2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于化学药物领域，具体涉及2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其结构如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法和用途。本发明提供的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物均具有良好的安全性，在抗肿瘤、抗脏器纤维化、调节免疫、抗消化道炎症和溃疡，以及抗真菌等多方面具有明确药效，为制备治疗上述作用相关疾病的药物提供了新的选择。
【专利说明】
2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于化学药物领域，具体涉及2位和/或27位取代的桦木酸衍生物及其制 备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 桦木酸（betulinic acid)为羽扇豆烷型五环三萜类化合物，广泛分布于鼠李科、 桃金娘科、桦木科等多种植物中，但普遍含量较低。由于桦木酸的母环结构较大，使得其分 子极性较小，脂溶性较大。因此，桦木酸在水中的溶解度较小，易溶于乙醚，氯仿、乙醇等有 机溶剂。桦木酸对黑素瘤细胞具有极强的选择性细胞毒性（Pisha E，Chai H，Lee I S，et al. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis [J]· Nat Med，1995, I (10) :1046-1051);诱导初级 胶质母细胞瘤细胞凋亡率远远高于长春新碱和亚硝基脲（Jeremias I, Steiner H H, Benner A, et al. Cell death induction by betulinic acid, ceramide and TRAIL in primary glioblastoma multiforme cells [J]· Acta Neurochir, 2006, 146(7) :721-729);能与许 多细胞毒性化合物如多柔比星、紫杉醇、依托泊昔、放线菌素 D联合用药，且具有协同作用， 有望作为增效剂，用于肿瘤化学联合疗法，避免多药耐药性的产生，增强抗肿瘤药的治疗 效果（Eder-Czembirek C, Czembirek C, Erovic B M, et al. Combination of betulinic acid with ci splat in-different cytotoxic effects in two head and neck cancer cell lines[J]· Oncol Rep, 2005, 14(3) :667-671);能在病毒生命周期的几乎全部环节抑 制 H9 淋巴细胞中 HIV 的复制（Mayaux J F, Bousseau A, Pauwels R,et al. Triterpene derivatives that block entry of human immunodeficiency virus type I into cells [J]. Pro Nat Acad Sci, 1994, 91 (9) :3564-3568)。此外，桦木酸还具有免疫调节、抗 炎、抗氧化应激、抗菌、抗寄生虫、抗疟疾及抗溃疡等多种活性（易金娥，邬静，文利新， 等.桦木酸的药理作用研究进展.中草药，2014, 45 (14): 2118-2124)。随着对桦木酸药理 活性的认识不断加深，不少研究者尝试以桦木酸为母核进行结构修饰，以求提高其溶解度， 增加其生物利用度，降低其毒性。对桦木酸的结构修饰主要集中在三个位置：C-3位、C-20 位和C-28位。
[0003] 在文献《桦木酸及其衍生物的研究进展》（李丹，周金培，吴晓明.[J].药学进 展，2004, 28 (3) :120-125)中：
[0004] (1)对3位羟基的改造一般是以吡啶作溶剂，与各种环状二酸酐反应，合成末端带 羧酸基的酯。这一类型的改造还是比较成功的。如表1所示，化合物3、4、5与桦木酸相比， 活性大大增强。说明该类型的酰基可能增强抗HIV活性。对桦木酸及其类似物白桦素3位 羟基的其它改造，如将β位羟基改为α位、羟基改为羰基、醇改为酰胺等，大都造成活性 增强。说明发挥活性时关键的氢键反应可能与3β位的氧相关。其中，化合物3(DSB，又称 YK-FH312)，尤其引人注目。Taisei Kanamoto等的研究结果显示，YK-FH312可能是通过作 用于病毒粒子装配和（或）病毒粒子出芽步骤实现抗HIV活性。
