细胞组合物和用于治疗急性肺损伤的经血间充质干细胞药物及其用图
【专利摘要】本发明提供了一种细胞组合物，其中，该细胞组合物含有活细胞A和活细胞B，所述活细胞A为经血间充质干细胞，所述活细胞B由经血间充质干细胞经诱导分化得到且具有肺表面活性蛋白的表达。另一方面，本发明还提供了一种用于治疗急性肺损伤的经血间充质干细胞药物，该经血间充质干细胞药物含有如上所述的细胞组合物和药学上可接受的助剂。再一方面，本发明还提供了如上所述的细胞组合物在制备用于治疗急性肺损伤的药物中的用途。通过上述技术方案，本发明有效地提高了急性肺损伤模型小鼠在治疗后的肺部通透性，显著地减轻了炎症；因此显著地提高了治疗急性肺损伤的疗效。
【专利说明】
细胞组合物和用于治疗急性肺损伤的经血间充质干细胞药物 及其用途
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一种细胞组合物、一种用于治疗急性肺损 伤的经血间充质干细胞药物及其用途。
【背景技术】
[0002]急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上 皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸 功能不全。以肺容积减少、肺顺应性降低、通气/血流比例失调为病理生理特征，发展至严重 阶段可称为急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。尽管目 前多种方法被运用于临床，但其死亡率仍居高不下（30%-40%)。目前，临床上对急性肺损 伤的治疗多为支持治疗，如呼吸支持治疗，体液管理等，并无有效的针对性治疗方法。
[0003] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于 发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、 神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，是一种潜在的治疗ALI和ARDS的方法。在已分离培养 的各类间充质干细胞中，胚胎干细胞及骨髓干细胞等由于来源及伦理等问题，极大地限制 了其在临床上的使用。
[0004] 经血来源的间充质干细胞(MenSC)是间充质干细胞中的一员，具有增殖能力强、不 会导致染色体变异等特征。相较于其他干细胞，MenSC具有以下明显的特点：1、经血来源的 干细胞数量多：是骨髓干细胞数量的30倍；2、体外增殖能力强：可增殖390次，传代高达50 次;3、分化潜能性大:能表达Oct-4、SSEA-4等干细胞标志物，与胚胎干细胞和骨髓干细胞相 近;4、免疫原性低:是一类低免疫原性细胞，不须经过严格配对使用，异体移植无免疫排斥 反应或反应较弱；5、采集简单:可直接通过无痛、无创或体外的方式采集，不会对人体造成 伤害。
[0005] 在急性肺损伤中，促炎因子TNF-α，IL-6等表达增强，刺激炎症细胞及内皮细胞表 达30?-1，1^1^^3，11?-1€[等趋化因子。而研究表明经血间充质干细胞表达0)194,0)221， CD184，CD195等受体，表现出较强的趋化性，促使经血间充质干细胞在损伤部位聚集，提高 治疗修复的效果。
[0006] 因此，经血间充质干细胞可能成为治疗ALI的一种潜在的理想方案。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明人在研究中发现，将经血间充质干细胞直接用于治疗急性肺损伤 时，虽然肺部病情有所改善，但肺部通透性仍然较低，炎症仍然较严重；因此存在疗效不高 的缺陷。
[0008] 本发明的目的是提高经血间充质干细胞治疗急性肺损伤的疗效。
[0009] 本发明的发明人出乎意料地发现，将经血间充质干细胞诱导分化后再掺入经血间 充质干细胞，以细胞组合物的形式使用，能够显著地提高疗效，由此得到了本发明。
