一种福寿螺卵巢细胞系的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种福寿螺卵巢细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术领域。它的步骤如下：配制细胞培养液；选取体重30?40克的雌福寿螺在无菌水中饲养；对雌福寿螺进行表面消毒；解剖福寿螺取卵巢组织；将卵巢组织用PBS清洗液清洗并剪碎；将处理后的卵巢组织接种于细胞培养瓶中；培养瓶置于5％的CO2培养箱内,28℃恒温培养；过夜后，再加入适量细胞培养液，将组织浸没；每隔5天吸出和换入等量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。本发明能在较短时间内快速、可重复地建立福寿螺卵巢组织细胞系，所需要的细胞培养设备简单，可操作性强。本发明是对水生无脊椎动物细胞培养的重要补充，也为水生无脊椎动物的免疫机制研究提供基础资料。
【专利说明】
一种福寿螺卵巢细胞系的构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于淡水生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种福寿螺卵巢细胞系的构建 方法。
【背景技术】
[0002] 自从上世纪初Harrison和Carrel创立动物组织和细胞的体外培养方法以来，细胞 培养技术得到了长足的发展，在基础理论研究和应用研究中都起到了不可替代的重要作 用。然而，到目前为止，对于细胞培养技术本身的研究主要集中于脊椎动物(特别是哺乳动 物)和昆虫，对于水生无脊椎动物细胞培养的关注却相对较少。在公开刊物发表的有关细胞 培养问题的论文中，绝大多数是脊椎动物和昆虫的.
[0003] 从20世纪60年代开始，研究者开始关注水生无脊椎动物的细胞培养问题，水生无 脊椎动物的多种组织和细胞被尝试进行体外培养，包括上皮细胞，血细胞，消化腺，幼体和 胚胎组织等。在20世纪70年代便建立了水生无脊椎动物双脐螺胚胎（Biomphalaria glabrataembryonie，BGE)细胞系（Hansen, 1976) JGE细胞系是Hansen为了研究血吸虫胞琐 感染细胞机制于1976年从淡水双脐螺胚胎建立的，后由Bayne等完善了冻存方法并提交给 ATCC(CRL-1494)〇
[0004] 尽管在水生无脊椎动物细胞培养的早期便获得如此可喜的成就，但几十年过去后 相对于上个世纪70年代没有大的进展，到目前为止，除了BGE细胞系，还没有成功建系的报 道，大部分细胞培养通常在体外只能存活比较短的时间，虽然有些报道细胞可存活数月但 只能分裂几代便不再分裂，整个培养最后也因微生物污染而告终。
[0005] 福寿螺又名大瓶螺、苹果螺，原产于南美洲亚马逊河流域。1980年前后，因其蛋白 质含量丰富，营养成分高且繁殖能力强，而被作为一种水生经济动物被引入台湾、菲律宾和 日本，并迅速扩散到东亚和东南亚其余国家(Halwart，1994)。后来由于市场化失败，福寿螺 遭弃养并迅速扩散结果暴发成灾，严重危害作物生产(Naylor，1996)。2000年，世界自然保 护耳关盟（World Conservation Union ； International Union for Conservation of Nature and Natural Resources ;IUCN)外来入侵物种专家委员会将福寿螺列为世界100种 恶性外来入侵物种之一(Lowe et al.，2000)，也是其中唯一的一种淡水螺。在我国大陆，福 寿螺于1981年引入到广东养殖，1984年后在广东、广西、福建等地开始广泛养殖，随后推广 到浙江、江西、云南、四川等地，目前已成为长江以南大部分省区的严重农业害虫（俞晓平 等，2001)。2003年，国家环保总局和中国科学院（2003)将福寿螺列入了首批入侵中国的16 种外来物种的"黑名单"