[0005] (2)对桦木酸19位异丙烯基的改造未得到很令人满意的结果。在30位上取代， 活性保持，但酸性基团取代对活性明显有害；碳20位改为酮或肟，失活或活性降低；19位改 为酰基或酸性基团，会导致失活。说明高电负性的氧原子可能改变桦木酸的静电性，使其细 胞毒性降低。改造19位获得的唯一成功是二氢桦木酸（Dihydrobetulinic acid)及其衍 生物。二氢桦木酸是HIV与细胞膜的融合抑制剂。它的抗HIV测定以H9细胞为感染模型， IC50为12. 6 ymol/L，EC50 = 0· 9 ymol/L。以二氢桦木酸为先导物，经修饰后得到的化合 物7的治疗指数为14000,抗HIV活性比其先导物高约1000倍。
[0006] (3) 28位羧基是当前桦木酸的修饰热点，对其修饰得到的衍生物种类繁多。在近年 的研究中，对28位羧基的结构改造以生物活性为指导，逐渐集中于将羧酸基转变成各种酰 胺，而且在这些酰胺类衍生物中大多数的支链末端都保留了羧酸基。现将比较有代表性的 化合物加以介绍。如表2所示，该类衍生物的酰胺链较短时活性不好。酰胺链较长的时候R =CONH(CH2)" C00H，m = 7-11 时活性有意义，m = 10 时活性最强；R = CONH(CH2) 7C0NH(CH2) nC00H，η = 1-4 时活性比前面m = 7、10 都有提高；R = CONH(CH2) 7NHC0 (CH2) n C00H，η = 1-3 时活性又有提高。另外，可能因为胺部分和相邻质子相互作用对羧酸基起到空间定位的作 用，链中第一个CONH，N上有取代，CONH变成NHCO或NHC0NH，都失活。第二个C0NH:①与小 的α -氨基酸（该氨基酸包含1-2个甲基的亲脂性部分）相连，活性增加。②与邻位的苯甲 酸相连，失活；与间位、对位的苯甲酸相连，IC50可达IOOnmoI/L左右。③若CONH换成NHCO， 活性便增强。该类衍生物中最著名的是RPR103611，它通过抑制病毒和细胞膜融合过程中的 后结合，即包膜依赖性阶段来抑制HIV感染（IC50 = lOnmol/L)，是目前唯一通过影响gp41 来阻止HIV入侵的小分子非肽类物质，有希望开发成为HIV细胞膜融合剂。PRP103611的 旋光异构体IC9564. (34.)在病毒感染性降低测定K NL4-3的IC90 = 0. 22±0. 05 μπιο?/ L，显示出很强的抗HIV活性。而在IC9564的系列衍生物中，较突出的是化合物35(EC50 = 0. 33ymol/L)和 36(EC50 = 0. 46 ymol/L)，它们的活性与 IC9564 相当。研究显示，IC9564. 能强力阻断HIV-I外壳介导的膜融合，从而在穿入步骤阻断HIV的复制。这个过程中的关 键物质HIV-lgpl20是IC9564作用的分子靶点。
[0007] 在文献《23-羟基白桦酸衍生物抗肿瘤作用的三维定量构效关系及分子对接模式》 (张婷婷，毕毅，陈蒙蒙等.[J].中国药学杂志，2014, 49 (14) :1200-1203)中：23-羟基白桦 酸衍生物（结构如下图）也是五环三萜类化合物，是一种从中药白头翁中分离得到的白桦 酸类似物，具有与白桦酸相当的抗肿瘤活性，但其作用机制目前正在研究之中。该实验室前 期合成了大量的23-羟基白桦酸衍生物并对其进行了抗肿瘤活性研究，研究表明，28-C00H 是影响该类化合物抗肿瘤活性的主要部位。
[0008] 到目前为止，对C-3位羟基和C-28位羧基的改造已取得一定进展，但C-20位的结 构修饰和改造尚缺乏令人满意的结果。其它位置取代的桦木酸衍生物则未见报道。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其结构如式I所示：
[0010]
[0011] 其中，R1、私独立地为
[0012] R3、R4、1?5独立地为-H、卤素、羟基、Cl~C6烷基、Cl~C6烷氧基、乙酰氧基或乙 酰基；
[0013] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0014] 优选的，R!、私独立地为-H、羟基、
[0015] R3、R4、1?5独立地为-H、-F、 -C1、-Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0016] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0017] 进一步优选的，R1、R2独立地?