[0010] -方面，本发明提供了一种细胞组合物，其中，该细胞组合物含有活细胞A和活细 胞B，所述活细胞A为经血间充质干细胞，所述活细胞B由经血间充质干细胞经诱导分化得到 且具有肺表面活性蛋白B、肺表面活性蛋白C和肺表面活性蛋白D的表达。
[0011] 另一方面，本发明还提供了一种用于治疗急性肺损伤的经血间充质干细胞药物， 其中，该经血间充质干细胞药物含有如上所述的细胞组合物和药学上可接受的助剂。
[0012] 再一方面，本发明还提供了如上所述的细胞组合物在制备用于治疗急性肺损伤的 药物中的用途。
[0013] 通过上述技术方案，本发明有效地提高了急性肺损伤模型小鼠在治疗后的肺部通 透性，显著地减轻了炎症;因此显著地提高了治疗急性肺损伤的疗效。
[0014] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0015] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0016] 图1是实施例1中诱导分化的0天、7天和14天取诱导细胞和对照细胞进行多聚甲醛 固定和结晶紫染色后的细胞形态图。
[0017] 图2是实施例1中活细胞B和经血间充质干细胞中肺表面活性蛋白B、肺表面活性蛋 白C和肺表面活性蛋白D的表达的半定量PCR检测结果图，其中，泳道1为经血间充质干细胞， 泳道2为活细胞B。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0019] -方面，本发明提供了一种细胞组合物，其中，该细胞组合物含有活细胞A和活细 胞B，所述活细胞A为经血间充质干细胞，所述活细胞B由经血间充质干细胞经诱导分化得到 且具有肺表面活性蛋白B(SPB)、肺表面活性蛋白C(SPC)和肺表面活性蛋白D(SPD)的表达。
[0020] 其中，肺表面活性蛋白B(SI3B)、肺表面活性蛋白C(SPC)和肺表面活性蛋白D(SPD) 是II型肺泡上皮标志物。
[0021] 其中，本发明的经血间充质干细胞可以具有本领域中常规的定义，其来源可以为 常规的来源，例如可以按照本发明的发明人已公开的文献(CN105176923A)中描述的制备方 法获取经血间充质干细胞。
[0022] 其中，优选地，所述活细胞A与所述活细胞B的数目比为1: (0.1-0.5);更优选为1: (0·2-0·4)〇
[0023] 其中，优选地，所述活细胞B是由包括如下步骤的培养方法得到的：将经血间充质 干细胞接种至诱导分化培养基中培养3-20天，换液周期为48-96小时。
[0024] 其中，所述诱导分化培养基可以含有基础培养基和诱导成分;所述基础培养基可 以包括RPMI 1640培养基和/或M199培养基，优选可以为RPMI1640培养基和M199培养基以1: (0.5-2)的体积比混合得到的产品；所述诱导成分可以包括2-3yg/mL的胰岛素、2-3yg/mL的 转铁蛋白、0.5-2yg/mL的氢化可的松、l-2mM的谷氨酰胺和5-15ng/mL的TGF-m。其中，所述 诱导分化培养基还可以含有抗生素和/或胎牛血清。
[0025] 其中，诱导培养结束后，可以按照常规的细胞收获方法来收集所述活细胞B，例如 可以进行离心和磷酸盐缓冲液洗涤以及再悬浮。
[0026] 其中，所述细胞组合物可以通过将悬浮有所述活细胞A的悬液和悬浮有所述活细 胞B的悬液混合后得到。
[0027] 另一方面，本发明还提供了一种用于治疗急性肺损伤的经血间充质干细胞药物， 其中，该经血间充质干细胞药物含有如上所述的细胞组合物和药学上可接受的助剂。
[0028] 其中，所述药学上可接受的助剂可以为磷酸盐缓冲液。
[0029] 其中，所述经血间充质干细胞药物中的细胞浓度可以为IO5-IO7个/mL。
[0030] 再一方面，本发明还提供了如上所述的细胞组合物在制备用于治疗急性肺损伤的 药物中的用途。
