用于从脯氨酸生产五碳结构单元的方法和材料的制作方法

用于从脯氨酸生产五碳结构单元的方法和材料的制作方法
【专利摘要】本文件描述了通过在C5骨架底物(如D?脯氨酸)中形成一个或两个末端官能团(包括羧基，胺或羟基)生产戊二酸，5?氨基戊酸，5?羟基戊酸，尸胺或1,5?戊二醇的生物化学途径。
【专利说明】
用于从脯氨酸生产五碳结构单元的方法和材料
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年8月27日提交的美国申请系列号61/870,438和2014年6月16日 提交的美国申请系列号62/012,608的优先权。所述申请的公开通过提述以其整体并入。
技术领域
[0003] 本发明涉及使用一种或多种分离的酶，例如还原酶，消旋酶，激酶，脱氢酶，或co-转氨酶，生物合成选自下组的一种或多种C5结构单元的方法:戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，和1，5_戊二醇，以及生产这些C5结构单元的重组宿主。
[0004] 发明背景
[0005] 尸胺（1，5_戊二胺)是一种C5二胺，其可以作为二胺单体与二酸一起使用以进行聚 酰胺合成，如尼龙5,10或尼龙5,6。通常通过将赖氨酸脱羧到尸胺来生产尸胺。见例如Qian et al ?，Biotechnol Bioeng. 108(1): 93-103(2011)。然而，赖氨酸的脱羧反应不是高效的 过程，因为在此途径中以C02失去了两个碳(二氨基庚二酸脱羧酶(C7)-赖氨酸脱羧酶(C6) -尸胺）。因此，清楚的是需要用于生产尸胺和其它可用于生产聚合物的C5单体的可持续且 高效的方法。
[0006] 发明概述
[0007] 本文件至少部分地基于以下发现，即可能构建生物化学途径用于生产五碳链骨架 前体，如D-脯氨酸，其中可以形成一个或两个官能团，即羧基，胺或羟基，从而导致以下一项 或多项的合成:戊二酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸(也称为5-氨基戊酸(5-aminovalerate))， 尸胺(也称为1，5-戊二胺），以及1，5-戊二醇(此后统称为"C5结构单元(building block)"， 并且每种化合物是"C5结构单元"）。可以生产戊二酸半醛(也称为5-氧代戊酸)作为其它产 物的中间物。戊二酸和戊二酸盐(酯），5-羟基戊酸和5-羟基戊酸盐(酯），5-氧代戊酸和5-氧 代戊酸盐(酯）以及5-氨基戊酸和5-氨基戊酸盐(酯)在本文中可互换使用，指代以任何其中 性或离子化形式的化合物，包括其任意的盐形式。本领域的技术人员应当理解具体的形式 将依赖于pH。
[0008] 在一个方面，本文件的特征在于生产选自下组的C5结构单元的方法:戊二酸，5-氨 基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，和1，5-戊二醇。所述方法包括在一个或多个酶促步骤中，酶促合 成D-脯氨酸，并且将D-脯氨酸酶促转化为C5结构单元。可以从L-谷氨酸酶促合成D-脯氨酸 (例如，使用以下外源酶的一个或多个，如一个，两个，三个或四个:谷氨酸5-激酶，谷氨酸半 醛脱氢酶，吡咯啉5-羧酸还原酶，和脯氨酸消旋酶）。
[0009] 可以使用例如D-脯氨酸还原酶将D-脯氨酸酶促转化为5-氨基戊酸。
[0010] 可以使用例如（i)D_脯氨酸还原酶；（ii)5_氨基戊酸转氨酶;和（iii)选自下组的 脱氢酶:戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸 脱氢酶，和7-氧代庚酸脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化为戊二酸。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0011] 可以使用例如（i)D-脯氨酸还原酶；（ii)5-氨基戊酸转氨酶;和（iii)选自下组的 脱氢酶:6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化 为5-羟基戊酸。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中列出的氨基酸序列 具有至少70%的序列同一性。可以使用羧酸还原酶，醇脱氢酶，和至少一种c〇-转氨酶（例 如，一种转氨酶或两种不同的转氨酶)将羟基戊酸转化为尸胺。至少一种转氨酶 可以归类于￡〇2.6.1.183〇2.6.1.19，￡〇 2.6.1.29,2.6.1.48，或￡〇2.6.1.82。至少一种 转氨酶可以与SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID N0:10，SEQ ID NO:ll, 或SEQ ID NO: 12中列出的氨基酸序列具有70%或更高的序列同一性。羧酸还原酶可以与 SEQ ID N0:1,SEQ ID N0:2,SEQ ID N0:3,SEQ ID N0:5,或SEQ ID N0:6中列出的氨基酸序 列具有至少70%的序列同一性。
[0012] 可以使用例如羧酸还原酶和醇脱氢酶将5-羟基戊酸转化为1，5_戊二醇。羧酸还原 酶可以与SEQ ID N0:1,SEQ ID N0:2,SEQ ID N0:3,SEQ ID N0:5,或SEQ ID N0:6中列出的 氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0013] 可以使用醇脱氢酶和至少一种《-转氨酶(例如，一种《-转氨酶或两种不同的《 -转氨酶)将1，5_戊二醇酶促转化为尸胺。至少一种转氨酶可以与SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8,SEQ ID N0:9,SEQ ID N0:10,SEQ ID NO: 11，或SEQ ID NO: 12中列出的氨基酸序列具 有至少70 %的序列同一性。
[0014] 可以使用例如羧酸还原酶和c〇-转氨酶将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。c〇-转氨酶 可以与3￡〇10勵:7,5￡〇10勵:8,5￡〇10如:9，或5￡〇10如：10中列出的氨基酸序列具 有至少70 %的序列同一性。
[0015] 可以使用D-脯氨酸还原酶，5-氨基戊酸转氨酶，醇脱氢酶，羧酸还原酶，以及至少 一种《-转氨酶将D-脯氨酸酶促转化为尸胺。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。羧酸还原酶可以与SEQ ID N0:6 中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0016] 在任意方法中，方法的全部或部分可以通过发酵在重组宿主中进行。宿主可以经 历需氧，厌氧，或微需氧培养条件下的培养策略。可以在营养限制的条件下培养宿主。可以 使用陶瓷中空纤维膜保留宿主以维持发酵期间的高细胞密度。进料至发酵的主要碳源可以 衍生于生物原料。例如，生物原料可以是，或可以衍生于，单糖，二糖，木质纤维素，半纤维 素，纤维素，木质素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，农业废物，浓缩的酒糟可溶 物，或城市废物。进料至发酵的主要碳源可以衍生于非生物原料。例如，所述非生物原料可 以是，或可以衍生于:天然气、合成气、C0 2/H2,甲醇，乙醇，来自环己烷氧化过程的非挥发性 残留物(NVR)碱洗废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。
[0017] 本文件的特征还在于重组宿主，其包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：（i)D_ 脯氨酸还原酶，（ii)5_氨基戊酸转氨酶，和（iii)脱氢酶，所述宿主产生戊二酸或5-羟基戊 酸。例如，宿主可以产生戊二酸且脱氢酶可以选自下组:戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱 氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，和7-氧代庚酸脱氢酶。例如，宿主 可以产生5-羟基戊酸且脱氢酶可以选自下组:6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶。产生5-羟基戊酸的宿主进一步可以包括外源性羧酸还原酶和外源性醇脱 氢，并进一步产生1，5_戊二醇。产生1，5_戊二醇的宿主进一步可以包括至少一种外源性《-转氨酶和可选的第二和/或第三醇外源性脱氢酶，并进一步产生尸胺。产生5-羟基戊酸的宿 主进一步可以包括外源性羧酸还原酶，外源性醇脱氢酶，以及至少一种外源性CO-转氨酶， 并进一步产生尸胺。任意宿主中的至少一种外源性转氨酶可以与SEQ ID N0:7，SEQ ID 勵:8,5￡〇10勵:9,5￡〇10勵：10,5￡〇10从)：11，或5￡〇10勵：12中列出的氨基酸序列具 有至少70%的序列同一性。至少一种外源性co-转氨酶可以是两种不同的外源性转氨 酶。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9中列出的氨基酸序列具有至少 70%的序列同一性。
[0018] 本文件的特征还在于重组宿主，其包括编码以下酶的至少一种外源性核酸：（i)D_ 脯氨酸还原酶，（ii)羧酸还原酶，和（iii) 转氨酶，所述宿主产生尸胺。转氨酶可以与 5￡〇10勵:7,5￡〇10如:8,5￡〇10如:9，或5￡〇10如：10中列出的氨基酸序列具有至少 70%的序列同一性。宿主进一步可以包括外源性5-氨基戊酸转氨酶。5-氨基戊酸转氨酶可 以与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。羧酸还 原酶可以与SEQ ID N0:6中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0019] 本文件的特征还在于重组宿主，其包括编码以下酶的至少一种外源性核酸：（i)5-氨基戊酸转氨酶和（ii)脱氢酶，所述宿主产生戊二酸或5-羟基戊酸。宿主进一步可以包括 外源性羧酸还原酶和外源性醇脱氢酶并进一步产生1，5-戊二醇。生产1，5_戊二醇的宿主进 一步可以包括至少一种外源性co-转氨酶和可选的第二或第三醇脱氢酶，并进一步产生尸 胺。
[0020] 本文件的特征还在于重组宿主，其包括编码以下酶的至少一种外源性核酸（i)羧 酸还原酶和(ii) 转氨酶，所述宿主产生尸胺。
[0021] 本文件的特征还在于重组宿主，其包括编码以下酶的至少一种外源性核酸（i)羧 酸还原酶，（ii)至少一种转氨酶，和(iii)醇脱氢酶，所述宿主产生尸胺。
[0022] 在任意重组宿主中，羧酸还原酶可以与SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3， SEQ ID NO:5,或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。
[0023] 任意重组宿主或用于任意方法中的任意重组宿主可以是原核生物。原核生物可以 来自埃希氏菌属（Escherichia)如大肠杆菌（Escherichia coli);来自梭菌属 (Clostridia)如杨氏梭菌（Clostridium 1 jungdahlii)、自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或克氏梭菌（Clostridium kluyveri);来自棒状杆菌属 (Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum);来自贪铜菌属 (Cupriavidus)如钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator)或耐金属贪铜菌（Cupriavidus metallidurans);来自假单胞菌属（Pseudomonas)如焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或者食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans);来自属代尔夫特食酸菌（Delftia acidovorans)，来自芽孢杆菌属 (Bacillus)如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtill is);来自乳杆菌属(Lactobacillus)如德 氏乳杆菌（Lactobaci 1 lus delbruecki i);来自乳球菌属（Lactococcus)如乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)或来自红球菌属(Rhodococcus)如马红球菌(Rhodococcus equi)。