[0018] R3、R4、1?5独立地为-Η、-F、 -C1、-Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0019] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0020] 更进一步优选的，Rp私独立地〉
[0021] R3、R4、1?5独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙酰氧 基或乙酰基；
[0022] X为氧原子。
[0023] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，当，其结构如式 II所示：
[0024]
[0025] 其中，私为-Η、美
[0026] R3、R4、1?5独立地为-Η、卤素、羟基、Cl~C6烷基、Cl~C6烷氧基、乙酰氧基或乙 酰基；
[0027] X为氧、氮、硫或碳原子
[0028] 优选的，私为-H、羟基、
[0029] R3、R4、1?5独立地为-H、-F、 -C1、-Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0030] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0031] 进一步优选的，R2为
[0032] R3、R4、1?5独立地为-H、-F、 -C1、-Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0033] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0034] 更进一步优选的，R2^
[0035] R3、R4、1?5独立地为-H、-F、 -C1、-Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0036] X为氧原子。
[0037] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，当f 吋，其结构如 式III所示：
[0038]
[0039] 其中，!^为-H、羟基
[0040] R3、R4、1?5独立地为-H、卤素、羟基、Cl~C6烷基、Cl~C6烷氧基、乙酰氧基或乙 酰基；
[0041] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0042] 优选的，&为-H、羟基、
[0043] R3、R4、R5独立地为-H、-F、-C1、 -Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0044] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0045] 进一步优选的，R1为'
[0046] R3、R4、R5独立地为-H、-F、-C1、 -Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0047] X为氧、氮、硫或碳原子。
[0048] 更进一步优选的，F
[0049] R3、R4、R5独立地为-H、-F、-C1、 -Br、羟基、Cl~C4烷基、Cl~C4烷氧基、乙醜氧 基或乙酰基；
[0050] X为氧原子。
[0051] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法，包括以下 步骤：
[0052] a、用95% wt乙醇浸提马甲子鲜叶2~4次，每次浸提24h，合并浸出液并过滤，滤 液浓缩后得浸膏；再将浸膏在20% wt乙醇水溶液中超声溶解后，用乙酸乙酯萃取；
[0053] b、萃取的乙酸乙酯层浓缩后，经柱层析后得到粗品；所述柱层析洗脱液为石油醚 与乙酸乙酯的混合溶液，其体积比依次为20 : 1、15 : 1、10 : 1、5 : 1、3 : 1、1 : 1;所 述柱层析的显色剂为5%香草醛浓硫酸液；
[0054] c、上述粗品用70% wt乙醇和DMF加热溶解，过滤除去不溶物，滤液经制备液相色 谱分离纯化，浓缩干燥得到2位和/或27位取代的桦木酸衍生物。
[0055] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述马甲子鲜叶 与95% wt乙醇的质量比为1 : 10。
[0056] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述浸膏与20 % wt乙醇水溶液的质量体积比（kg/L)为1 : 10。
