一株蜡状芽孢杆菌及其培养方法与应用

一株蜡状芽孢杆菌及其培养方法与应用
【专利摘要】本发明涉及一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)及其培养方法与应用。一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#，已于2015年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.11273。本发明还涉及该菌株的培养方法与应用。本发明所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#，是从电动力学修复后的石油污染盐碱土壤中筛选得到的高效石油降解菌，具有培养简单、降解石油迅速、耐盐和耐电的特点，在液体摇瓶中一周的石油降解率可达到10％。CGMCC No.1127320150825
【专利说明】
一株蜡状芽孢杆菌及其培养方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株錯状芽孢杆菌(Bacillus cereus)及其培养方法与应用，特别涉 及一株耐盐的可降解石油的并且与电动力学修复技术协同性良好的蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着经济社会的发展，人类对石油的需求越来越多，进而催生了石油开采业和加 工业的迅猛发展。石油在开采、加工、运输和贮存的过程中，由于泄漏、蒸发和事故等原因造 成严重的土壤石油污染，破坏土壤环境，危害动植物和微生物生存。石油烃成分复杂，部分 成分具有三致效应，其进入食物链中，对人体健康构成威胁，阻碍了经济社会的可持续发 展。
[0003] 我国油田地区土壤除了面临石油污染的问题之外，还存在盐碱化的问题。一方面 是由于气候等自然因素造成土壤盐分本底值较高，二是在石油开采过程中会出现大量油田 产出水，其含盐量较高，造成油田区土壤盐渍化。油盐双重问题进一步加大了土壤治理难 度，亟待找到一种高效快捷的石油污染盐碱土壤修复技术。
[0004] 现在对于石油污染土壤的处理技术主要有物理、化学和微生物方法，前两种方法 主要包括客土、土壤淋洗、加热分解、添加氧化剂等，处理成本较高并且对土壤本底的影响 较大，限制了其应用范围。微生物技术因为其价格低廉、管理应用方便等独特优势成为现在 石油污染土壤修复工作中的主要技术。但由于其适应性较差，对土壤条件要求比较高，修复 周期长，因此对于盐碱类石油污染土壤，其应用遭遇瓶颈。
[0005] 电动-微生物技术是近几年发展起来的一门新兴技术，相关研究已经证明其处理 常规石油污染土壤的可行性，修复周期短并获得了较高的石油降解效率。但由于盐碱土壤 盐分较高，目前所用菌株很难发挥降解活性，因此筛选耐盐并且在电场中活性较高的石油 降解菌是该技术能够应用于石油污染盐碱土壤修复工作中的关键。
[0006] 中国专利文献CN103160448A(申请号201110415635.4)公开了一株适合于电场条 件下的石油经降解菌及其应用。该发明的地衣芽孢杆菌(BaciIlus licheniformis)PS5分 离自石油污染土壤，能够降解石油烃，已于2011年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中 心，其保藏登记号为CCTCC No:M 2011261。所述地衣芽孢杆菌PS5用于污染土壤的修复。该 发明分离得到的菌株在0.5~2.OV/cm电场条件作用下具有较高的活性，能提高烷烃、芳烃 和胶质及混合石油烃的去除率。在施加电场后，地衣芽孢杆菌PS5的降解活性增强，28天后 对石油烃单一组分和混合石油烃的去除率分别增加了4.19~21.91 %和7.64~23.32%。
[0007] 虽然上述专利文献公开了耐盐并且在电场中活性较高的能够应用于石油污染盐 碱土壤修复工作的石油降解菌，但寻找更加适宜的石油降解菌是解决上述技术难题的主要 途径之一。

【发明内容】

[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供一株在电场中高效降解石油的耐盐蜡状芽孢杆 菌(Bacillus cereus)及其培养方法与应用。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明所述蜡状芽孢杆菌能够直接将石油污染物分解并作为营养物质加以利用， 同时进行生长繁殖，石油降解效果明显;本发明还提供由该菌株作为微生物菌剂添加到土 壤中可与电动力学修复技术协同修复石油污染盐碱土壤的方法，两者结合可明显提高石油 降解效率，缩短石油污染盐碱土壤修复的进程。
[0011]术语解释
[0012] CFU/mL:指的是每毫升样品中含有的微生物群落总数。