[0024] 任意重组宿主或用于任意方法中的任意重组宿主可以是真核生物。真核生物来自 曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger);来自酵母属（Saccharomyces)如酿 酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);来自毕赤氏酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris);来自耶氏酵母属（Yarrowia)如解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica);来自伊萨酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵母（Issathenkia oriental is);来自德巴利氏酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利氏酵母(Debaryomyces hansenii);来自Arxula属如Arxula adenoinivorans，或者来自克鲁维酵母菌属 (Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
[0025] 任意重组宿主或用于任意方法中的任意重组宿主可以包括一种或多种以下减弱 的酶:聚羟基脂肪酸酯合成酶;磷酸丙糖异构酶;葡萄糖-6-磷酸异构酶;转氢酶;NADH特异 性谷氨酸脱氢酶;NADH/NADPH利用型谷氨酸脱氢酶;戊二酰-CoA脱氢酶;或戊二酰-CoA合成 酶。
[0026] 任意重组宿主或用于任意方法中的任意重组宿主可以过表达编码以下酶的一种 或多种基因：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;丙酮酸羧化酶;6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶;转酮醇酶； 吡啶核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶;甘油醛-3P-脱氢酶;苹果酸酶;葡萄糖脱氢酶;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;果糖1，6二磷酸酶;L-丙氨酸脱氢酶;L-谷氨酸脱氢酶;L-谷氨酸合成酶;赖氨 酸转运体(transporter);二羧酸转运体;和/或多药转运体。
[0027] 本文所述途径的反应可以在一种或多种细胞(例如宿主细胞)株中进行，所述细胞 株(a)天然表达一种或多种相关酶，（b)经遗传工程化而表达一种或多种相关酶，或(c)天然 表达一种或多种相关酶并经遗传工程化而表达一种或多种相关酶。或者，可以从以上任意 种类的宿主细胞中提取相关酶，并以纯化或半纯化形式使用。提取的酶可选地固定于适合 的反应容器的底和/或壁。此外，这些提取物包括可以作为相关酶来源使用的裂解物(如细 胞裂解物)或部分纯化的裂解物。在本申请提供的方法中，所有步骤可以在细胞(例如宿主 细胞）中进行，所有步骤可以使用提取的酶进行，或一些步骤可以在细胞中进行，而其它步 骤可以使用提取的酶进行。在任何方法中，反应可以是单步骤转化，其中可以将一种化合物 直接转化成感兴趣的不同化合物(例如D-脯氨酸至5-氨基戊酸），或者转化可以包括两个或 更多个步骤以将一种化合物转化成不同化合物。
[0028] 除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术 人员所通常理解的含义相同。虽然与本申请所述的方法和材料相似或者等同的方法和材料 也可用于实践本发明，下文描述适合的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专 利和其它参考文献通过提述完整并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。 另外，材料、方法和实施例仅为说明性的而不意图限制。
[0029]本发明的一个或多个实施方案的细节列于下面的附图和描述中。根据说明书和附 图，并根据权利要求，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。根据专利法的标准实践， 词语"包含"在权利要求中可被"基本上由…组成"或者"由…组成"替代。
[0030] 附图简述
[0031] 图1是使用谷氨酸作为中心代谢物通向D-脯氨酸的示例性生物化学途径的示意 图。
[0032] 图2是使用D-脯氨酸作为中心前体通向戊二酸的示例性生物化学途径的示意图。
[0033] 图3是使用D-脯氨酸作为中心前体通向5-氨基戊酸的示例性生物化学途径的示意 图。
[0034] 图4是使用5-氨基戊酸(也称为5-氨基戊酸盐），5-羟基戊酸，5-氧代戊酸，或1，5-戊二醇作为中心前体通向尸胺的示例性生物化学途径的示意图。
[0035] 图5是使用D-脯氨酸作为中心前体通向5-羟基戊酸的示例性生物化学途径的示意 图。
[0036] 图6是使用5-羟基戊酸作为中心前体通向1，5_戊二醇的示例性生物化学途径的示 意图。
[0037] 图7含有海鱼分支杆菌(Mycobacterium marinum)駿酸还原酶(见Genbank登录号 ACC40567.1，SEQ ID N0:1)，耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis)駿酸还原酶（见 Genbank登录号ABK71854.1，SEQ ID N0: 2)，Segniliparus rugosus駿酸还原酶（见Genbank 登录号EFV11917.1，SEQ ID N0:3)，Mycobacterium massiliense駿酸还原酶（见Genbank登 录号EIV11143.1，SEQ ID N0:5)，Segniliparus rotundus駿酸还原酶（见Genbank登录号 ADG98140.1，SEQ ID N0:6)，青紫色素杆菌（Chromobacterium violaceum)?-转氨酶（见 Genbank登录号AAQ59697.1，SEQ ID NO:7)，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) ?-转氨酶（见Genbank登录号AAG08191.1，SEQ ID N0:8)，丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae)〇-转氨酶（见 Genbank 登录号 AAY39893.1，SEQ ID N0:9)，类球红细菌 (1?11〇(1(^&(^618。11&61'〇1(168)?-转氨酶（见66油&111<:登录号41^81135.1，3￡( >)10繼：10)，大 肠杆菌《 -转氨酶（见Genbank登录号AAA57874.1，SEQ ID NO : 11)，河流孤菌（Vibrio fluvialis) ? -转氨酶（见Genbank登录号AEA39183.1，SEQ ID NO: 12);枯草芽抱杆菌磷酸 泛酰疏基乙胺基转移酶（Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase)(见 Genbank登录号CAA44858.1，SEQ ID NO: 13)，和诺卡氏菌属物种（Nocardia sp.)NRRL 5646 磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(见Genbank登录号ABI83656.1，SEQ ID N0:4)的氨基酸序列。
[0038] 图8是4小时（反应）后丙酮酸向L-丙氨酸的百分比转化(mo 1 /mo 1)的柱状图，作为 相对于空载体对照，转氨酶(SEQ ID N0:7)将5-氨基戊酸转化为戊二酸半醛的活性的测 量。
[0039] 图9是4小时(反应)后L-丙氨酸向丙酮酸的百分比转化(mo 1 /mo 1)的柱状图，作为 相对于空载体对照，转氨酶(SEQ ID N0:9)将5-氧代戊酸转化为5-氨基戊酸的活性的测 量。
[0040] 图10是总结4小时(反应)后丙酮酸向L-丙氨酸的百分比转化(mol/mol)的柱状图， 作为相对于仅酶对照(无底物），《_转氨酶(SEQ ID N0:7-12)的活性的测量。
[00411图11是总结20分钟（反应）后340nm处吸光度变化的柱状图，其为相对于仅酶对照 (无底物），NADPH的消耗和羧酸还原酶(SEQ ID N0s:l-3和5)的活性的测量。
[0042]图12是20分钟（反应）后340nm处吸光度变化的柱状图，其为相对于空载体对照， NADPH的消耗和羧酸还原酶(SEQ ID NOs: 1-3,5和6)将5-羟基戊酸转化为5-羟基戊醛的活 性的测量。
[0043] 图13是4小时(反应)后丙酮酸向L-丙氨酸的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为 相对于空载体对照，转氨酶(SEQ ID NOs:7-12)将5-氨基戊醇转化为5-氧代戊醇的活性 的测量。
[0044] 图14是4小时(反应)后丙酮酸向L-丙氨酸的百分比转化(mol/mol)的柱状图，作为 相对于空载体对照，转氨酶（SEQ ID N0s:7-9和11)将尸胺转化为5-氨基庚醛的活性的 测量。
[0045]图15是20分钟（反应）后340nm处吸光度变化的柱状图，其为相对于空载体对照， NADPH的消耗和羧酸还原酶(SEQ ID NO: 6)将戊二酸半醛转化为戊二醛的活性的测量。
[0046] 发明详述
[0047] 本申请提供酶、非天然途径、培养策略、原料、宿主微生物和对宿主的生物化学网 络的弱化，其从中心代谢产物生成五碳链骨架，如D-脯氨酸，其中可以形成一个或两个末端 官能团，导致以下一种或多种物质的合成:戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，或1，5_ 戊二醛。可以产生戊二酸半醛作为其它产物的中间物。如本文所使用的，术语"中心前体"用 于表示本文所示的导致C5结构单元合成的任意代谢途径中的任意代谢产物。术语"中心代 谢产物"用于本文表示在所有微生物中生产以支持生长的代谢产物。
[0048] 本文所述的宿主微生物可以包括能够操作，使得能够生产一种或多种C5结构单元 的内源性途径。在内源性途径中，宿主微生物天然表达催化途径中反应的所有酶。含有工程 化途径的宿主微生物不天然表达催化途径中反应的所有酶，但已经过工程化改造，使得途 径中的所有的酶在宿主中表达。
[0049] 术语"外源性"在本文中就核酸（或蛋白）和宿主而言使用时指代不在特定类型的 细胞中（并且不能从其获得)就像其在自然界中存在那样发生的核酸，或由此类核酸编码的 蛋白。因此，非天然存在的核酸一旦在宿主中时，认为对于该宿主是外源性的。重要的是要 注意非天然存在的核酸可以含有在自然界存在的核酸亚序列或核酸序列片段，只要核酸作 为整体在自然界中不存在。例如，表达载体中含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在 的核酸，因此一旦引入到宿主中其对于宿主细胞是外源性的，因为该核酸分子作为整体(基 因组DNA加上载体DNA)在自然界中不存在。因此，任意载体，自主复制质粒，或病毒（例如逆 转录病毒、腺病毒或疱疹病毒）（其作为整体在自然界中不存在)认为是非天然存在的核酸。 得出结论，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA认为是非天然 存在的核酸，因为其作为单独的分子在自然界中不存在。还得出结论，含有以自然界中不存 在的排列的启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的任意核酸是非天然存在 核酸。天然存在的核酸对于具体的宿主微生物可以是外源性的。例如，从酵母x的细胞分离 的整个染色体一旦该染色体引入到酵母y的细胞中，其对于酵母y的细胞而言是外源性核 酸。