[0057] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤c所述的制备液相 色谱采用乙酸-乙腈系统梯度洗脱纯化；所述乙酸-乙腈系统中乙酸的体积含量为3%~ 90 %梯度增加。
[0058] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的盐。
[0059] 本发明还提供了本发明化合物的前药，依据本发明，前药是上述化合物的衍生物， 它们自身可能具有较弱的活性或甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下（例如通过 代谢、溶剂分解或另外的方式）被转化成相应的生物活性形式。
[0060] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的水合 物。
[0061] 本发明还提供一种药物组合物，是由本发明提供的上述2位和/或27位取代的桦 木酸衍生物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。本发明提供的2位和/或27 位取代的桦木酸衍生物结构如式I~III所示。
[0062] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制 备具有抗纤维化药物中的用途。
[0063] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制 备具有抗真菌活性药物中的用途。
[0064] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制 备具有抗肿瘤活性药物中的用途。
[0065] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制 备具有双向免疫调节作用的药物中的用途。
[0066] 本发明还提供了上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、它的盐或水合物在制 备具有抗消化道炎症及溃疡的药物中的用途。
[0067] 本发明提供的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物均具有良好的安全性，在抗肿 瘤、抗脏器纤维化、调节免疫、抗消化道炎症和溃疡，以及抗真菌等多方面具有明确药效，为 制备治疗上述作用相关疾病的药物提供了新的选择。
【具体实施方式】
[0068]
[0069] 式I所示2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0070] a、用95% wt乙醇浸提马甲子鲜叶2~4次，每次浸提24h，合并浸出液并过滤，滤 液浓缩后得浸膏；再将浸膏在20% wt乙醇水溶液中超声溶解后，用乙酸乙酯萃取；
[0071] b、萃取的乙酸乙酯层浓缩后，经柱层析后得到粗品；所述柱层析洗脱液为石油醚 与乙酸乙酯的混合溶液，其体积比依次为20 : 1、15 : 1、10 : 1、5 : 1、3 : 1、1 : 1;所 述柱层析的显色剂为5%香草醛浓硫酸液；
[0072] c、上述粗品用70% wt乙醇和DMF加热溶解，过滤除去不溶物，滤液经制备液相色 谱分离纯化，浓缩干燥得到2位和/或27位取代的桦木酸衍生物。
[0073] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述马甲子鲜叶 与95% wt乙醇的质量比为1 : 10。
[0074] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤a所述浸膏与20 % wt乙醇水溶液的质量体积比（kg/L)为1 : 10。
[0075] 上述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物的制备方法中，步骤c所述的制备液 相色谱采用3%乙酸-乙腈系统梯度洗脱纯化；所述乙酸-乙腈系统中乙酸的体积含量为 3%~90%梯度增加。
[0076] 实施例1化合物1的制备
[0077]
[0078] 称取马中于鲆叶4kg，10借重95%乙醉分二次冷浸，母次浸提24h，甘开浸出液并 过滤，滤液减压浓缩后得浸膏。取浸膏300g加入20 %的乙醇水液3L，超声溶解，依次用石 油醚（1X3L)、乙酸乙酯（3X6L)萃取，分别取水层、石油醚层、乙酸乙酯层，上液相检测，结 果显示目标成分大部分进入乙酸乙酯层，而水液中无目标成分、石油醚层有少量目标成分。