[0006] 在福寿螺的防治过程中，除农业防治和物理防治外，新型生物农药的筛选和鉴定 日益成为研究重点。生物农药的活动生物测定需要大量发育一致的福寿螺，对饲养场地有 严格的要求，工作量大，而若有离体培养的福寿螺细胞，则可以在离体条件下研究生物农药 对二福寿螺的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对福寿螺的作用机制，有助于当前 杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。因此，通过本发明，建立福寿螺细胞系，不仅能增加我国 无脊椎动物细胞系的数量及种类，还能为日后该类生物细胞系的建立提供借鉴经验。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种福寿螺卵巢细胞系的构建方法，为福寿螺生理生化研 究、毒理学研究以及入侵生物学研究等提供技术支持和保障。
[0008] 本发明通过以下技术方案完成：
[0009] -种福寿螺卵巢细胞系的构建方法，依次进行以下步骤：
[0010] (1)配制细胞原代培养液和细胞传代培养液；
[0011] (2)选取体重30-40克福寿螺在无菌水中饲养12小时；
[0012] (3)在无菌条件下，将雌福寿螺浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒ΙΟ- ? 5 分钟；
[0013] (4)用无菌蒸馏水清洗福寿螺3-5次；
[0014] (5)用无菌滤纸吸干福寿螺表面水分；
[0015] (6)将福寿螺置于75%酒精消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺；
[0016] (7)用解剖剪刀剪取福寿螺卵巢组织，放入盛有HBSS清洗液的六孔培养板里面清 洗3-5次，最后一次清洗时，用无菌剪刀将寿螺卵巢组织剪成Imm3的小组织块；
[0017] (8)将经过(7)处理后的组织接种于含有卜1.5mL细胞原代培养液的T-25cm2细胞 培养瓶中；
[0018] (9)将培养瓶置于5%的CO2培养箱内，28°C恒温培养；
[0019] (10)过夜后，再加入2mL-3.OmL细胞传代培养液，使组织浸没在培养液中，每隔5-7 天吸出和换入60-70 %量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；
[0020] (11)将培养瓶中的贴壁细胞轻轻吹打，使细胞悬浮，取2-3mL细胞悬液放入含有1-2ml细胞传代培养液的新培养瓶中，每隔5-7天吸出和换入50%量的细胞培养液，直至扩展 并增殖的细胞充满培养瓶；
[0021 ]保持整个操作过程都在无菌条件下进行。上述方法还可以采用以下优选方式，且 在不冲突的情况下，技术特征均可进行相应组合。
[0022]所述的细胞原代培养液是RPMI1640培养基与青霉素、链霉素、两性霉素 B和动物血 清的及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为7.0-7.4。
[0023]所述的细胞传代培养液是RPMI1640培养基与动物血清的混合物，pH值为7.0-7.4。
[0024]所述的动物血清为胎牛血清。
[0025] 所述的HBSS清洗液为HBSS溶液和青霉素，链霉素以及两性霉素 B的混合液。
[0026]所述的青霉素含量为200U/ml，链霉素含量为0.2μg/ml，两性霉素 B含量为0.5yg/ ml〇
[0027] 所述的细胞原代培养液和细胞传代培养液中，动物血清含量为10-20% (体积比）。
[0028] 所述的饱和苯基硫脲为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的基础培养基 中配制而成。
[0029] 本发明的有益效果是：
[0030] 采用上述方案，对福寿螺卵巢组织细胞进行了原代培养和继代培养，取得了较好 的培养效果。本发明快速、有效、重复性强，是对淡水无脊椎生物细胞培养的重要补充。福寿 螺为重要的外来入侵生物，本发明有助于在离体条件下研究福寿螺，为其防治途径的研究 和新型生物农药的开发提供帮助。
[0031] 本发明中福寿螺卵巢组织细胞系的生物学特征观察和测定
[0032] 1.经实验观察，该细胞系大部分贴壁生长，细胞的形状大部分圆形，少部分多边 形，短梭形细胞(图1，图2)。
[0033] 2.以2xl05细胞/mL的浓度接种到T-25cm2培养瓶中，27°C无光照培养，每天取一瓶 测定细胞浓度，绘制生长曲线（图3)，并按照公式T = tlg2/[lg(N/N0)]计算群体倍增时间， 经过计算第五代的细胞群体倍增时间为74小时。其中
[0034] τ =在对数期平均增长一倍所需的时间
[0035] t =接种到测定细胞数的时间
[0036] No =接种时的细胞数