[0050] 比较而言，术语"内源性"在本文中就核酸(例如基因）（或蛋白）和宿主而言时指代 确实在特定的宿主中（并能够从其获得)就像其在自然界中找到一样存在的核酸(或蛋白）。 此外，"内源性表达"核酸(或蛋白）的细胞就像其在自然界中找到一样与相同特定类型的宿 主一样表达该核酸(或蛋白）。此外，"内源性生产"核酸、蛋白或其它化合物的宿主就像其在 自然界中找到一样与相同特定类型的宿主一样生成该核酸、蛋白或化合物。
[0051] 例如，根据宿主和由宿主产生的化合物，可以在宿主中表达一种或多种以下酶，包 括谷氨酸5-激酶，D-脯氨酸还原酶，吡咯啉5-羧酸还原酶，脯氨酸消旋酶，醛脱氢酶，琥珀酸 半醛脱氢酶，戊二酸半醛脱氢酶，醇脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，7-氧代 庚酸脱氢酶，《转氨酶，可逆《转氨酶，6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，4-羟基丁酸 脱氢酶，或羧酸还原酶。在表达羧酸还原酶的重组宿主中，还可以表达磷酸泛酰巯基乙胺基 转移酶(phosphopantetheinyl transferase)，因为其提高羧酸还原酶的活性。
[0052]在一些实施方案中，重组宿主可以包括至少一个编码以下一种或多种酶的外源性 核酸:谷氨酸5-激酶，谷氨酸半醛脱氢酶，吡咯啉5-羧酸还原酶，和脯氨酸消旋酶，并产生D- 脯氨酸。在一些实施方案中，重组宿主可以包括至少一个编码D-脯氨酸还原酶的外源性核 酸。这些宿主的任一个进一步可以包括下列一种或多种:可逆性转氨酶(例如，5-氨基戊 酸转氨酶)和脱氢酶，如醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢 酶，或7-氧代庚酸脱氢酶，并产生戊二酸半醛和/或戊二酸。例如，这些宿主的任一个进一步 可以包括可逆转氨酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)并产生戊二酸半醛。例如，，这些宿主的 任一个进一步可以包括可逆转氨酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)和脱氢酶，如醛脱氢酶， 琥珀酸半醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，或7-氧代庚酸脱氢酶并产生戊 二酸。
[0053]在一些实施方案中，重组宿主包括至少一种编码以下酶的外源性核酸:可逆转 氨酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)和脱氢酶，如醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱 氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，或7-氧代庚酸脱氢酶并产生戊二酸。
[0054] 在一些实施方案中，重组宿主包括至少一种编码以下酶的外源性核酸:D-脯氨酸 还原酶，可逆转氨酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)和脱氢酶，如醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢 酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，或7-氧代庚酸脱氢酶并产生戊二酸。
[0055] 在一些实施方案中，产生D-脯氨酸的重组宿主可以包括至少一种编码D-脯氨酸还 原酶的外源性核酸，并进一步产生5-氨基戊酸。
[0056] 在一些实施方案中，产生5-氨基戊酸的重组宿主包括至少一种编码可逆转氨 酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)的外源性核酸，并进一步产生戊二酸半醛。
[0057] 在一些实施方案中，产生D-脯氨酸的重组宿主包括至少一种编码D-脯氨酸还原酶 和可逆-转氨酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)的外源性核酸，并进一步产生戊二酸半醛。 [0058]在一些实施方案中，产生5-氨基戊酸的重组宿主包括至少一种编码可逆转氨 酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)和脱氢酶，如4-羟基丁酸脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代 己酸脱氢酶或醇脱氢酶的外源性核酸，并进一步产生5-羟基戊酸。
[0059] 在一些实施方案中，产生D-脯氨酸的重组宿主可以包括至少一种编码D-脯氨酸还 原酶，可逆转氨酶(例如，5-氨基戊酸转氨酶)和脱氢酶，如4-羟基丁酸脱氢酶，5-羟基戊 酸脱氢酶，6-羟基己酸脱氢酶或醇脱氢酶的外源性核酸，并进一步产生5-羟基戊酸。
[0060] 产生5-氨基戊酸，5-羟基戊酸，或戊二酸半醛的重组宿主可以包括下列一种或多 种：外源性羧酸还原酶，外源性《 -转氨酶，或外源性醇脱氢酶，以及一种或多种（例如，一 种，两种或三种)可选的外源性酶，如D-脯氨酸还原酶，5-氨基戊酸转氨酶，和醛脱氢酶，并 产生尸胺。在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶和外源性转氨酶的 每一种，并产生尸胺。在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶，外源性 转氨酶，和外源性D-脯氨酸还原酶的每一种，并产生尸胺。在一些实施方案中，重组宿主可 以包括外源性羧酸还原酶，外源性转氨酶，外源性D-脯氨酸还原酶，外源性5-氨基戊酸 转氨酶的每一种，并产生尸胺。在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶， 外源性co-转氨酶，和外源性5-氨基戊酸转氨酶的每一个并产生尸胺。在一些实施方案中， 重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶，外源性转氨酶，外源性D-脯氨酸还原酶、外源性 5_氨基戊酸转氨酶和外源性脱氢酶，如6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁 酸脱氢酶的每一个并产生尸胺。在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶， 外源性转氨酶、外源性5-氨基戊酸转氨酶、和外源性脱氢酶，如6-羟基己酸脱氢酶，5-羟 基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶的每一个，和醇脱氢酶。在一些实施方案中，重组宿主 可以包括外源性羧酸还原酶，至少一种外源性转氨酶(例如，一种外源性转氨酶或两 种不同的外源性转氨酶），和醇脱氢酶。在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性羧 酸还原酶，至少一种外源性转氨酶，和外源性醇脱氢酶并产生尸胺。在一些实施方案中， 重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶，至少一种外源性转氨酶，外源性醇脱氢酶，外源 性5-氨基戊酸转氨酶，以及外源性脱氢酶，如6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶并产生尸胺。在一些实施方案中，重组宿主可以包括外源性羧酸还原酶，至 少一种外源性转氨酶，外源性醇脱氢酶，外源性D-脯氨酸还原酶、外源性5-氨基戊酸转 氨酶、以及外源性脱氢酶，如6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶 并产生尸胺。
[0061]产生5-羟基戊酸的重组宿主可以包括下列一种或多种:羧酸还原酶和醇脱氢酶， 并产生1，5_戊二醇。产生1，5_戊二醇的重组宿主可以包括至少一种外源性转氨酶（例 如，一种外源性《 -转氨酶或两种不同的外源性转氨酶)和可选的第二和/或第三外源性 醇脱氢酶并产生尸胺。
[0062] 在任意重组宿主中，可以包括一种或多种(例如，一种，两种，三种，或四种）以下外 源性酶:谷氨酸5-激酶，谷氨酸半醛脱氢酶，吡咯啉5-羧酸还原酶，和脯氨酸消旋酶。
[0063]在工程化途径中，酶可以来自单个来源，例如来自于一个物种或属，或可以来自于 多个来源，例如不同的物种或属。编码本文所述的酶的核酸已经从多种生物鉴定，并在公共 可用数据库，如GenBank或EMBL中容易获得。
[0064]本文所述的可用于生产一种或多种C5结构单元的任意酶可以与对应野生型酶的 氨基酸序列具有至少70 %的序列同一性（同源性）（例如至少75 %、80 %、85 %、90 %、95 %、 97%、98%、99%或100%)。应当理解序列同一性可以基于成熟的酶(例如移除了任意信号 序列)或基于不成熟的酶(例如，包括任意信号序列)来确定。
[0065]例如，本文所述的羧酸还原酶可以与海鱼分支杆菌（见G e n b a n k登录号 ACC40567.1，SEQ ID N0:1)，耻垢分枝杆菌（见Genbank登录号ABK71854.1，SEQ ID N0:2)， Segniliparus rugosus(见Genbank登录号EFV11917.1，SEQ ID N0:3)，Mycobacterium massiliens(见Genbank登录号EIV11143.1，SEQ ID N0:5)，或Segniliparus rotundus(见 Genbank登录号ADG98140.1，SEQ ID NO:6)的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性（同源 性）（例如至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%)。见，图7。
[0066] 例如，本文所述的转氨酶可以与青紫色素杆菌(见Genbank登录号AAQ59697.1， 5￡〇10勵:7)，铜绿假单胞菌（见66汕31^登录号44608191.1，3￡〇10勵:8)，丁香假单胞菌 (见Genbank登录号AAY39893 ? 1，SEQ ID N0:9)，类球红细菌（见Genbank登录号ABA81135 ? 1， 5￡〇10勵：10)，大肠杆菌（见66汕31^登录号44457874.1，3￡〇10勵：11)，或河流孤菌（见 6 6油&吐登录号4￡439183.1，3￡〇10勵：12)?-转氨酶的氨基酸序列具有至少70%的序列 同一性（同源性）（例如至少 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 或 100%)。见图 7。 [0067]例如，本文所述的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶可以与枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基 乙胺基转移酶（见Genbank登录号CAA44858.1，SEQ ID觀：13)，或诺卡氏菌属物种冊此 5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(见Genbank登录号ABI83656.1，SEQ ID NO:4)的氨基酸序 列具有至少70%的序列同一性（同源性）（例如至少75%、80%、85%、90%、95%、97%、 98%、99%或 100%)。见图7。