[0079] 乙酸乙酯层浓缩至刚有固体析出，趁热倒出搅拌均匀并加少量乙酸乙酯溶解至无 固体颗粒，取100-200目硅胶500g拌样，硅胶I. 5kg湿法装柱，将拌样硅胶完全烘干后干法 上样。分别吸取小样进行洗脱条件摸索，得出结果，采用石油醚/乙酸乙酯系统进行洗脱， TLC进行监测，显色剂为5%香草醛浓硫酸液。最初以石油醚/乙酸乙酯20 :1洗脱液IOL 循环洗脱，层析柱上有一橙黄色带下移至距底端1/3处，此时开始以4L/瓶等流份收集并编 号。第1-3瓶皆无斑点；从第4瓶开始将洗脱比例换作15 :1 ;第5-6瓶开始出现较为明显 的单点，点板结果一致，合并，上液相进行检测，320nm下无明显吸收，非目标成分；第7瓶开 始将洗脱比例换作10 :1，至第12瓶点板显色为多个紫点，液相检测依然无明显吸收，非目 标段；第13-14瓶点板显色有黄点出现，液相检测能观察到20min之前的两个峰；第15瓶将 洗脱比例换作5 :1，点板显色紫点消失，浅黄色斑点出现，液相检测无明显吸收，非目标段； 第17瓶开始将洗脱比例换作3 :1，点板显色绿点出现，液相检测无明显吸收，非目标段；， 至第20瓶浅黄点、绿点消失，分别液相检测无明显吸收，非目标段；第21瓶开始，液相图谱 上开始出现50min之后的多个峰，但30min前后的峰均未出现，至第25瓶洗脱比例换作1 : 1，点板显色绿点消失，液相检测依然为50min之后的多个峰；以洗脱比例1:1至第27瓶， 液相检测目标段开始出现，至第32瓶，点板显色及液相检测目标段已完全洗脱下来。合并 27-32瓶并浓缩，甲醇冲洗柱子，液相检测，目标段确认无残留。虽目标段相对独立地分离出 来，然而50min以后的几个峰依然随着目标段出现，且目标段极性较大，预上制备液相进行 分呙。
[0080] 目标段采用70%乙醇和少量DMF加热溶解，滤出不溶物，滤出固检测无目标峰，弃 之，滤液过柱，纯化，采用3 % HAc-ACN系统梯度洗脱纯化，收集目标峰，浓缩干燥得化合物 1，液相检测纯度> 97. 26%。
[0081] 化合物 1 为 土黄色粉末状固体。HRE頂S m/z 779. 4173 [M-H] (cal C48H6qO9-H 779. 4237)。
[0082] 1HNMRaw 0. 91(Me-23), δΗ 0. 73 (Me-24), δΗ 0. 92 (Me-25), δΗ 0. 92 (Me-26), δΗ 1.69(Me-30), δΗ 4. 70 (br s, Η-29), δΗ 4. 58 (br s,H-29), δΗ 6. 30 (d, J = 18Ηζ,Η-α), δΗ 7. 54(d, J = 18Ηζ,Η-β), δΗ 6. 38 (d, J = 18Ηζ,Η-α r ) and δ Η 7· 54(d, J = 18Ηζ, Η-β，）。13C-NMR δ c 115. 1(d), 144.6(d), 114.4(d)and 144.0(d), δ c 109.7(t),5c 159. 8 (s), 159. 6 (s), δ c 78. I (d), δ c166. 6 (s) and 166.3(s),5c 177. 2 (s)。
[0083] 实施例2化合物2和化合物3的制备
[0084]
[0085]
[0086] 采用与制备化合物1相似的方法，制备得到化合物2和化合物3。
[0087] 本发明实施例3~9采用的细胞株、试剂的来源为：宫颈癌细胞株Hela、人肝癌细 胞株H印G-2、人肺癌细胞株A549、人白血病细胞株K562、人胃癌细胞株MGC-803、小鼠结肠 癌细胞株C26、真菌菌块均由成都宝科生物科技有限公司提供。胎牛血清及其相应培养基购 自美国Hyclone公司；MTT、DMS0、西黄芪胶、戊巴比妥钠、TNBS、植烷（pristane)购自美国 sigma公司；环磷酰胺（CTX)购自江苏恒瑞医药股份有限公司；地塞米松购自海南制药厂有 限公司；四氯化碳购自成都试剂厂；丙氨酸转氨酶（ALT)购自南京建成；ELISA、III型前胶原 (PC-III)、透明质酸（HA)购自武汉华美；层黏连蛋白（LH)购自上海西唐；雷公藤多苷，购自 黄石飞云制药有限公司；云芝多糖购自上海康舟真菌多糖有限公司；4-二硝氟苯（DNFB)购 自美国sigma公司。
[0088] 实施例3化合物1的体外抗肿瘤试验
[0089] 取处于对数生长期的各种肿瘤细胞（采用的肿瘤细胞株有如下几种：宫颈癌细胞 株Hela ;人肝癌细胞株H印G-2 ;人肺癌细胞株A549 ;人白血病细胞株K562 ;人胃癌细胞株 1^(：-803;小鼠结肠癌细胞株026)，制备细胞悬液，用含有10%胎牛血清的相应培养基将细 胞浓度调为IX IO5个/mL细胞悬液后，将细胞接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液200 μ L， 次日分别加入一定浓度无菌的化合物1溶液，混匀后置37°C、5% CO2孵箱中培养24h后，析 出培养液并用PBS洗涤两次，再向每孔加入5mg/mL的MTT磷酸缓冲液20 μ L以及150 μ L 培养基，同样条件下继续培养4h后终止培养。2000rpm离心5min，然后弃去培养板孔内的 培养液，每孔加入150 μ L DMSO，震荡lOmin，使形成的甲臜颗粒充分溶解后，酶标仪检测吸 光值。选择测定波长为490nm。计算化合物1对肿瘤细胞的IC50,结果见表1。