[0031] 其中，非限制性地，本发明还提供了如上所述的细胞组合物在用于治疗急性肺损 伤时，其剂量可以为I X IO4-I X IO6个细胞/kg体重。
[0032] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明。以下实施例中，经血间充质干细胞是按 照CN105176923A中0042-0052段中描述的方法制备得到的。
[0033] 实施例1
[0034]本实施例用于说明活细胞B的获得和表征。
[0035] 诱导分化培养基(PBEC)的配置:将RPMI 1640培养基与M199培养基按体积比1:1混 合，得到基础培养基，然后在基础培养基中添加诱导成分以达到如下终浓度:2.5yg/mL的胰 岛素、2.5yg/mL的转铁蛋白、lyg/mL的氢化可的松、1.5mM的谷氨酰胺和10ng/mL的TGF-βΙ， 得到诱导分化培养基。
[0036]用上述诱导分化培养基将经血间充质干细胞悬浮至3 X IO4个/mL的浓度，在37°C 下培养14天，每72小时换液一次，得到活细胞B。
[0037] 将相同来源的经血间充质干细胞在对照培养基(4mmo 1/L谷氨酰胺、5mg/mL的人血 清替代物(购自武汉维诺赛生物科技有限公司，货号R007)、10ng/mL的EGF、10ng/mL的TOGF-BB、100yg/mL青霉素和100yg/mL链霉素的αΜΕΜ培养基）中悬浮至3\10 4个/11^的浓度，在37 °C下培养14天，每72小时换液一次，作为未诱导分化的对照细胞。
[0038] 在诱导分化的0天、7天和14天取诱导细胞和对照细胞进行多聚甲醛固定和结晶紫 染色，观察细胞形态，结果如图1所示，结果显示，在经过2周的诱导之后，诱导组细胞从梭状 变为扁平的上皮细胞样细胞，说明经血间充质干细胞向上皮细胞发生了转变，而对照组则 仍然维持维持梭状，形态未发生明显改变。
[0039] 取活细胞B和经血间充质干细胞，提取RNA，并使用如表1所示的引物进行半定量 PCR检测肺表面活性蛋白B、肺表面活性蛋白C和肺表面活性蛋白D的表达，结果如图2所示， 结果显示，在经过2周的诱导之后，相对于对照组，活细胞B表达出强的肺上皮细胞标志分子 SPB、SPC和SPD，表明经血间充质干细胞向肺上皮细胞发生了转变分化。
[0040] 表 1
[0042] 实施例2
[0043] 将经血间充质干细胞与实施例1得到的活细胞B用磷酸盐缓冲液分别悬浮为IO6 个/mL的浓度，然后按照1:0.3的体积比混合，得到活细胞A与活细胞B的数目比为1:0.3的细 胞组合物。
[0044] 实施例3
[0045] 将经血间充质干细胞与实施例1得到的活细胞B用磷酸盐缓冲液分别悬浮为IO6 个/mL的浓度，然后按照1:0.2的体积比混合，得到活细胞A与活细胞B的数目比为1:0.2的细 胞组合物。
[0046] 实施例4
[0047] 将经血间充质干细胞与实施例1得到的活细胞B用磷酸盐缓冲液分别悬浮为IO6 个/mL的浓度，然后按照1:0.4的体积比混合，得到活细胞A与活细胞B的数目比为1:0.4的细 胞组合物。
[0048] 对比例1
[0049 ]将经血间充质干细胞用磷酸盐缓冲液悬浮为IO6个/mL的浓度，得到本对比例的细 胞组合物。
[0050] 对比例2
[0051] 将实施例1得到的活细胞B用磷酸盐缓冲液悬浮为IO6个/mL的浓度，得到本对比例 的细胞组合物。
[0052] 测试实施例1
[0053] 小鼠建模：取6-8周雄性C57小鼠，用3 %的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉量为 50mg/kg，。麻醉后，每只雄性C57小鼠气管内滴注LPS IOOyg LPS(溶于50μ1 PBS中）。另取同 样规格雄性C57小鼠作为对照组。