[0013] r/min:指的是每分钟离心机的旋转速度。
[0014]发明详述
[0015] 一株錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)SWH6#，已于2015年08月25日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所，保藏编号:CGMCC No. 11273。
[0016] 上述蜡状芽孢杆菌(BaciIlus CereUS)SWH6#分离自电动力学修复后的石油污染 盐碱土壤，菌种保藏号为CGMCC No. 11273,芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，为长杆状，3~5微 米，菌体首末端无显著差异，部分菌体可观察到明显的芽胞结构，无鞭毛和荚膜，过氧化氢 酶反应、VP实验、溶菌酶实验、葡萄糖反应为阳性，毒蛋白结晶实验、硝酸盐、西蒙氏柠檬酸 盐、淀粉酶和甘露醇反应为阴性。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#的16S rDNA测序 结果如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 上述錯状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#的培养方法，步骤如下：
[0018] (1)取蜡状芽孢杆菌(BaciI Ius cereus)SWH6#接种于固体培养基上，经划线培养， 制得单菌落菌体；
[0019] (2)取步骤(1)的单菌落菌体，转接到活化培养基中，经活化培养，制得活化菌体；
[0020] (3)将步骤(2)的活化菌体转接到扩大培养基中，经扩大培养，制得蜡状芽孢杆菌 菌液；
[0021 ]所述扩大培养基组分如下：
[0022] NH4NO3 2.0g/L，KH2P〇4 3.0g/L，K2HP〇4 1.5g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，无水CaCl2 0.01g/L，Na2EDTA · H2O 0.01g/L，原油5g/L。
[0023] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中，划线培养条件为36~38°C恒温培养箱中倒置 培养16~32h;所述固体培养基组分如下：
[0024]牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂18g/L，pH 7.2。
[0025]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，活化培养条件为36~38°C、160~180r/min恒 温摇床上摇瓶活化16~32h;所述活化培养基为液体LB培养基或液体牛肉膏蛋白胨培养基； [0026] 液体LB培养基组分如下：
[0027]蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0;
[0028]液体牛肉膏蛋白胨培养基组分如下：
[0029]牛肉膏38/1，蛋白胨58/1，氯化钠58/1，？!17.4~7.6。
[0030]根据本发明优选的，所述步骤(3)中，扩大培养条件为36~38°C、160~180r/min恒 温摇床上摇瓶扩大培养6~8天。
[0031] 上述蜡状芽孢杆菌(BaciIlus cereuS)SWH6#在修复石油污染的盐碱土壤中的应 用。
[0032] 上述应用，步骤如下：
[0033] (1)取石油污染盐碱土壤，调节土壤含水量至18~22%，并调节土壤中碳、氮、磷的 物质的量之比为（100~120): (5~10): 1，制得待处理土壤；
[0034] (2)向步骤（1)制得的待处理土壤中添加錯状芽孢杆菌(BaciI Ius cereus)SWH6#， 每克待处理土壤中添加1.1~2.0 X IO5CFU的菌体，混合均匀，制得含菌土壤；
[0035] (3)将步骤(2)制得的含菌土壤在电场强度0.5~2V/cm、电极极性30~IOOmin切换 一次的条件下，好氧修复70~90天，修复过程中维持土壤含水量为18~22%。
[0036]根据本发明优选的，所述步骤（1)中的石油污染盐碱土壤的pH值为7.8~9.5的盐 碱土壤，土壤含盐量0.5~1.5wt%。
[0037]根据本发明优选的，所述步骤(1)中的石油污染盐碱土壤粒度为0.025~0.125mm。
[0038]根据本发明优选的，所述步骤(1)中调节土壤中碳、氮、磷采用添加硫酸铵、磷酸二 氢钾进行调节。