[0090] 表1化合物1对多种肿瘤细胞的抑制作用
[0092]
[0093] 上述结果表明，化合籾i共仴棒外仰熘忭用。
[0094] 实施例4化合物1对荷S180小鼠的影响
[0095] 选取接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后抽取腹水，以无菌生 理盐水按1 : 4(腹水体积：生理盐水体积）混悬备用。雄性昆明种小鼠60只，18~20g， 按体重分层随机均分为5组，分别为模型对照组（0. 5 %西黄芪胶）、阳性对照组（环磷酰 胺，CTX)、化合物1组，均在其右侧腋部皮下接种0. 2mL前述混悬液。2h后模型对照组和药 物组分别灌胃给予受试物或混悬剂，每日一次，连续14日；阳性对照组腹腔注射给予CTX， 隔日一次，共7次。末次给药后24h颈椎脱白处死小鼠，剥离瘤块称重，并计算抑瘤率（(1 一 实验组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）*100% )。
[0096] 表2化合物1对荷S180小鼠的影响（r±s)
[0098] 与模型对照组比较，*P < 0· 05,林P < 0· 01。
[0099] 实验结果表明，化合物1给予400mg/kg灌胃，可抑制S180在小鼠体内的生长，具 有较好的抗肿瘤活性。
[0100] 实施例5化合物1对2, 4, 6-三硝基甲苯磺酸（TNBS)所致大鼠实验性结肠炎的影 响
[0101] SD大鼠72只，按体重分层随机均分为6组，分别为假手术对照组（0. 5%西黄芪 胶）、模型对照组（〇. 5%西黄芪胶）、阳性对照组（地塞米松）、化合物1成分组。动物禁食 24h后以戊巴比妥钠麻醉，除生理盐水组外，用TNBS和40%乙醇灌肠，复制实验性结肠炎模 型；假手术对照组仅以生理盐水灌肠。造模后6h，给予受试物。给药第5d，尾静脉取血行白 细胞计数。第6d以乌拉坦麻醉，腹主动脉取血后脱颈椎处死动物，从肛门向上截取9cm结 肠，在冰浴中沿肠系膜缘剪开肠腔，漂洗内容物，测量溃疡面积，计算溃疡面积百分比；结肠 称重后刮取结肠黏膜，ELISA测定肿瘤坏死因子（TNF-a)浓度。
[0102] 表3化合物1对TNBS所致大鼠实验性结肠炎的影响（η=12^士s)
[0103]
[0104] 与模型对照组比较，*P < (λ 05, #P < (λ 01。
[0105] 结果如表3所示，TNBS所致大鼠实验性结肠炎可出现炎性细胞增加、炎性细胞因 子水平上升及结肠表面溃疡。化合物1可显著抑制白细胞及重要致炎因子TNF-α的升高， 减少溃疡面形成，具有较好的抗结肠炎作用。
[0106] 实施例6化合物1对大鼠实验性肝纤维化的影响
[0107] SD大鼠60只（200_240g，雄性），按体重分层随机均分成空白对照组（0. 5%西黄 芪胶）、模型对照组（〇. 5%西黄芪胶）、阳性对照组（地塞米松，lmg/kg)、化合物1成分组 (40mg/kg)。除空白对照组外，均按lmL/kg皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，每周2次， 连续3月，同时给予高脂饲料以及5 %的乙醇水溶液。灌胃给予受试物，每日1次，连续3月。 给药结束后次日腹主动脉取血，分离血浆，测定丙氨酸转氨酶（ALT)、111型前胶原（PC-III)、 透明质酸（HA)和层黏连蛋白（LH)水平；随后处死动物，取肝脏进行病理学检查。
[0108] 血清生化检测结果如表4。
[0109] 表4化合物1对实验性肝纤维化大鼠肝脏及血液生化指标的影响^=;^, ) L0111J 与模型对照组Κ牧，Ub，林P<U·
U丄。
[0112] 表4的结果显示，与模型组相比，化合物1对四氯化碳所致实验性肝纤维化大鼠肝 损伤有一定的保护作用，各指标明显改善。
[0113] 病理学检查显示，模型组大鼠肝细胞水样变性明显，有明显的肝细胞坏死和脂肪 变性，表现为明显肝纤维化；化合物1组肝细胞水样变性和脂肪变性程度较模型组明显降 低，提示其对肝纤维化有良好抑制作用。
[0114] 实施例7化合物1对小鼠实验性红斑狼疮的治疗作用及对细胞免疫的影响