[0037] N=时刻t所测定的细胞总数
[0038] 3.用醛缩酶引物，利用DAF-PCR的方法鉴定了本发明建立的细胞系的确来源于福 寿螺的卵巢组织，而非其他细胞系的污染（图4)。由细胞系提供的DNA条带与福寿螺卵巢组 织DNA扩增后的带型相同，而与对照细胞系sf9和s2带型明显不同。
【附图说明】
[0039] 图1培养15天后卵巢组织细胞的培养形态；
[0040] 图2培养40天后卵巢组织细胞的培养形态；
[0041] 图3第5代卵巢组织细胞的生长曲线图。
[0042]图4细胞系的DAF-PCR鉴定图谱，其中编号分别代表含义如下：I-DNA Maker; 2-本 发明所建细胞系;3-福寿螺软组织;4-SF9; 5-S2。
【具体实施方式】
[0043] 以下结合实例对本发明作进一步的详细说明：
[0044] 实施例1
[0045]细胞原代培养液的配制(配制500mL): 成分 数量 RPMI1640 培养坫 400mL
[0046] 胎牛血清 50.0mL 苯基硫脲饱和溶液 5CX0mL 青霉素 5 ml 链霉素 50mg
[0047] 两性霉素 B 1.25mg
[0048] 在无菌操作台内，将上述成分混匀，4°C保存备用。
[0049] 细胞传代培养液的配制(配制500mL):
[0050]成分 数量
[0051 ] RPMI1640培养基 450mL
[0052] 胎牛血清 50 .OmL
[0053] 在无菌操作台内，将上述成分混匀，4°C保存备用。
[0054] 实施例2福寿螺卵巢组织细胞的原代培养和传代培养 [0055] 经过下列步骤：
[0056] (1)配制细胞原代培养液；
[0057] (2)选取体重30克雌性福寿螺在无菌水中饲养12小时；
[0058] (3)将雌福寿螺浸没在70%乙醇溶液中，进行表面消毒10分钟；
[0059] (4)用无菌蒸馏水清洗福寿螺3次；
[0060] (5)用无菌滤纸吸干螺表面水分；
[0061 ] (6)将螺置于75%酒精消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺；
[0062] (7)用解剖剪刀剪取卵巢组织，放入盛有HBSS清洗液的六孔培养板里面清洗3次， 最后一次时，用无菌剪刀剪成Imm3的小组织块；
[0063] (8)将(7)处理的后的组织接种于含有ImL细胞培养液的T-25cm2细胞培养瓶中；
[0064] (9)将培养瓶置于5%的CO2培养箱内，28°C恒温培养；
[0065] (10)过夜后，再加入2mL细胞培养液，使组织浸没在培养液中，每隔5天吸出和换入 60 %量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；
[0066] (11)将（10)贴壁细胞轻轻吹打，使细胞悬浮，取2细胞悬液放入含有Iml细胞传代 培养液的新培养瓶中，每隔5天吸出和换入50%量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充 满培养瓶；
[0067] 实施例3福寿螺卵巢组织细胞的原代培养和传代培养 [0068] 经过下列步骤：
[0069] (1)配制细胞原代培养液；
[0070] (2)选取体重40克福寿螺在无菌水中饲养12小时；
[0071] (3)将雌福寿螺浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒15分钟；
[0072] (4)用无菌蒸馏水清洗福寿螺5次；
[0073] (5)用无菌滤纸吸干螺表面水分；
[0074] (6)将螺置于75%酒精消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺；
[0075] (7)用解剖剪刀剪取卵巢组织，放入盛有HBSS清洗液的六孔培养板里面清洗5次， 最后一次时，用无菌剪刀剪成Imm3的小组织块；
[0076] (8)将(7)处理的后的组织接种于含有1.5mL细胞培养液的T-25cm2
[0077] (9)将培养瓶置于5%的CO2培养箱内，28°C恒温培养；
[0078] (10)过夜后，再加入3.OmL细胞培养液，使组织浸没在培养液中，每隔7天吸出和换 入70 %量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；
