荧光检测结果。其中，荧光染料I在反应前加入，避免反应后开盖加染料引 起气溶胶污染造成假阳性。
[0041 ]具体操作步骤如下：
[0042] 2.1基因组DNA提取：
[0043] 1)将热带念珠菌接种于血平板上，在37°C温箱中培养18-24小时；
[0044] 2)用棉签挑取平板上适量单菌落与无菌生理盐水混合，使其麦氏浊度在3.0-4.0 之间，取所得菌液lml，按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行后续操作；
[0045] 3)同理，其他实验用菌株按以上操作方法进行基因组DNA的提取。
[0046] 2.2、环介导恒温扩增：
[0047] 1)分别将实施例1中所述的？1?、81?、？3、83、1^按照8:8:1 :1:4浓度比混合，加入适 量的超纯水，形成总体积为70μ1的含环引物的引物工作液S1;同理，以相同浓度比，不加入 LF，配置成不含环引物的引物工作液S2,使上述引物加入LAMP反应体系后浓度分别达到1.6 ymol/L、1·6ymol/L、0·2ymol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L;
[0048] 2)利用步骤1)中配好的引物工作液，按照表2配制LAMP反应体系（在加入超纯水、 反应液、Bst聚合酶、引物工作液、DNA模板后，先加入20μ1密封液，最后再加入荧光染料I)。 反应过程在实时荧光恒温扩增仪中进行，反应温度为63°C，反应时间为60min;
[0049] 表2:ReaLamp的反应体系
[0050]
[0051] 3)从仪器导出数据后，作归一化处理，使曲线经过4min时的最低点，但不改变曲线 形状和趋势，再用GraphPad Prism 5软件制作曲线图。每次试验均设置ddH20为阴性对照； [0052] 4)反应结束后，观察扩增曲线，若出峰，则为阳性。
[0053] 实施例3
[0054] 根据实施例1的引物(SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.5)构成的试剂盒，按照实施例2中 的反应条件进行扩增，分析检测信号，进行环引物加快反应速度的验证：
[0055] 1)根据实施例2中基因组DNA提取方法提取热带念珠菌DNA，作为DNA模板；
[0056] 2 )将实施例2中所述的含环引物的工作液S1和不含环引物的工作液S 2加入 ReaLamp反应体系中，分别设置以下组别：加入S1但不加 DNA模板;加入S2但不加 DNA模板;加 入S1且加 DNA模板;加入S2且加 DNA模板。观察各组的起峰与达到顶峰的时间，验证环引物能 否使反应速率加快。
[0057] 检测结果：由图1可看出，在反应进行约18min时，加入DNA模板和含环引物的工作 液S1的反应体系开始出峰，并于30min左右达到最大峰值，而其他对照组别在反应过程中无 明显变化，因此无假阳性现象出现，从而得出结论:加入环引物可以使反应速度显著加快。
[0058] 实施例4
[0059]分别根据实施例2中基因组DNA提取方法提取其他常见病原菌（白色念珠菌、化脓 性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、光滑念珠菌、马尔尼 非青霉菌、克柔念珠菌）的DNA，根据实施例1中的引物（SEQIDN0.1-SEQIDN0.5)构成的 试剂盒，按照实施例2中的反应条件进行扩增，分析检测信号，评价该引物的特异性。
[0000] 检测结果：由图2结果看，在约15min时，热带念珠菌实验组开始起峰，在约25min时 达到峰值，而其他菌未起峰(虽然在约5min时，奠肠球菌有起峰趋势，但其最终未能起峰）， 说明该引物不与热带念珠菌以外的菌发生交叉反应，其检测热带念珠菌的特异性强。
[0061 ] 实施例5
[0062] 1)用lyL TE溶液对Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度计校准调零 后，对所提取的热带念珠菌DNA进行浓度分析，测得其浓度；
[0063] 2)取5yL热带念珠菌DNA原液，用超纯水进行10倍梯度稀释6次，得到7份不同浓度 的DNA模板溶液，根据实施例1中的引物(SEQ ID N0.卜SEQ ID N0.5)构成的试剂盒，按照实 施例2的检测方法，分别将这些DNA模板加入反应体系中进行DNA扩增，观察各浓度DNA反应 体系的扩增曲线，对其灵敏度进行分析。
[0064]检测结果：热带念珠菌的DNA浓度测量结果为12.8ng/ul，浓度相对较低;稀释6次 后所得溶液浓度分别为 12 · 8 X 10- (-1 )ng/ul，12 · 8 X ΚΓ (_2)ng/ul，12 · 8 X 1(T (_3)ng/ul， 12.8Xnr(-4)ng/ul，12.8Xl(T(-5)ng/ul，12.8Xl(r(-6)ng/ul;由图3可看出，各浓度反 应体系所得曲线起峰时间与最大峰值出现的时间大致依照浓度梯度逐一出现，直至第四次 稀释浓度为止，因此本实验灵敏度可达1.28pg/ul。
[0065] 实施例6
[0066] 根据实施例1中的引物(SEQ ID NO. 1-SEQ ID N0.5)构成的试剂盒，按照实施例2 的检测方法，对热带念珠菌进行3次重复实验，设置阴性对照，观察热带念珠菌的三次实验 结果曲线是否重叠。由图4可看出，在反应进行至约15min时，三份阳性样品同时出峰，在约 25min时，三份样品同时达到峰值，三条扩增曲线趋势相近，可见，热带念珠菌ReaLamp实验 重复性较好。
[0067] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0068] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种实时荧光环介导恒温扩增法检测热带念珠菌的试剂盒，其特征在于，包括有序 列组成为SEQIDN0.1和SEQIDN0.2的内引物，序列组成为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引 物，序列组成为SEQIDN0.5的环引物。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有荧光染料I。3. -种检测热带念珠菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID NO. 1和SEQID N0.2的内引物，序列组成为SEQIDN0.3和SEQIDN0.4的外引物，序列组成为SEQIDN0.5的 环引物。4. 一种检测热带念珠菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-2任一项所述的试剂盒， 主要包括以下步骤： 1) 提取待检测样品的基因组； 2) 加待检测样品、所述内引物、外引物、和环引物，以及加荧光染料I后构成反应体系， 进行环介导恒温扩增； 3) 检测扩增产物。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述SEQID NO. 1、SEQIDN0.2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID N0.5的浓度比为8:8:1:1:4。6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述SEQID NO. 1、SEQID NO. 2、SEQID N0.3、SEQID N0.4、SEQID 腸.5在反应体系中的浓度分别为1.6以111〇1/1、1.6以111〇1/1、0.24 mol/L、0·2ymol/L、0·8ymol/L〇
【文档编号】C12R1/74GK105838824SQ201610407728
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】郭旭光, 刘庆锋, 何淑君, 黄美淦, 吴健健, 夏勇
【申请人】广州医科大学附属第三医院