[0068]两个氨基酸序列之间的同一性（同源性)百分比可以如下确定。首先，使用来自含 有81^31?2.0.14版本的单机版81^312的81^312 3691161^6(812869)程序比对氨基酸序 列。BLASTZ的这一单机版可以从Fish&Richardson的网站（例如www.fr ? com/blast/)或者美 国政府的 National Center for Biotechnology Information 网站 (www ? ncbi ? nlm.nih.gov)上获得。解释如何使用B12seq程序的说明可以在BLASTZ随附的自 述文件中找到。B12seq使用BLASTP算法进行两个氨基酸序列之间的比较。为了比较两个氨 基酸序列，B12seq的选项如下设定:-i设置为含有待比较的第一个氨基酸序列的文件(例如 C:\seql .txt) ;_j设置为含有待比较的第二个氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt) ;_p设 置为blastp;_o设置为任意所需的文件名（例如C: \output.txt);所有其它选项保留其默认 设置。例如，以下命令可以用于生成含有两个氨基酸序列之间比较的输出文件< :\812%(1-i c:\seql.txt_j c:\seq2.txt_p blastp-〇 c:\output.txt。如果两个比较的序列共有同 源性（同一性），则指定的输出文件将呈现那些同源区域作为比对序列。如果两个比较序列 不共享同源性（同一性），则指定的输出文件将不呈现比对序列。除了使用blastn外，可以遵 循类似的步骤用于核酸序列。
[0069] 一旦比对后，匹配的数量通过数两个序列中都出现的相同氨基酸残基位置的数量 来确定。百分比同一性（同源性)通过将匹配的数量除以多肽氨基酸序列全长的长度，接着 将所得值乘以一百来确定。应当注意百分比同一性（同源性)值四舍五入到最近的十分位。 例如，78.11、78.12、78.13和78.14舍到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入到 78.2。还应当注意所述长度值总是整数。
[0070] 应当理解若干核酸可以编码具有特定氨基酸序列的多肽。遗传密码的简并性是本 领域公知的，例如，对于许多氨基酸，存在多于一种充当该氨基酸密码子的核苷酸三联体。 例如，可以使用对于该物种适合的密码子偏好表修饰所给酶的编码序列中的密码子，使得 获得在特定物种(例如细菌或真菌）中的最优表达。
[0071] 本文所述的任意酶的功能片段也可以用于本申请的方法。术语"功能片段"用于本 文指代蛋白的肽片段，其具有相应成熟、全长、野生型蛋白的至少25% (例如至少30%、 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、95%、98%、99%、100%;或甚至超过100%)的活 性。功能片段通常可以通常但不总是由蛋白的连续区域组成，其中所述区域具有功能活性。
[0072 ]本申请还提供(i)用于本申请方法的酶的功能变体和（i i)上述功能片段的功能变 体。酶和功能片段的功能变体可以含有相对于对应野生型序列的添加、缺失或取代。带有取 代的酶通常具有不多于50个(例如不多于一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九 个、十个、12、15、20、25、30、35、40或50)个氨基酸取代(例如保守取代）。这适用于本文所述 的任意酶和功能片段。保守取代是一个氨基酸对具有相似特性的另一个氨基酸的取代。保 守取代包括下组中的取代:缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸;亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸;天冬氨酸 和谷氨酸;天冬酰胺和谷氨酰胺;丝氨酸、半胱氨酸和苏氨酸;赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨 酸和酪氨酸。非极性疏水氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬 酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的（酸性)氨 基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述极性、碱性或酸性组中一个成员被同组另一个成员的任 意取代认为是保守取代。相比之下，非保守取代是一个氨基酸对具有不相似特性的另一个 氨基酸的取代。
[0073] 缺失变体可以缺少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、 12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸片段（由两个或更多氨基酸组成)或非连续的单个 氨基酸。添加(添加变体)包括含有下述项的融合蛋白：（a)本文所述的任意酶或其片段;和 (b)内部或末端(C或N)不相关或异源的氨基酸序列。在此类融合蛋白的语境中，术语"异源 氨基酸序列"指代除了（a)的氨基酸序列。异源性序列可以是例如用于重组蛋白纯化的序列 (例如FLAG、多聚组氨酸(例如六组氨酸）、血细胞凝集素(HA)、谷胱甘肽-s-转移酶(GST)、或 麦芽糖结合蛋白（MBP))。异源性序列也可以是作为可检测标记物有用的蛋白，例如萤光素 酶、绿色荧光蛋白（GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在一些实施方案中，融合蛋白含有来自 于另一个蛋白的信号序列。在某些宿主细胞中（例如酵母宿主细胞），目标蛋白的表达和/或 分泌可以通过使用异源性信号序列增加。在一些实施方案中，融合蛋白可以含有载体(例如 KLH)(例如在引起免疫应答中以产生抗体中有用)或ER或高尔基体驻留信号。异源性序列可 以是不同的长度，并在一些情况下可以是比与异源性序列附接的全长目标蛋白更长的序 列。
[0074] 工程化宿主可以天然表达无一或一些（例如一种或更多、两种或更多、三种或更 多、四种或更多、五种或更多、或六种或更多）本文图1，2,3,4,5,或6中描述的途径的酶。因 此，工程化宿主中的途径可以包括所有外源性的酶，或可以包括内源性和外源性酶两者。也 可以破坏工程化宿主的内源性基因来阻止不需要的代谢产物的形成，或阻止途径中间产物 通过其它作用于该中间产物的酶而流失。工程化的宿主可称为重组宿主或重组宿主细胞。 如本文所述，重组宿主可以包括编码以下一种或多种酶的核酸:如本文所述的还原酶，消旋 酶，激酶，脱氢酶，或w -转氨酶。
[0075] 另外，可以使用本文所述的分离的酶，使用来自于作为酶来源的宿主微生物的裂 解物(例如细胞裂解物），或使用来自于作为酶来源的不同宿主微生物的多个裂解物，在体 外进行一种或多种C5结构单元的生产。
[0076] 在C5结构单元的生物合成中生成末端羧基的酶
[0077] 如图2中所描述的，可以使用醛脱氢酶，戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，7-氧代庚酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，或可逆-转氨酶酶促形成末端 羧基。
[0078]在一些实施方案中，通向戊二酸半醛合成的第一个末端羧基由可逆转氨酶，如 归类于例如EC 2.6.1.48下的5-氨基戊酸转氨酶，如得自绿色木霉梭菌（Clostridium viride)的可逆5-氨基戊酸转氨酶形成。见例如图2和图5以及SEQ ID NO:7和9。来自绿色木 霉梭菌的可逆5-氨基戊酸转氨酶已经证明了将6-氨基己酸转化为己二酸半醛的类似活性 (Barker et al.,J.Biol.Chem.,1987,262(19),8994-9003)〇
[0079]在一些实施方案中，通向戊二酸合成的第二个末端羧基由归类于例如EC1.2.1.3 下的酸脱氢酶酶促形成（见，61161'1'；111(^&\%11(16〇&8七6616，￡111'.]\13;[0(3116111.，1977,81，185-192)。见图 2。
[0080]在一些实施方案中，通向戊二酸合成的第二个末端羧基由归类于EC 1.2.1.-下的 脱氢酶，如归类于例如EC 1.2.1.20下的戊二酸半醛脱氢酶，归类于，例如EC 1.2.1.16或EC 1.2.1.79下的琥珀酸半醛脱氢酶，或归类于EC 1.2.1.3下的醛脱氢酶酶促形成。例如，归类 于EC 1.2.1.-下的脱氢酶可以是5-氧代戊酸脱氢酶，如CpnE的基因产物，6-氧代己酸脱氢 酶（例如，来自不动杆菌属物种的C h n E的基因产物），或7 -氧代庚酸脱氢酶（例如，来自 Sphingomonas macrogolitabida 的 ThnG 的基因产物）（Iwaki e t a 1 ., Appi.Environ.Microbiol.,1999,65(11),5158-5162；Lopez-Sanchez et al., Appl .Environ.Microbiol ? ,2010,76(1), 110-118)。例如，6-氧代己酸脱氢酶可以归类于 EC1.2.1.63，如ChnE的基因产物。例如，7-氧代庚酸脱氢酶可以归类于EC 1.2.1.-下。
[0081 ]在C5结构单元的生物合成中生成末端胺基团的酶
[0082]如图4和图5中所描述的，可以使用co-转氨酶或D-脯氨酸还原酶酶促形成末端胺 基团。
[0083] 在一些实施方案中，由归类于例如EC 1.21.4.1下的D-脯氨酸还原酶酶促形成一 个末端胺基。见图2,3和5。
[0084]在一些实施方案中，通向5-氨基庚醇或5-氨基庚醛的合成的一个末端胺基可以由 归类于例如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48,或EC 2.6.1.82下的 ?-转氨酶，如得自青紫色素杆菌（见661^他登录号44〇59697.1，3￡〇10勵:7)，铜绿假单 胞菌（见Genbank登录号AAG08191.1，SEQ ID N0:8)，丁香假单胞菌（见Genbank登录号 八八￥39893.1，3￡〇10勵：9)，类球红细菌（见66汕&1^登录号48481135.1，3￡〇10勵：10)，河 流孤菌（见Genbank登录号AEA39183.1，SEQ ID 购：12)，灰色链霉菌（51^6口1:〇1115^63 griseus)，或绿色梭菌的co-转氨酶酶促形成。可以用于本文所述的方法和宿主中的另外的 转氨酶是来自大肠杆菌(Genbank登录号AAA57874.1，SEQ ID ^):11)。归类于例如￡〇 2.6.1.29或EC 2.6.1.82下的一些转氨酶是二胺转氨酶(例如，SEQ ID NO:9)。见图 4〇
[0085] 来自于青紫色素杆菌的可逆转氨酶(Genbank登录号AAQ59697.1，SEQ ID N0: 7)已经证明了接受6-氨基己酸作为氨基供体，从而形成己二酸半醛中的第一个末端胺基的 类似活性（Kaulmann等，Enzyme and Microbial Technology,2007,41,628-637)。
[0086]来自于灰色链霉菌的可逆4-氨基丁酸:2-氧代戊二酸转氨酶已经证明了将6-氨基 己酸转化为己二酸半酸的类似活性(Yonaha等，Eur.J.Biochem.，1985,146:101-106) 〇
[0087]在一些实施方案中，通向尸胺合成的第二个末端胺基由二胺转氨酶酶促形成。例 如，第二个末端氨基可以由归类于例如EC 2.6.1.29或归类于例如EC 2.6.1.82下的二胺转 氨酶，例如来自大肠杆菌的YgjG的基因产物(Genbank登录号AAA57874.1，SEQ ID N0:11)酶 促形成。
[0088] ygjG的基因产物接受一大批的二胺碳链长度底物，例如腐胺、尸胺和亚精胺 (Samsonova等，BMC Microbiology，2003，3:2) 〇
[0089]来自大肠杆菌菌株B的二胺转氨酶已经证明了对于1，7_二氨基庚烷的活性(Kim， The Journal of Chemistry,1964,239(3),783-786)。
[0090 ]在C5结构单元的生物合成中生成末端羟基的酶
[0091] 如图5和图6中所描述的，可以使用脱氢酶，如醇脱氢酶，6-羟基己酸脱氢酶，5-羟 基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶酶促形成末端羟基。
[0092]例如，通向5-羟基戊酸的合成的末端羟基可以由归类于例如EC 1.1.1.-下的脱氢 酶，如归类于例如EC 1.1.1.258下的6-羟基己酸脱氢酶(例如，ChnD的基因产物），归类于例 如已(：1.1.1.-下的5-羟基戊酸脱氢酶，如0?110的基因产物（见例如1?&1^6七&1.，2002， Appl .Environ.Microbiol ?，68( 11): 5671-5684)，来自绿色梭菌的5-羟基戊酸脱氢酶，或4-羟基丁酸脱氢酶，如gabD(，例如Liitke-Eversloh&Steinbiichel，1999，FEMS Microbiology Letters, 181(1) :63-71)酶促形成。见图5。