[0039]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，每克待处理土壤中添加1.3 X IO5CFU的菌体。
[0040] 根据本发明优选的，所述步骤(3)好氧修复过程中，每隔10天翻土一次。
[0041] 根据本发明优选的，所述步骤(3)好氧修复时间为80天。
[0042] 有益效果
[0043] 1、本发明所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus CereuS)SWH6#，是从电动力学修复后的 石油污染盐碱土壤中筛选得到的高效石油降解菌，具有培养简单、降解石油迅速、耐盐和耐 电的特点，在液体摇瓶中一周的石油降解率可达到10%;
[0044] 2、本发明所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#可应用与电动力学-微生 物联合修复技术，两者结合可获得较高的石油修复效果;该应用方法操作运行简单，成本低 廉，修复周期短，在石油污染盐碱土壤的生物修复领域具有广阔的前景。
【附图说明】
[0045] 图1是实施例4检测土壤中石油降解率的变化曲线；
[0046] 图中：CK、实验组一，BIO、实验组二，EK、实验组三，ΕΚ+ΒΙ0、实验组四。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明所保护范围不仅限 于此。
[0048] 实施例中所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#，已于2015年08月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏号:CGMCC No. 11273。
[0049] 实施例中原油来自胜利油田孤东油区的脱水原油，实施例中所用其他试剂均为市 售普通产品。
[0050] 实施例1
[0051 ]上述蜡状芽孢杆菌(Bacillus CereUS)SWH6#分离自电动力学修复后的石油污染 盐碱土壤。称取Ig电动修复之后的土壤于150mL灭菌的具塞锥形瓶中，加入99mL去离子水和 少量玻璃珠，震荡均匀，放置30°C、160r/min的恒温摇床上活化Ih，梯度稀释菌悬液后，分别 吸取100微升菌液于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，涂布均匀，在30°C恒温培养箱中倒置培养 48h。挑取单菌落，划线培养，而后再重复进行两次划线培养，纯化单菌落，而后进行菌种鉴 定与保存。经鉴定，该菌为芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，为长杆状，3~5微米，菌体首末端无 显著差异，部分菌体可观察到明显的芽胞结构，无鞭毛和荚膜，过氧化氢酶反应、VP实验、溶 菌酶实验、葡萄糖反应为阳性，毒蛋白结晶实验、硝酸盐、西蒙氏柠檬酸盐、淀粉酶和甘露醇 反应为阴性。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#的16S rDNA测序结果如SEQ ID N0.1 所示。
[0052] 上述錯状芽抱杆菌(Bacillus cereus)SWH6#，已于2015年08月25日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所，保藏号:CGMCC No. 11273。
[0053]实施例2:蜡状芽孢杆菌对石油烃的降解
[0054] 实施例1所述錯状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#的培养方法，步骤如下：
[0055] (1)取实施例1所述蜡状芽孢杆菌(BaciI Ius cereus) SWH6#接种于固体培养基上， 38°C恒温培养箱中倒置划线培养16h，制得单菌落菌体；
[0056] 所述固体培养基组分如下：
[0057]牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂18g/L，pH 7.2;
[0058] (2)取步骤（1)的单菌落菌体，转接到活化培养基中，36°C、160r/min恒温摇床上摇 瓶活化32h，制得活化菌体；
[0059]所述活化培养基为液体LB培养基；
[0060] 液体LB培养基组分如下：
[00611蛋白胨l0g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0;
[0062] (3)将步骤(2)的活化菌体转接到扩大培养基中，36°C、160r/min恒温摇床上摇瓶 扩大培养7天，制得蜡状芽孢杆菌菌液；
[0063]所述扩大培养基组分如下：