[0115] KM小鼠72只，按体重分层随机均分为6组，分别为混悬剂对照组（0. 5%西黄芪 胶）、模型对照组（〇. 5%西黄芪胶）、阳性对照组（雷公藤多苷）、化合物1成分组。除混悬 剂对照组外均按0. 5mL/只腹腔注射降植烷（pristane)，灌胃给予药物或混悬剂，每日1次， 连续30d。末次药后24h眼眶采血，4°C冷冻离心分离血清，ELISA测定血清中抗dsDNA抗体 水平。
[0116] 另取一批动物同样分组及复制模型，注射pristane后第24日，除混悬剂对照 组外，各组动物腹腔注射5 %鸡红细胞生理盐水悬液0. 2mL/只，并继续给药持续至注射 pristane后第30日。末次给药后24h于眼眶取血20 μ L，加入ImL生理盐水中，随后分别 加入4%鸡红细胞生理盐水悬液0. 5ml和10%豚鼠血清0. 5mL，混匀后于37°C孵育0. 5h， 3000rpm离心10min，取上清液lmL，加入3mL都氏液，540nm比色。
[0117] 表5化合物1对实验性红斑狼疮小鼠的影响（n= i 2,、土s)
[0119] 与模型对照组比较，*P < 0· 05, #P
< 0· 01。
[0120] 结果如表5所示，化合物1可有效降低实验性红斑狼疮小鼠血清中dsDNA抗体水 平，提示其可用于红斑狼疮治疗。红斑狼疮可表现为体液免疫异常升高，本实验显示模型动 物溶血素水平显著高于正常动物，化合物1可有效降低此异常升高的溶血素水平，提示这 些化合物对异常免疫功能亢进有显著抑制作用。
[0121] 实施例8化合物1对免疫低下小鼠特异性免疫功能的影响（2,4-二硝氟苯所致耳 肿胀法）
[0122] KM小鼠60只，按体重分层随机均分为6组，分别为混悬剂对照组（0. 5%西黄芪 胶）、模型对照组（0.5%西黄芪胶）、阳性对照组（云芝多糖）、化合物1成分组。灌胃给予 试验药物或混悬剂，每日1次，连续14d。除混悬剂对照组外，给药第8、10、12d按25mg/kg腹 腔注射给予环磷酰胺生理盐水溶液，造成免疫低下。给药第9d以1% 2,4_二硝氟苯（DNFB) 溶液（取IOOmgDNFB加入到I : 1的丙酮-植物油混合物中混勾，定容至IOmL) 25 μ L涂抹 小鼠腹部。至第13d给药后lh，取10 μ L 1 % DNFB溶液涂抹于小鼠左耳；涂抹后24h，即末 次给药后lh，颈椎脱白处死动物，耳片称重，计算耳肿胀度。
[0123] 表6化合物1对免疫低下小鼠 DNFB所致耳肿胀的影响（n二丨〇 j±s)
[0125] 与模型对照组比较，*P < 0· 05, **P < 0· 01。
[0126] 结果如表6所示，化合物1可提高免疫低下小鼠的DNFB所致耳肿胀程度，提示其 对免疫低下动物的细胞免疫功能具有增强作用，具有较好的增强免疫低下动物特异性免疫 的作用。
[0127] 实施例9化合物1的体外抗真菌试验
[0128] 称取化合物12mg，用5%异丙醇溶液溶解配制至10mL，0. 22 μ m滤膜过滤除菌。取 ImL除菌上述溶液，加入到9mL熔融后冷却至约50°C的PDA培养基中，充分摇勾，迅速倒入 直径为6cm的培养皿中，静置，制成含有20 μ g/mL受试化合物的PDA培养平板。用相同体 积的5%异丙醇溶液制成空白对照PDA培养平板。
[0129] 将切取好的真菌菌块接种体移入上述含药PDA培养平板，25°C恒温培养，待对照 组菌落接近培养皿边缘时，用十字交叉法测定所有培养平板上的菌落直径，校正后计算抑 菌率。
[0130] 表7化合物1对各种真菌的抑制效果（n=3, I士s)
[0132] 结果如表7所示，化合物1对受试的各类真菌具有明显的抑制作用。由于受试真 菌均为常见致病真菌，具有明显的代表性，该结果提示化合物1具有较强抗真菌活性，可用 于抗真菌类药物的制备。
【主权项】
1. 2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其结构如式I所示：其中，Ri、私独立地为-H、羟基、R3、R4、1?5独立地为-H、卤素、羟基、C1~C6烷基、C1~C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子。2. 根据权利要求1所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于： 1^、1?2独立地为-11、羟基、R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子。3. 根据权利要求2所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于： 1^、1?2独立地为R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子。