[0093] 通向1，5_戊二醇的合成的末端羟基可以由归类于EC 1.1.1.-下（例如，EC 1 ? 1 ? 1 ? 1，1 ? 1 ? 1 ? 2，1 ? 1 ? 1 ? 21，或1 ? 1 ? 1 ? 184)的醇脱氢酶酶促形成。见图6。
[0094] 生物化学途径 [0095]通向D-脯氨酸的途径
[0096]如图1中所描述的，由归类于例如EC 2.7.2.11下的谷氨酸5-激酶可以将L-谷氨酸 转化为L-谷酰基-磷酸;接着由脱氢酶，如归类于例如EC 1.2.1.41下的谷氨酸-5-半醛脱氢 酶将L-谷酰基-磷酸转化为L-谷氨酸半醛;接着L-谷氨酸半醛自发转化为(S)-1-吡咯啉-5-羧酸;接着由归类于例如EC 1.5.1.2下的吡咯啉-5-羧酸还原酶将(S)-1-吡咯啉-5-羧酸转 化为L-脯氨酸;接着由归类于例如EC 5.1.1.4下的脯氨酸消旋酶将L-脯氨酸转化为D-脯氨 酸。
[0097]使用D-脯氨酸作为中心前体通向戊二酸的途径
[0098]如图2中所描述的，由归类于例如EC 1.21.4.1下的D-脯氨酸还原酶可以将D-脯氨 酸转化为5-氨基戊酸(5-氨基戊酸，5-aminovaleric acid);接着由归类于EC 2.6.1.-下的 ?-转氨酶或归类于例如￡0 2.6.1.48下的5-氨基戊酸转氨酶(例如，3￡〇10勵:7或9)转化 为5-氧代戊酸（戊二酸半醛）；接着由归类于EC 1.2.1.-下的脱氢酶，如归类于例如EC 1.2.1.20下的戊二酸半醛脱氢酶，归类于例如EC 1.2.1.16或EC 1.2.1.79下的琥珀酸半醛 脱氢酶，或归类于例如EC 1.2.1.3下的醛脱氢酶转化为戊二酸。例如，5-氧代戊酸脱氢酶， 如CpnE的基因产物，6-氧代己酸脱氢酶，如ChnE的基因产物，或7-氧代庚酸脱氢酶(例如，来 自Sphingomonas macrogolitabida的ThnG的基因产物）可以用于将5-氧代戊酸转化为戊二 酸。
[0099 ]使用D-脯氨酸作为中心前体通向5-氨基戊酸的途径
[0100] 如图2和图3中所描述的，可以由归类于例如EC 1.21.4.1下的D-脯氨酸还原酶将 D-脯氨酸转化为5-氨基戊酸(5-氨基戊酸，5-aminovaleric acid)。
[0101] 使用5-氨基戊酸，5-羟基戊酸，戊二酸半醛，或1，5_戊二醇作为中心前体通向尸胺 的途径
[0102] 在一些实施方案中，如下从中心前体5-氨基戊酸(例如，其可以在图3中产生)合成 尸胺：由归类于例如EC 1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物，组合磷酸泛酰巯基 乙胺转移酶增强剂(例如由来自于枯草芽孢杆菌的sfp基因编码或由来自于诺卡氏菌的npt 基因编码，分别为SEQ ID N0s:13和4)，或来自于灰色链霉菌的GriC和GriD的基因产物 (Suzuki等，J.Antibiot.，2007,60(6)，380-387)将5-氨基庚酸转化为5-氨基庚醛;接着由 ?-转氨酶（例如，￡〇2.6.1.18，￡〇2.6.1.19，￡〇2.6.1.48，￡〇2.6.1.82，如5已〇10吣8: 7-12)将5-氨基庚醛转化为尸胺。羧酸还原酶可以得自例如海鱼分支杆菌(Genbank登录号 ACC40567.1，SEQ ID N0:1)，耻垢分枝杆菌（Genbank登录号ABK71854.1，SEQ ID N0:2)， Segniliparus rugosus(Genbank登录号EFV11917.1，SEQ ID N0:3)，Mycobacterium massi 1 iens (Genbank登录号EIV11143 ? 1，SEQ ID NO: 5)，或Segni 1 iparus rotundus (Genbank登录号ADG98140.1，SEQ ID N0:6)。见图4〇
[0103]由car的基因产物编码的羧酸还原酶和增强剂npt或sfp具有广泛的底物特异性， 包括末端双官能性的C4和C5駿酸（Venkitasubramanian等，Enzyme and Microbial Technology,2008,42,130-137)〇
[0104] 在一些实施方案中，如下从中心前体5-羟基戊酸(其可以如在图5中描述的那样产 生)合成尸胺：由归类于例如EC 1.2.99.6下的羧酸还原酶，如car的基因产物（见上文），组 合磷酸泛酰巯基乙胺转移酶增强剂(见上文），将5-羟基戊酸转化为5-羟基戊醛;接着由归 类于例如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48,或EC 2.6.1.82下的《-转氨酶，如SEQ ID N0s:7-12将5-羟基戊醛转化为5-氨基戊醇，见上文;接着由归类于例如 EC 例如EC l.l.l.UEC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、或EC 1.1.1.184)下的醇脱氢酶， 如YMR318C或YqhD的基因产物（Liu等，Microbiology ,2009,155，2078-2085 ;Larroy等， 2002,Biochem J.,361(Pt 1),163-172；Jarboe,2011,Appl.Microbiol.Biotechno1.,89 (2)，249-257)，或具有GenBank登录号CAA81612.1的蛋白转化为5-氨基戊醛;接着由归类于 例如￡〇2.6.1.18，￡〇2.6.1.19，￡〇2.6.1.29，￡〇2.6.1.48，或￡〇2.6.1.82下的《-转氨 酶，如SEQ ID N0s:7-12转化为尸胺，见上文。见图4。
[0105] 在一些实施方案中，如下从中心前体戊二酸半醛(也称为5-氧代戊酸)合成尸胺： 由归类于例如EC 1.2.99.6下的羧酸还原酶，例如car的基因产物（见上文），与磷酸泛酰巯 基乙胺转移酶增强剂（见上文）组合，将戊二酸半醛转化为戊二醛；接着由归类于例如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19,或EC 2.6.1.48下的转氨酶转化为5-氨基庚醛;接着由归类于 例如￡〇2.6.1.18，￡〇2.6.1.19，￡〇2.6.1.29，￡〇2.6.1.48，或￡〇2.6.1.82下的《-转氨 酶，如SEQ ID N0s:7-12转化为尸胺。见图4。
[0106] 在一些实施方案中，如下从中心前体1，5_戊二醇（其可以如图6中所述产生)合成 尸胺：由归类于例如已(：1.1.1.-(如￡(：1.1.1.1、￡(：1.1.1.2、￡(：1.1.1.21、或￡〇 1.1.1.184) 下的醇脱氢酶，如YMR318C或YqhD的基因产物（来自大肠杆菌，GenBank登录号 AAA69178 ? 1)(见例如 Liu 等，Microbiology，2009，155，2078-2085; Larroy 等，2002，Biochem J.，361(Pt 1)，163-172;或Jarboe，2011，Appl.Microbiol.Biotechnol.，89(2),249-257) 或具有GenBank登录号CAA81612.1的蛋白（来自嗜热脂肪土芽孢杆菌)将1，5-戊二醇转化为 5_羟基庚醛;接着由归类于例如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48,或 EC 2.6.1.82下的转氨酶，如SEQ ID NOs: 7-12将5-羟基庚醛转化为5-氨基庚醇，见上 文；接着由归类于例如 EC 例如 EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、SEC 1.1.1.184) 下的醇脱氢酶，例如YMR318C或YqhD的基因产物（Liu等，Microbiology, 2009， 155,2078-2085;1^^〇7等，2002,81〇。116111了.，361(?七1)，163-172 ;加4〇6,2011， Appl .Microbiol .Biotechnol. ,89(2) ,249-257)或具有 GenBank 登录号 CAA81612.1 的蛋白 转化为5-氨基戊醛；接着由归类于例如EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48,或EC 2.6.1.82下的转氨酶，如SEQ ID NOs:7-10转化为尸胺，参见上文。见图 4〇
[0107] 使用D-脯氨酸作为中心前体通向5-羟基戊酸的途径
[0108] 如图5中所描述的，可以如下将D-脯氨酸转化为5-氨基戊酸(5-氨基戊酸）：由归类 于例如EC 1.21.4.1下的D-脯氨酸还原酶;接着由归类于例如EC 2.6.1.48下的5-氨基戊酸 转氨酶转化为5-氧代戊酸(戊二酸半醛）；接着由归类于例如EC 1.1.1下的脱氢酶，如归 类于例如EC 1.1.1.258下的6-羟基己酸脱氢酶（例如，ChnD的基因产物），归类于例如EC 1.1.1. -下的5-羟基戊酸脱氢酶，如CpnD的基因产物，或4-羟基丁酸脱氢酶，如gabD转化为 5-羟基戊酸。
[0109] 使用5-羟基戊酸作为中心前体通向1,5-戊二醇的途径
[0110] 如图6中所描述的，可以如下从中心前体5-羟基戊酸合成1，5戊二醇：由归类于例 如EC 1.2.99.6下的羧酸还原酶，如car的基因产物（见上文），组合磷酸泛酰巯基乙胺转移 酶增强剂(见上文），将5-羟基戊酸转化为5-羟基戊醛;接着由归类于例如EC 1.1.1(如EC 1.1.1. UEC 1.1.1.2、EC 1.1.1.21、或 EC 1.1.1.184)下的醇脱氢酶，如 YMR318C 或 YqhD 的 基因产物(来自大肠杆菌，66111^1^登录号44469178.1)(见例如1^11等，]\1;[01'013；[01087,2009， 155,2078-2085;Larroy等，2002,Biochem J.，361(Pt 1)，163-172;或Jarboe,2011， Appl .Microbiol .Biotechnol. ,89(2) ,249-257)或具有GenBank登录号CAA81612.1 的蛋白 (来自嗜热脂肪土芽孢杆菌)将5-羟基戊醛转化为1，5戊二醇。以上蛋白的氨基酸序列见图 1。
[0111] 培养策略
[0112] 在一些实施方案中，培养策略需要达到需氧、厌氧或微需氧的培养条件。
[0113] 在一些实施方案中，循环培养策略需要在达到厌氧培养条件和达到需氧培养条件 之间交替。
[0114]在一些实施方案中，所述培养策略需要营养限制，例如氮、磷或氧限制。
[0115] 在一些实施方案中，可以采用使用例如陶瓷中空纤维膜的细胞保留策略，来达到 并维持分批补料或连续发酵期间的高细胞密度。
[0116] 在一些实施方案中，在一种或多种C5结构单元的合成中进料至发酵的主要碳源可 以源自生物或非生物原料。
[0117] 在一些实施方案中，生物原料可以是以下物质或可以源自以下物质：单糖、二糖、 木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废 物、浓缩的酒糟可溶物或城市废物。
[0118] 对源自生物柴油生产的粗制甘油的高效分解代谢已经在几种微生物中证明，如大 肠杆菌、钩虫贪铜菌、食油假单胞菌、恶臭假单胞菌和解脂耶氏酵母（Lee等， Appl.Biochem.Biotechnol?,2012,166,1801_1813;Yang等，Biotechnology for Biofuels，2012，5:13;Meijnen等，Appl.Microbiol.Biotechnol?，2011，90,885-893)〇
[0119] 已经通过前体丙酰-CoA在合成3-羟基戊酸中在几种生物，如钩虫贪铜菌和恶臭假 单胞菌中证明了对木质纤维素衍生的乙酰丙酸的高效分解代谢(Jaremko和Yu，2011，见上 文；Martin和Prather,J.Biotechnol?,2009,139,61-67)。
[0120]已经在几种微生物如恶臭假单胞菌，钩虫贪铜菌中证明了对木质素衍生的芳香族 化合物，如苯甲酸类似物的高效分解代谢(Bugg等，Current Opinion in Biotechnology, 2011，22，394-400;Pgrez-Pantoja等，FEMS Microbiol?Rev?，2008，32，736-794)〇 [0121]已经在几种微生物(包括解脂耶氏酵母）中证明了对农业废物，如橄榄油工厂废水 的高效利用（Papanikolaou等，Bioresour.Technol ?，2〇〇8，"（7)，2419_ 2428) 〇