[0064] NH4NO3 2.0g/L，KH2P〇4 3.0g/L，K2HP〇4 1.5g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，无水CaCl2 0.01g/L，Na2EDTA · H2O 0.01g/L，原油5g/L。
[0065] 检测过程
[0066] 向培养后的扩大培养基中加入二氯甲烷萃取石油，在不高于38°C的条件下将置于 通风橱内将二氯甲烷挥发净，用重量法测定石油含量。
[0067] 采用下面公式计算石油烃的生物降解率(η% ):
[0068] η(%) = (ω〇-ωχ)/ω〇Χ1〇〇
[0069] 式中：ω〇为对照培养基中残油含量；〇^为测试菌培养基中残油含量。
[0070] 在液体摇瓶中蜡状芽孢杆菌对原油具有较高的降解能力，7天的石油降解率为 10.7%〇
[0071 ]实施例3:蜡状芽孢杆菌对石油烃的降解
[0072] 实施例1所述錯状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#的培养方法，步骤如下：
[0073] (I)取实施例1所述蜡状芽孢杆菌(BaciIIus cereus)SWH6#接种于固体培养基上， 36 °C恒温培养箱中倒置划线培养32h，制得单菌落菌体；
[0074] 所述固体培养基组分如下：
[0075]牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂18g/L，pH 7.2;
[0076] (2)取步骤（1)的单菌落菌体，转接到活化培养基中，38°C、180r/min恒温摇床上摇 瓶活化16h，制得活化菌体；
[0077]所述活化培养基为液体牛肉膏蛋白胨培养基；
[0078]液体牛肉膏蛋白胨培养基组分如下：
[0079]牛肉膏38/1，蛋白胨58/1，氯化钠58/1，？!17.4~7.6。
[0080] (3)将步骤(2)的活化菌体转接到扩大培养基中，38°C、180r/min恒温摇床上摇瓶 扩大培养7天，制得蜡状芽孢杆菌菌液；
[0081 ]所述扩大培养基组分如下：
[0082] NH4NO3 2.0g/L，KH2P〇4 3.0g/L，K2HP〇4 1.5g/L，MgS〇4 · 7H20 0.1g/L，无水CaCl2 0.01g/L，Na2EDTA · H2O 0.01g/L，原油5g/L。
[0083] 检测过程
[0084] 向培养后的扩大培养基中加入二氯甲烷萃取石油，在不高于38°C的条件下将置于 通风橱内将二氯甲烷挥发净，用重量法测定石油含量。
[0085] 采用下面公式计算石油烃的生物降解率(η% ):
[0086] η(%) = (ω〇-ωχ)/ω〇Χ1〇〇
[0087] 式中：ω〇为对照培养基中残油含量；ωχ为测试菌培养基中残油含量。
[0088] 在液体摇瓶中蜡状芽孢杆菌对原油具有较高的降解能力，7天的石油降解率为 10.1%〇
[0089]实施例4:蜡状芽孢杆菌与电动力学修复技术联合修复石油污染盐碱土壤的效能 实验
[0090] 将山东东营孤岛黄河三角洲地区未受石油污染的盐碱土壤作为研究对象，经检 测，土壤pH值为8.9，盐含量为0.97wt%，掺加2wt %的原油，土壤粒度为0.1~0.125mm，混合 均匀，模拟石油污染盐碱土壤。
[0091] 实验组一采用如下方法：
[0092] 取上述石油污染盐碱土壤1.0kg，调节土壤含水量至20 %，添加硫酸铵和磷酸二氢 钾调节土壤中碳、氮、磷的物质的量之比为100:10:1，制得待处理土壤；
[0093] 将上述待处理土壤好氧处理80天，每隔10天翻土一次，维持土壤含水量为20 %。 [0094]实验组二采用如实验组一所述的方法，不同之处在于，先向待处理土壤中添加实 施例2制得的蜡状芽孢杆菌菌液，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereuS)SWH6#的添加量为每克 待处理土壤中添加1.3 X IO5CFU的菌体。
[0095] 实验组三采用如实验组一所述的方法，不同之处在于，好氧处理同时外加电场进 行处理，电场强度1￥/〇11，电极极性每6〇1]1；[11切换一次。
[0096]实验组四采用如下方法：
[0097] (1)取上述石油污染盐碱土壤1.0kg，调节土壤含水量至20 %，添加硫酸铵和磷酸 二氢钾调节土壤中碳、氮、磷的物质的量之比为1 〇〇: 1 〇: 1，制得待处理土壤；
[0098] (2)向步骤（1)制得的待处理土壤中添加实施例2制得的蜡状芽孢杆菌菌液，蜡状 芽孢杆菌(1^(3；[1111806代118)3￥!16#的添加量为每克待处理土壤中添加1.3\10 50?1]的菌 体，混合均匀，制得含菌土壤；