[0079] (11)将（10)贴壁细胞轻轻吹打，使细胞悬浮，取3mL细胞悬液放入含有2ml细胞传 代培养液的新培养瓶中，每隔7天吸出和换入50%量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞 充满培养瓶；
[0080]实施例4细胞系的生物学特性观察和测定
[00811 (1)形态特征:经显微镜观察，该细胞系贴壁生长，主要有三种细胞形状:大部分圆 形，少部分多边形和短梭形（图I，图2)圆形细胞占82%，平均直径15μπι;多边形细胞长约30μ m，宽平均约18μηι;
[0082] (2)细胞的生长:生长曲线呈典型的"S"，群体倍增时间为74小时（图3)。
[0083] (3) DAF-PCR鉴定：用醛缩酶设计引物，利用DAF-PCR的方法鉴定了本发明建立的细 胞系的确来源于福寿螺卵巢组织细胞，而非其他细胞系的污染（图4)。由细胞系提供的DNA 条带与福寿螺卵巢组织扩增后的带型相同，而与对照细胞系sf9和s2带型明显不同。
【主权项】
1. 一种福寿螺卵巢细胞系的构建方法，其特征在于，该方法依次进行以下步骤： (1) 配制细胞原代培养液和细胞传代培养液； (2) 选取体重30-40克福寿螺在无菌水中饲养12小时； (3) 在无菌条件下，将雌福寿螺浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10-15分 钟； (4) 用无菌蒸馏水清洗福寿螺3-5次； (5) 用无菌滤纸吸干福寿螺表面水分； (6) 将福寿螺置于75%酒精消毒过的解剖盘中，解剖福寿螺； (7) 用解剖剪刀剪取福寿螺卵巢组织，放入盛有HBSS清洗液的六孔培养板里面清洗3-5 次，最后一次清洗时，用无菌剪刀将寿螺卵巢组织剪成1_ 3的小组织块； (8) 将经过(7)处理后的组织接种于含有1 -1.5mL细胞原代培养液的T-25cm2细胞培养瓶 中； (9) 将培养瓶置于5 %的C02培养箱内，28 °C恒温培养； (10) 过夜后，再加入2mL-3. OmL细胞传代培养液，使组织浸没在培养液中，每隔5-7天吸 出和换入60-70 %量的细胞培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶； (11) 将培养瓶中的贴壁细胞轻轻吹打，使细胞悬浮，取2_3mL细胞悬液放入含有l-2ml 细胞传代培养液的新培养瓶中，每隔5-7天吸出和换入50 %量的细胞培养液，直至扩展并增 殖的细胞充满培养瓶； 保持整个操作过程都在无菌条件下进行。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞原代培养液是RPMI1640培养基 与青霉素、链霉素、两性霉素 B和动物血清的及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为7.0-7.4。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞传代培养液是RPMI1640培养基 与动物血清的混合物，pH值为7.0-7.4。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的动物血清为胎牛血清。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HBSS清洗液为HBSS溶液和青霉素， 链霉素以及两性霉素 B的混合液。6. 根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量为200U/ml，链霉素 含量为0.2μg/ml，两性霉素 B含量为0.5μg/ml。7. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的细胞原代培养液和细胞传代培 养液中，动物血清含量为10-20% (体积比）。8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的饱和苯基硫脲为高压灭菌的苯基硫 脲固体过量加入到无菌的基础培养基中配制而成。
【文档编号】C12N5/07GK105861417SQ201610395636
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】刘光富, 张鹏军, 杨倩倩, 许益鹏, 申屠旭萍
【申请人】中国计量大学