[0054] 4h后，分别取实施例2-4和对比例1-2的细胞组合物，通过尾静脉注射到治疗组小 鼠体内，ImL/只。对照组和模型组小鼠注射等体积PBS。
[0055] 48h后，颈椎脱臼法处死小鼠，按如下方法取所需组织和样本检测。
[0056] 取小鼠右上肺，进行称重，得其湿重，将右上肺置于55 °C中24h烘干后进行称重，得 其干重，计算干/湿比，结果如表3所示。
[0057] 取小鼠左上肺，研磨后提取RNA并进行RT和Q-PCR实验，结果如表3所示。所用引物 如表2所示：
[0058]表2
[0062] 各组另取5只小鼠，从肺部灌入PBS ImL后回抽，再次灌入ImL PBS并回抽，共获得 肺泡灌洗液MLF 2mL。将MLF于4°C 500g离心10min，转移上清至新的EP管中备用，沉淀用 200uL PBS重悬，取IOuL悬液，使用细胞计数仪对BALF中炎性细胞总数进行计数，结果如表4 所示。
[0063] 取转移至新EP管中MLF上清加入到超滤管中，4000g离心30min，获得浓缩液，取 20uL悬液使用BCA蛋白浓度试剂盒测取MLF总蛋白浓度，结果如表4所示。另取浓缩液按照 ELISA试剂盒说明检测IL-10、IL-Ιβ浓度，结果如表4所示。
[0064]表 4
[0066]根据表3和表4的数据可见，实施例1-3的细胞组合物处理后的急性肺损伤模型小 鼠，其各项指标均显著好于未处理的模型组，并且好于对比例1和对比例2的处理的情况，接 近未建模的对照组的正常小鼠。由此可见，本发明有效地提高了急性肺损伤模型小鼠在治 疗后的肺部通透性，显著地减轻了炎症;因此显著地提高了治疗急性肺损伤的疗效。
[0067]以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0068] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0069] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种细胞组合物，其特征在于，该细胞组合物含有活细胞A和活细胞B，所述活细胞A 为经血间充质干细胞，所述活细胞B由经血间充质干细胞经诱导分化得到且具有肺表面活 性蛋白B、肺表面活性蛋白C和肺表面活性蛋白D的表达。2. 根据权利要求1所述的细胞组合物，其中，所述活细胞A与所述活细胞B的数目比为1: (0.1-0.5)。3. 根据权利要求2所述的细胞组合物，其中，所述活细胞A与所述活细胞B的数目比为1: (0·2-0·4)〇4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的细胞组合物，其中，所述活细胞B是由包括如下 步骤的培养方法得到的：将经血间充质干细胞接种至诱导分化培养基中培养3-20天，换液 周期为48-96小时； 所述诱导分化培养基含有基础培养基和诱导成分;所述基础培养基包括RPMI 1640培 养基和/或M199培养基;所述诱导成分包括2-3yg/mL的胰岛素、2-3yg/mL的转铁蛋白、0.5-2 yg/mL的氢化可的松、l-2mM的谷氨酰胺和5-15ng/mL的TGF-βΙ。5. -种用于治疗急性肺损伤的经血间充质干细胞药物，其中，该经血间充质干细胞药 物含有权利要求1-4中任意一项所述的细胞组合物和药学上可接受的助剂。6. 根据权利要求5所述的经血间充质干细胞药物，其中，所述药学上可接受的助剂为磷 酸盐缓冲液。7. 根据权利要求6所述的经血间充质干细胞药物，其中，所述经血间充质干细胞药物中 的细胞浓度为1〇5-1〇 7个/mL。8. 权利要求1-4中任意一项所述的细胞组合物在制备用于治疗急性肺损伤的药物中的 用途。
【文档编号】A61P11/00GK105861439SQ201610254792
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】余艳春, 郑俊, 李程
【申请人】浙江生创精准医疗科技有限公司