[0122] 对可发酵糖，如衍生于纤维素、半纤维素、甘蔗和甜菜糖蜜、木薯、玉米和其它农业 来源的单糖和二糖的高效利用已经对几种微生物证明，如大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和德 氏乳酸杆菌和乳酸乳球菌(见例如Hermann等，J.Biotechnol ?，2003，104，155-172 ;Wee等， Food Technol.Biotechnol.,2006,44(2),163-172;Ohashi等，J.Bioscience and Bioengineering,1999,87(5),647-654)〇
[0123] 对源自多种农业木质纤维素来源的糠醛(furfural)的高效利用已经对钩虫贪铜 菌证明（Li等，Biodegradation,2011,22,1215-1225)。
[0124] 在一些实施方案中，非生物原料可以是或可以源自天然气、合成气、C02/H2、甲醇、 乙醇、苯甲酸盐、来自环己烷氧化过程的碱洗废物流或非挥发性残留物(NVR)，或对苯二甲 酸/间苯二甲酸混合物废物流。
[0125] 对甲醇的高效分解代谢已经对甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母证明。
[0126] 对乙醇的高效分解代谢已经对克氏梭菌证明（见S e e d 〇 r f等， Proc.Natl?Acad.Sci.USA,2008,105(6)2128-2133)。
[0127] 对0)2和出(其可以源自天然气和其它化学和石油化学来源）的高效分解代谢已经 对钩虫贪铜菌证明（Prybylski等，Energy，Sustainability and Society ,2012,2:11)。
[0128] 对合成气的高效分解代谢已经对许多微生物证明，如杨氏梭菌和自产乙醇梭菌（ K6pke等，Applied and Environmental Microbiology,2011,77(15),5467-5475)。
[0129] 对来自于环己烷过程的非挥发性残留物废物流的高效分解代谢已经对许多微生 物证明，如代尔夫特食酸菌和钩虫贪铜菌（Ramsay等，Applied and Environmental Microbiology,1986,52(1),152-156)〇
[0130] 在一些实施方案中，宿主微生物是原核生物。例如，原核生物可以是细菌，其来自 于埃希氏菌属如大肠杆菌;来自梭菌属如杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或克氏梭菌;来自棒状杆 菌属如谷氨酸棒状杆菌;来自贪铜菌属如钩虫贪铜菌或耐金属贪铜菌;来自假单胞菌属如 荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假单胞菌;来自代尔夫特属如戴尔福特食酸菌;来自 芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌;来自乳杆菌属如德氏乳杆菌;或来自乳球菌属如乳酸乳球菌。 这些原核生物还可以是构建本文所述的能够产生一种或多种C5结构单元的重组宿主细胞 的基因来源。
[0131 ]在一些实施方案中，宿主微生物是真核生物，例如，真核生物可以是丝状真菌，例 如来自曲霉属如黑曲霉。或者，真核生物可以是酵母，例如来自酵母属如酿酒酵母;来自毕 赤酵母属如巴斯德毕赤酵母;或来自耶氏酵母属如解脂耶氏酵母;来自伊萨酵母属如东方 伊萨酵母；来自德巴利氏酵母属如汉逊德巴利氏酵母；来自A r x u 1 a属如A r x u 1 a adenoinivorans;或者来自克鲁维酵母菌属如乳酸克鲁维酵母菌。这些真核生物还可以是 构建本文所述的能够产生一种或多种C5结构单元的重组宿主细胞的基因来源。
[0132] 代谢工程
[0133] 本申请提供方法，所述方法涉及对所有上述途径所述的少于所有步骤。这些方法 可涉及例如这些步骤的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、 十二个或者更多。在此类方法中包括少于所有步骤的情况下，第一个步骤且在一些实施方 案中仅有的步骤可为所列步骤中的任意一个。
[0134] 此外，本文所述的重组宿主可包括上述酶的任意组合，使得一个或者多个所述步 骤，例如，这些步骤的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或者更多可 以在重组宿主内实施。本申请提供所列的任意属和种的宿主细胞，其经遗传工程化以表达 本申请列举的任意酶的一种或者多种（例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九 种、10种、11种、12种或更多）重组形式。因此，例如，宿主细胞可含有外源性核酸，所述外源 性核酸编码催化本文所述任意途径的一个或者多个步骤的酶。
[0135] 另外，本申请认识到，在酶已经被描述为接受CoA活化的底物的情况下，存在与 [acp]结合底物相关的类似酶活性，其不一定为相同的酶种类。
[0136] 本申请还认识到，在酶已经被描述为接受底物的（R)-对映异构体的情况下，存在 与(S)-对映异构体底物相关的类似酶活性，其不一定为相同的酶种类。
[0137] 本申请还认识到，在酶已经显示接受特定辅因子如NADPH或者共底物（cosubstrate) 如乙酰-CoA 的情况下，许多酶在催化特定酶活性中接受一些不同辅因子或者共 底物方面是混杂的。本申请还认识到，在酶对例如特定辅因子如NADH具有高特异性的情况 下，对辅因子NADPH具有高特异性的具有相似或者相同活性的酶可以为不同的酶种类。
[0138] 在一些实施方案中，本文概述的途径中的酶是经非直接的或者合理的酶设计方法 的酶工程的结果，其目的在于改善活性、改善特异性、降低反馈抑制、降低阻抑、改善酶溶解 性、改变立体特异性，或者改变辅因子特异性。
[0139] 在一些实施方案中，本文概述的途径中的酶可以经附加体(episomal)或者染色体 整合方法基因给予(gene dose)(即过表达)至所得的经遗传修饰的生物体中。
[0140] 在一些实施方案中，可以使用基因组级别(genome-scale)的系统生物学技术如通 量平衡分析(Flux Balance Analysis)来设计用于将碳通量导向C5结构单元的基因组级别 的弱化或者敲除策略。
[0141]弱化策略包括但不限于:使用转座子、同源重组(双交换方法）、诱变、酶抑制剂和 RNAi干扰。
[0142] 在一些实施方案中，可以使用通量组(f luxomic)、代谢物组(metabolomic)和转录 物组(transcriptomal)数据来告知或支持基因组级别的系统生物学技术，从而在将碳通量 导向C5结构单元中设计基因组级别的弱化或者敲除策略。
[0143] 在一些实施方案中，宿主微生物对高浓度的C5结构单元的耐受可以通过在选择性 环境中的连续培养来改善。
[0144] 在一些实施方案中，可以弱化或增强宿主微生物的内源性生物化学网络，来（1)保 证谷氨酸或脯氨酸的细胞内可用度，（2)创造辅因子的不平衡，其仅可以通过一种或多种C5 结构单元的形成来平衡，（3)阻止降解中心代谢产物，通向和包括一种或多种C5结构单元的 中心前体，和/或(4)保证从细胞的高效流出。
[0145] 在一些要求L-谷氨酸的细胞内可用度用于C5结构单元合成的实施方案中，放大催 化补充柠檬酸循环中间物的回补反应的酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或丙酮酸羧化酶。
[0146] 在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH辅因子用于C5结构单元合成的情况 下，可以在宿主生物体中过表达重组甲酸脱氢酶基因（Shen等，2011，见上文）。
[0147] 在一些实施方案中，在途径需要过量的NADH或NADPH辅因子用于C5结构单元合成 的情况下，可以弱化重组转氢酶。
[0148] 在一些实施方案中，通过弱化内源性葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)，可以将 碳通量导入戊糖磷酸循环中，来增加 NADPH的供给。
[0149] 在一些实施方案中，通过过表达6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶和/或转酮醇酶，可以将碳 通量再导向戊糖磷酸循环中，来增加 NADPH的供给(Lee等，2003，Biotechnology Progress， 19(5)，1444-1449)。
[0150] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以在宿主生物体中过表达编码吡啶核苷酸转氢酶的基因例如UdhA(Brigham等，Advanced Biofuels and Bioproducts,2012,Chapter 39，1065_1090)〇
[0151] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以在宿主生物体中过表达重组甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因，例如GapN(Brigham等，2012， 见上文）。
[0152] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以在宿主生物体中过表达重组苹果酸酶基因，如maeA或maeB(Brigham等，2012，见上文）。
[0153] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，例如zef(Lim等， J.Bioscience and Bioengineering,2002,93(6),543-549)〇
[0154] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以在宿主生物体中过表达重组果糖1 ,6-二磷酸酶基因，如fbp(Becker等， J.Biotechnol.,2007,132:99-109)〇
[0155] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以弱化内源性磷酸丙糖异构酶(EC 5.3.1.1)。
[0156] 在一些实施方案中，在C5结构单元合成中途径需要过量的NADPH辅因子的情况下， 可以在宿主生物体中过表达重组葡萄糖脱氢酶，如gdh的基因产物(Satoh等，J. Bioscience and Bioengineering,2003,95(4):335-341)〇
[0157] 在一些实施方案中，可以弱化促进NADPH转化为NADH的内源性酶，如可以由归类于 EC 1.4.1.2(NADH特异性)和EC 1.4.1.4(NADPH特异性)下的谷氨酸脱氢酶的相互转换产生 的NADH生成循环。
[0158] 在一些实施方案中，可以弱化使用NADH和NADPH两者作为辅因子的内源性谷氨酸 脱氢酶(EC 1.4.1.3)。
[0159] 在一些使用天然积累聚羟基脂肪酸酯的宿主的实施方案中，在宿主菌株中可以弱 化内源性聚羟基脂肪酸酯合酶。
[0160] 在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-丙氨酸脱氢酶，来从丙酮酸再生L-丙 氨酸，作为转氨酶反应的氨基供体。
[0161]在一些实施方案中，可以在宿主中过表达L-谷氨酸脱氢酶，L-谷氨酰胺合成酶，或 谷氨酸合酶，来从2-氧代戊二酸再生L-谷氨酸，作为转氨酶反应的氨基供体。
[0162] 在一些实施方案中，可以弱化降解通向和包括C6结构单元的中心代谢产物和中心 前体的酶，如归类于EC 1.3.1.62下的庚二酰(pimeloyl)-CoA脱氢酶和/或归类于例如EC 1.3.8.6下的戊二酰-CoA脱氢酶。
[0163] 在一些实施方案中，可以弱化通过辅酶A酯化激活C5结构单元的内源性酶，如归类 于例如EC 6.2.1.6下的CoA-连接酶(例如戊二酰-CoA合成酶）。
[0164] 在一些实施方案中，可以通过对细胞膜遗传工程化结构修饰，或增加用于C5结构 单元的任意相关的转运体活性来提高或放大C5结构单元穿过细胞膜流出到细胞外介质。