4. 根据权利要求3所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于： 1^、1?2独立地为R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧原子。5. 根据权利要求1所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：当R?，其结构如式II所示：II 其中，私为-Η、羟基、R3、R4、1?5独立地为-Η、卤素、羟基、C1~C6烷基、C1~C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子。6. 根据权利要求5所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于： 私为-H、羟基、R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子； 进一步优选的，私为R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子； 更进一步优选的，私为R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧原子。7. 根据权利要求1所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于：当R 2为时，其结构如式III所示：其中，RiS-H、羟基、R3、R4、1?5独立地为-Η、卤素、羟基、Cl~C6烷基、Cl~C6烷氧基、乙酰氧基或乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子。8.根据权利要求7所述的2位和/或27位取代的桦木酸衍生物，其特征在于： 札为-H、羟基、R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子； 进一步优选的，札为R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧、氮、硫或碳原子： 更进一步优选的，札为R3、R4、馬独立地为-H、-F、-Cl、-Br、羟基、C1~C4烷基、C1~C4烷氧基、乙酰氧基或 乙酰基； X为氧原子。9. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的 盐。10. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物药学上可接受的 水合物。11. 一种药物组合物，是由权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸 衍生物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的。12. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所 述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗纤维化药物中的用途。13. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所 述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗真菌活性药物中的用途。14. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所 述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗肿瘤活性药物中的用途。15. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所 述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有双向免疫调节作用的药物中的用途。16. 权利要求1~8任一项所述2位和/或27位取代的桦木酸衍生物、权利要求10所 述的盐或权利要求11所述的水合物在制备具有抗消化道炎症及溃疡的药物中的用途。
【文档编号】A61P35/00GK105859822SQ201510024341
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月19日
【发明人】徐超群, 李东晓, 陈雏, 张毅, 阮佳, 詹雁, 谭镭, 袁志翔, 余悦, 白筱璐
【申请人】四川省中医药科学院