[0099] (3)将步骤(2)制得的含菌土壤在电场强度lV/cm、电极极性60min切换一次的条件 下，好氧修复80天，修复过程中维持土壤含水量为20 %。
[0100] 测定上述实验组一至实验组四的石油降解效果，采用常规的重量法测定石油含 量，计算公式为：
[0101] M= (M2-Mi)/M3
[0102] 式中:M-石油含量(g/g) W1+空瓶重(g) ;M2-圆底烧瓶和石油总重(g) ;M3-风干 土重。
[0103] 实验过程中每10天取一次样，测定土壤中石油降解率的变化情况，结果如图1所 示:经过80天的修复，实验组一的石油降解率为5%，实验组二的石油降解率为15%，实验组 三的石油降解率为22 %，实验组四的石油降解率为28 %以上。
[0104] 由上述结果可以看出，电动力学修复技术和本发明所述的蜡状芽孢杆菌可以实现 协同修复，在实验前期，电动力学修复与微生物修复效果相当，两种修复技术间的协同修复 效果并不明显，40天以后微生物学修复技术效果微弱，而电动力学修复技术可继续发挥修 复作用，添加微生物可与电动力学修复技术产生协同作用，提高修复效率。通过上述实验结 果也可以看出，本发明筛选得到的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)可以用于石油污染盐 碱土壤的电动修复过程中，能够在石油污染的盐碱土壤中保持较高活性，具有较高的耐盐、 耐电和石油降解性能，修复效果明显。
【主权项】
3. 如权要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1)中，划线培养条件为36~38°C 恒温培养箱中倒置培养16~32h;所述固体培养基组分如下： 牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，琼脂18g/L，pH 7.2。4. 如权要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2)中，活化培养条件为36~38 °C、160~180r/min恒温摇床上摇瓶活化16~32h;所述活化培养基为液体LB培养基或液体 牛肉膏蛋白胨培养基； 液体LB培养基组分如下： 蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.0; 液体牛肉膏蛋白胨培养基组分如下： 牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，pH 7.4~7.6。5. 如权要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3)中，扩大培养条件为36~38 °C、160~180r/min恒温摇床上摇瓶扩大培养6~8天。6. 权利要求1所述錯状芽孢杆菌(Bacillus cereus)SWH6#在修复石油污染的盐碱土壤 中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤如下： (1) 取石油污染盐碱土壤，调节土壤含水量至18~22%，并调节土壤中碳、氮、磷的物质 的量之比为（100~120): (5~10): 1，制得待处理土壤； (2) 向步骤（1)制得的待处理土壤中添加錯状芽孢杆菌(Baci 1 lus cereus) SWH6#，每克 待处理土壤中添加1.1~2.0X105CFU的菌体，混合均匀，制得含菌土壤； (3) 将步骤(2)制得的含菌土壤在电场强度0.5~2V/cm、电极极性30~lOOrnin切换一次 的条件下，好氧修复70~90天，修复过程中维持土壤含水量为18~22%。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（1)中的石油污染盐碱土壤的pH值 为7.8~9.5的盐碱土壤，土壤含盐量0.5~1.5wt % ; 优选的，所述步骤(1)中的石油污染盐碱土壤粒度为〇.025~0.125mm; 优选的，所述步骤(1)中调节土壤中碳、氮、磷采用添加硫酸铵、磷酸二氢钾进行调节。9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，每克待处理土壤中添加1.3 X105CFU的菌体。10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)好氧修复过程中，每隔10天翻 土一次； 优选的，所述步骤(3)好氧修复时间为80天。
【文档编号】C12R1/085GK105861398SQ201610431090
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】高永超, 郭书海, 张闻, 张强, 陈贯虹, 孔学, 王加宁
【申请人】山东省科学院生态研究所