[0165] 尸胺的流出可以通过过表达广泛底物范围多药转运体来提高或放大，如来自枯草 芽孢杆菌的Bit(Woolridge等，1997，J? Biol ? Chem.，272( 14):8864-8866);来自大肠杆菌的 AcrB和AcrD(Elkins&Nikaido，2002，J.Bacteriol ?，184(23) ,6490-6499)或来自金黄色葡 萄球菌的NorA(Ng等，1994,Antimicrob Agents Chemother, 38(6)，1345-1355)或来自枯草 芽抱杆菌的Bmr(Neyfakh, 1992，Antimicrob Agents Chemother, 36(2) ,484-485)。
[0166] 5-氨基戊酸和尸胺的流出可以通过过表达溶质转运体来提高或放大，如来自于谷 氨酸棒状杆菌的lysE转运体(Bellmann等，2001，Microbiology, 147,1765-1774)。
[0167] 戊二酸的流出可以通过过表达二羧酸转运体来提高或放大，如来自于谷氨酸棒状 杆菌的SucE转运体(Huhn等，Appl .Microbiol .&Biotech. ,89(2) ,327-335)。
[0168] 使用重组宿主生产C5结构单元
[0169] 通常来说，通过提供宿主微生物并使用含有上述适合碳源的培养基培养所提供的 微生物，可以生产一种或多种C5结构单元。一般来说，所述培养基和/或培养条件可以是使 得所述微生物生长到足够密度，并高效生产C5结构单元。对于大规模生产流程，可以使用任 意方法，例如别处所述的那些（Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology，第二版，编辑：A.L.Demain和J.E.Davies,ASM Press;以及Principles of Fermentation Technology，P.F. Stanbury 和A .Whitaker，Pergamon)。简短的说，含有适当 培养基的大型罐(例如100加仑、200加仑、500加仑或更多)接种特定的微生物。接种后，孵育 所述微生物，以允许生物质的生产。一旦达到所需的生物质，含有所述微生物的培养基可以 转移到第二个罐。第二个罐可以是任意尺寸的。例如，所述第二个罐可以比第一个罐更大、 更小、或相同尺寸。通常来说，第二个罐比第一个罐更大，使得可以向来自第一个罐的培养 基中添加另外的培养基。另外，第二个罐中的培养基可以与第一个罐中使用的相同或不同。
[0170] 一旦转移后，可以孵育所述微生物，来允许C5结构单元的生产。一旦生产后，可以 使用任意方法来分离C5结构单元。例如，可以通过吸附过程从所述发酵培养基中选择性回 收C5结构单元。在戊二酸和5-氨基戊酸的情况中，得到的洗出液可以通过蒸发进一步浓缩， 通过蒸发和/或冷却结晶来结晶，以及通过离心来回收结晶。在尸胺和1，5-戊二醇的情况 中，可以采用蒸馏来达到所需的产品纯度。 实施例
[0171] 实施例1
[0172] 使用5-氨基戊酸作为底物并形成5-氧代戊酸的转氨酶的酶活性
[0173]编码N端His标签的序列加到来自于青紫色素杆菌和丁香假单胞菌、分别编码SEQ ID NOs: 7和9的《 -转氨酶的基因（见图7)，使得能够产生N端HIS标记的《 -转氨酶。每种所 得的修饰基因克隆到pET21a表达载体中，在T7启动子的控制下，并且每种表达载体转化到 BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL LB培养基和抗生素选择 压力的250mL摇瓶中在37°C培养，在230rpm下振荡。每个培养物使用ImM IPTG在16°C诱导过 夜。
[0174]通过离心从每个诱导的摇瓶培养物收获沉淀物。每个沉淀物重悬并通过超声处理 裂解。通过离心将细胞碎片从上清分离，无细胞提取物立即用于酶活性测定。
[0175] 正向（即，5-氨基戊酸到戊二酸半醛）的酶活性测定法在由终浓度为50mM的HEPES 缓冲液(pH = 7.5)、10mM 5-氨基戊酸、10mM丙酮酸和lOOliM吡咳酰(pyridoxyl)5 '磷酸组成 的缓冲液中进行。通过向含有5-氨基戊酸的测定缓冲液中加入co -转氨酶基因产物的无细 胞提取物或空载体对照来起始每个酶活性测定反应，并在25°C孵育4小时，在250rpm下振 荡。通过RP-HPLC定量从L-丙氨酸形成丙酮酸。如相对于空载体对照确定的，SEQ ID N0 7的 基因产物接受5-氨基戊酸作为底物。见图8。
[0176] 逆向（即，戊二酸半醛到5-氨基戊酸）的酶活性在由终浓度为50mM的HEPES缓冲液 (pH = 7.5)、1 OmM戊二酸半醛、1 OmM L-丙氨酸和1 OOyM吡哆酰5 '磷酸组成的缓冲液中进行。 通过向含有戊二酸半醛的缓冲液中加入转氨酶基因产物的无细胞提取物或空载体对照 来起始每个酶活性测定反应，并在25 °C孵育4小时，在250rpm下振荡。通过RP-HPLC定量丙酮 酸的形成。如相对于空载体对照确定的，SEQ ID N0 9的基因产物接受戊二酸半醛作为底 物。见图9。
[0177] 每个没有5-氨基戊酸的仅酶对照证明丙酮酸向L-丙氨酸的低基线转化。见图10。
[0178] 考虑到转氨酶活性的可逆性，可以得出结论SEQ ID N0 7和SEQ ID N0 9的基 因产物接受5-氨基庚酸作为底物并形成5-氧代戊酸。
[0179] 实施例2
[0180] 使用5-羟基戊酸作为底物并形成5-羟基戊醛的羧酸还原酶的酶活性
[0181] 编码His标签的序列加到来自于海鱼分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、Segniliparus rugosus、Mycobacterium massiliense和Segniliparus rotundus的分别编码SEQ ID NOs: 1，2,3,5和6的羧酸还原酶的基因（见图7)，使得能够产生N端HIS标记的羧酸还原酶。每种修 饰的基因与来自于枯草芽孢杆菌的编码HIS标记的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的sfp基因 一起克隆到pET Duet表达载体中，两者都在T7启动子下。
[0182] 每种表达质粒转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中，并且所得的重组大肠杆菌菌株 在含有50mL LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶中在37°C培养，在230rpm下振荡。每 个培养物使用自动诱导培养基在37°C诱导过夜。
[0183] 通过离心从每个诱导的摇瓶培养物收获沉淀物。每个沉淀物重悬并通过超声裂 解。通过离心将细胞碎片从上清分离。羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶使用Ni-亲 和层析从上清中纯化，10倍稀释到50mM HEPES缓冲液中（pH=7.5)，并通过超滤浓缩。
[0184] 酶活性（即，从5-羟基戊酸到5-羟基戊醛)测定法以一式三份在由终浓度为50mM的 HEPES缓冲液(pH=7.5)、2mM 5-羟基戊醛、10mM MgCl2、lmM ATP和ImM NADPH组成的缓冲液 中进行。通过向含有5-羟基戊酸的测定缓冲液中加入纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙 胺基转移酶或空载体对照来起始每个酶活性测定反应，并接着在室温下孵育20分钟。通过 340nm处的吸光度监控NADPH的消耗。每个没有5-羟基戊酸的仅酶对照证明NADPH的低基线 消耗。见图11。
[0185] 如相对于空载体对照确认，SEQ ID N0s:l，2,3,5和6的基因产物（由sfp的基因产 物增强)接受5-羟基戊酸作为底物(见图12)，并合成5-羟基戊醛。
[0186] 实施例3
[0187] 对于5-氨基戊醇的c〇-转氨酶的酶活性，形成5-氧代戊醇
[0188] 编码N端His标签的核苷酸序列加到分别编码SEQ ID NOs:7-12的青紫色素杆菌、 铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、类球红细菌、大肠杆菌，和河流孤菌基因（见图7)，使得能够 产生N端HIS标记的《 -转氨酶。所述修饰基因克隆到pET21a表达载体中，在T7启动子的控制 下。每种表达载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。每种所得的重组大肠杆菌菌株在含有 50mL的LB培养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶中在37°C培养，在230rpm下振荡。每个培养 物使用ImM IPTG在16°C诱导过夜。
[0189] 通过离心从每个诱导的摇瓶培养物收获沉淀物。每个沉淀物重悬并通过超声裂 解。通过离心将细胞碎片从上清分离，无细胞提取物立即用于酶活性测定法。
[0190] 逆向（即，5-氨基戊醇到5-氧代戊醇）的酶活性测定法在由终浓度为50mM的HEPES 缓冲液(pH=7.5)、1 OmM 5-氨基戊醇、1 OmM丙酮酸和1 OOyM吡哆酰5 '磷酸组成的缓冲液中进 行。每个酶活性测定反应通过向含有5-氨基戊醇的测定缓冲液中加入co-转氨酶基因产物 的无细胞提取物或空载体对照来起始，接着在25°C孵育4小时，在250rpm下振荡。通过RP-HPLC定量L-丙氨酸的形成。
[0191] 每个没有5-氨基戊醇的仅酶对照具有丙酮酸到L-丙氨酸的低基线转化。见图10。
[0192] 如相对于空载体对照确认，SEQ ID N0 7-12的基因产物接受5-氨基戊醇作为底物 (见图13)，并合成5-氧代戊醇作为反应产物。考虑到co-转氨酶活性的可逆性，可以得出结 论SEQ ID N0 7-12的基因产物接受5-氧代戊醇并形成5-氨基戊醇。
[0193] 实施例4
[0194] 使用尸胺作为底物并形成5-氨基戊醛的c〇-转氨酶的酶活性
[0195] 编码N端His标签的序列加到分别编码SEQ ID N0s:7,8,9和11的转氨酶的青紫 色素杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、和大肠杆菌基因（见图7 )，使得能够产生N端HI S标 记的w-转氨酶。所述修饰基因克隆到pET21a表达载体中，在T7启动子的控制下。每种表达 载体转化到BL21[DE3]大肠杆菌宿主中。每种所得的重组大肠杆菌菌株在含有50mL的LB培 养基和抗生素选择压力的250mL摇瓶中在37 °C培养，在230rpm下振荡。每个培养物使用ImM IPTG在16°C诱导过夜。
[0196] 通过离心从每个诱导的摇瓶培养物收获沉淀物。每个沉淀物重悬并通过超声裂 解。通过离心将细胞碎片从上清分离，无细胞提取物立即用于酶活性测定法。
[0197] 逆向（即，从尸胺到5-氨基戊醛）的酶活性测定法在由终浓度为50mM的HEPES缓冲 液(pH = 7.5)、10mM尸胺、1 OmM丙酮酸和100yM吡哆酰5 '磷酸组成的缓冲液中进行。通过向含 有尸胺的测定缓冲液中加入《-转氨酶基因产物的无细胞提取物或空载体对照来起始每个 酶活性测定反应，并接着在25°C孵育4小时，在250rpm下振荡。通过RP-HPLC定量L-丙氨酸的 形成。
[0198] 每个没有尸胺的仅酶对照具有丙酮酸到L-丙氨酸的低基线转化。见图10。
[0199] 如相对于空载体对照确认，SEQ ID N0s:7,8,9和11的基因产物接受尸胺作为底物 (见图14)，并合成5-氨基戊醛作为反应产物。考虑到co-转氨酶活性的可逆性，可以得出结 论SEQ ID N0s:7,8,9和11的基因产物接受5-氨基戊醛作为底物并形成尸胺。
[0200] 实施例5
[0201 ]使用戊二酸半醛作为底物并形成戊二醛的羧酸还原酶的酶活性
[0202]使用戊二酸半醛作为底物测定N端His标记的SEQ ID N0 6的羧酸还原酶（见实施 例2和图7)。酶活性测定法以一式三份在由终浓度为50mM的HEPES缓冲液(pH = 7.5)、2mM戊 二酸半醛、10mM MgCl2、lmM ATP和ImM NADPH组成的缓冲液中进行。酶活性测试反应通过向 含有戊二酸半醛的测定缓冲液中加入纯化的羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或 空载体对照来起始，接着在室温下孵育20分钟。通过340nm处的吸光度监控NADPH的消耗。没 有戊二酸半醛的仅酶对照证明NADPH的低基线消耗。见图11。
[0203]如相对于空载体对照确认，SEQ ID NO 6的基因产物（由sfp的基因产物增强)接受 戊二酸半醛作为底物(见图15)，并合成戊二醛。
[0204]其它实施例
[0205]应理解的是，尽管本发明已经与其详细描述一起描述，但是前面的描述意图说明 并且不限制发明的范围，发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修饰也 在权利要求的范围内。
【主权项】
1. 一种生成选自由戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，和1，5-戊二醇组成的组的 C5结构单元的方法，所述方法包括在一个或多个酶促步骤中酶促合成D-脯氨酸，并且将D-脯氨酸酶促转化为所述C5结构单元。2. 权利要求1的方法，其中从L-谷氨酸酶促合成D-脯氨酸。3. 权利要求1或2的方法，其中将D-脯氨酸酶促转化为5-氨基戊酸。4. 权利要求3的方法，其中使用D-脯氨酸还原酶将D-脯氨酸酶促转化为5-氨基戊酸。5. 权利要求1或权利要求2的方法，其中将D-脯氨酸酶促转化为戊二酸。6. 权利要求5的方法，其中使用（i )D-脯氨酸还原酶；（ii)5-氨基戊酸转氨酶;和（iii) 选自由戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸 脱氢酶，和7-氧代庚酸脱氢酶组成的组的脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化为戊二酸。7. 权利要求1或权利要求2的方法，其中将D-脯氨酸酶促转化为5-羟基戊酸。8. 权利要求7的方法，其中使用（i )D-脯氨酸还原酶；（ii)5-氨基戊酸转氨酶;和（iii) 选自由6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶组成的组的脱氢酶将 D-脯氨酸酶促转化为5-羟基戊酸。9. 权利要求6或权利要求8的方法，其中所述5-氨基戊酸转氨酶与SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。10. 权利要求7-9中任一项的方法，其中使用羧酸还原酶，醇脱氢酶，和ω -转氨酶将5-羟基戊酸转化为尸胺。11. 权利要求10的方法，其中所述ω-转氨酶归类于EC 2.6.1.18，EC 2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48,或EC 2.6.1.82下。12. 权利要求7-9中任一项的方法，其中将5-羟基戊酸转化为1，5-戊二醇。13. 权利要求12的方法，其中使用羧酸还原酶和醇脱氢酶将5-羟基戊酸转化为1，5_戊 二醇。14. 权利要求10或权利要求13的方法，其中所述羧酸还原酶与SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5,或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70%的序 列同一"性。15. 权利要求12-14中任一项的方法，其中使用醇脱氢酶和ω -转氨酶将1，5-戊二醇酶 促转化为尸胺。16. 权利要求10，11或15的方法，其中所述ω-转氨酶与SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，SEQ ID NO: 9，SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO: 11，或SEQ ID NO: 12中列出的氨基酸序列具有至少 70%的序列同一性。17. 权利要求3或权利要求4的方法，其中将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。18. 权利要求17的方法，其中使用羧酸还原酶和ω-转氨酶将5-氨基戊酸酶促转化为尸 胺。19. 权利要求18的方法，其中所述ω-转氨酶与SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，SEQ ID NO: 9,或SEQ ID NO: 10中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。20. 权利要求1或权利要求2的方法，其中使用D-脯氨酸还原酶，5-氨基戊酸转氨酶，醇 脱氢酶，羧酸还原酶，和ω -转氨酶将D-脯氨酸酶促转化为尸胺。21. 权利要求20的方法，其中所述5-氨基戊酸转氨酶与SEQ ID Ν0:7或SEQ ID Ν0:9中 列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。22. 权利要求20或权利要求21的方法，其中所述羧酸还原酶与SEQ ID NO:6中列出的氨 基酸序列具有至少70%的序列同一性。23. 前述权利要求中任一项的方法，其中完全或部分通过发酵在重组宿主中进行所述 方法。24. 权利要求23的方法，其中所述宿主经历需氧、厌氧、或微需氧培养条件下的培养策 略。25. 权利要求23或权利要求24的方法，其中所述宿主在营养限制的条件下培养。26. 根据权利要求23-25中任一项的方法，其中使用陶瓷中空纤维膜保留所述宿主来维 持发酵期间的高细胞密度。27. 权利要求23-26中任一项的方法，其中进料至发酵的主要碳源衍生于生物原料。28. 权利要求27的方法，其中所述生物原料是以下物质，或衍生于以下物质：单糖、二 糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业 废物、浓缩的酒糟可溶物，或城市废物。29. 权利要求23-26中任一项的方法，其中进料至发酵的主要碳源衍生于非生物原料。30. 权利要求29的方法，其中所述非生物原料是以下物质，或衍生于以下物质:天然气、 合成气、C02/H 2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗废物 流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。31. 权利要求23-30中任一项的方法，其中所述宿主是原核生物。32. 权利要求31的方法，其中所述原核生物来自埃希氏菌属如大肠杆菌;来自梭菌属如 杨氏梭菌、自产乙醇梭菌或克氏梭菌;来自棒状杆菌属如谷氨酸棒状杆菌;来自贪铜菌属如 钩虫贪铜菌或耐金属贪铜菌;来自假单胞菌属如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或者食油假 单胞菌;来自代尔夫特食酸菌属;来自芽孢杆菌属如枯草芽胞杆菌;来自乳杆菌属如德氏乳 杆菌;来自乳球菌属如乳酸乳球菌或来自红球菌属如马红球菌。33. 权利要求23-30中任一项的方法，其中所述宿主是真核生物。34. 权利要求33的方法，其中所述真核生物来自曲霉属如黑曲霉;来自酵母属如酿酒酵 母;来自毕赤氏酵母属如巴斯德毕赤酵母;来自耶氏酵母属如解脂耶氏酵母;来自伊萨酵母 属如东方伊萨酵母；来自德巴利氏酵母属如汉逊德巴利氏酵母；来自Arxula属如Arxula adenoinivorans;或者来自克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母。35. 权利要求23-34中任一项的方法，其中所述宿主包含一种或多种以下减弱的酶:聚 羟基脂肪酸酯合酶;磷酸丙糖异构酶;葡萄糖-6-磷酸异构酶;转氢酶;NADH特异性谷氨酸脱 氢酶;NADH/NADPH利用型谷氨酸脱氢酶;戊二酰-CoA脱氢酶;或戊二酰-CoA合成酶。36. 权利要求23-35中任一项的方法，其中所述宿主过表达编码以下酶的一种或多种基 因：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；丙酮酸羧化酶；6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；转酮醇酶；吡啶 (puridine)核苷酸转氢酶；甲酸脱氢酶;甘油醛-3P-脱氢酶;苹果酸酶;葡萄糖脱氢酶;葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶;果糖1，6二磷酸酶;L-丙氨酸脱氢酶;L-谷氨酸脱氢酶;L-谷氨酸合成酶； 赖氨酸转运体;二羧酸转运体;和/或多药转运体。37. -种重组宿主，包含至少一种编码以下酶的外源性核酸：（i)D-脯氨酸还原酶，（ii) 5-氨基戊酸转氨酶，和(i i i)脱氢酶，所述宿主产生戊二酸或5-羟基戊酸。38. 权利要求37的重组宿主，其中所述宿主产生5-羟基戊酸且所述脱氢酶选自下组:6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶。39. 权利要求37的重组宿主，其中所述宿主产生戊二酸且所述脱氢酶选自下组:戊二酸 半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，和7-氧 代庚酸脱氢酶。40. 权利要求37或权利要求38的重组宿主，所述宿主进一步包含外源性羧酸还原酶和 外源性醇脱氢酶，所述宿主进一步产生1，5-戊二醇。41. 权利要求37或权利要求38的重组宿主，所述宿主进一步包含外源性羧酸还原酶，外 源性醇脱氢酶，和至少一种外源性ω-转氨酶，所述宿主进一步产生尸胺。42. 权利要求40的重组宿主，所述宿主进一步包含至少一种外源性ω -转氨酶和可选的 第二和/或第三外源性醇脱氢酶，所述宿主进一步产生尸胺。43. 权利要求41-42中任一项的重组宿主，其中所述至少一种外源性ω-转氨酶与SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID N0:10，SEQ ID ΝΟ:11，或SEQ ID ΝΟ:12中列 出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。44. 权利要求41-43中任一项的重组宿主，其中所述宿主包含两种不同的外源性ω-转 氨酶。45. 权利要求37-44中任一项的重组宿主，其中所述5-氨基戊酸转氨酶与SEQ ID ΝΟ:7 或SEQ ID NO :9中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。46. -种重组宿主，其包含至少一种编码以下酶的外源性核酸：（i)D-脯氨酸还原酶， (i i)羧酸还原酶，和(i i i) ω -转氨酶，所述宿主产生尸胺。47. 权利要求46的重组宿主，，其中所述ω-转氨酶与SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，SEQ ID N0:9,或SEQ ID NO: 10中列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。48. 权利要求43或权利要求44的宿主，所述宿主进一步包含外源性5-氨基戊酸转氨酶。49. 权利要求46的宿主，其中所述5-氨基戊酸转氨酶与SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:9中 列出的氨基酸序列具有至少70%的序列同一性。50. 权利要求40-49中任一项的重组宿主，其中所述羧酸还原酶与SEQ ID NO: 1，SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 5,或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70%的序 列同一"性。51. 权利要求49的重组宿主，其中所述羧酸还原酶与SEQ ID N0:6中列出的氨基酸序列 具有至少70 %的序列同一性。52. -种重组宿主，其包含至少一种编码以下酶的外源性核酸：（i)5-氨基戊酸转氨酶， 和(i i)脱氢酶，所述宿主产生戊二酸或5-羟基戊酸。53. -种重组宿主，其包含至少一种编码以下酶的外源性核酸：（i)羧酸还原酶和（ii) ω_转氨酶，所述宿主产生尸胺。
【文档编号】C12P13/00GK105849272SQ201480057625
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年8月27日
【发明人】A.L.博特斯, A.V.E.康拉迪
【申请人】英威达技术有限责任公司