高gc含量基因的pcr扩增缓冲液及其扩增方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种高GC含量基因的PCR扩增缓冲液。所述高GC含量基因的PCR扩增缓冲液包括如下组分：Tris?Hcl150mmol/L、(NH4)2SO440mmol/L、一水甜菜碱2.6mol/L、乳化剂Tween 20 0.02％、PCR反应增强剂20％，配置后，过滤去菌，?20℃保存。本发明还公开一种基于高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的扩增方法及应用。本发明使用了(NH4)2SO4替代了KCL，以增加引物与模板结合的特异性，并能兼容更广谱的Mg2+范围。
【专利说明】
高GC含量基因的PCR扩増缓冲液及其扩増方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体的，涉及一种高GC含量基因的PCR扩增缓冲液 及其扩增方法和应用。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外 核酸扩增技术。PCR过程一般分为变性、退火、延伸3个阶段，首先DNA在高温条件下发生变性 解链，在温度降至55 °C左右时引物与模板DNA单链结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行DNA 合成。与之前常用的细菌扩增靶基因相比，它具有特异性强、灵敏度高、简便、重复性好、易 于自动化等优点。PCR技术发展到今天已经有近30年的时间，随着技术的不断进步，使它更 适合实际应用，但其在扩增高GC含量序列方面仍有不足之处。碱基A、T之间形成2对氢键，G、 C之间形成3对氢键，因此高G、C含量基因解链所需能量高，变性困难，并且模板中容易形成 稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上进行DNA合成而导致扩增失败。
[0003] 从PCR技术发明以来，人们就开始了对PCR反应添加其它化学物质以提高靶基因产 率的研究。到目前为止，已经报道了许多添加剂以其各自的特点在不同方面对PCR反应起着 促进作用，例如DMSO JMSO作为一种PCR增强剂，它的作用原理是通过破坏了模板DNA大沟与 小沟里带有供体和受体的互补氢键，降低DNA二级结构的形成，增加引物与模板的特异性结 合，降低非特异性扩增。但有报道称当DMSO浓度过高时会影响DNA聚合酶活性，因此在使用 时，要平衡模板、引物、酶的用量。
[0004] 现有技术中，PCR扩增缓冲液对引物与模板的特异性结合作用小，扩增出目的条带 的机会小，只能采用有机溶剂如乙二醇、乙酸乙酯、正戊烷等增高GC含量DNA片段扩增效率 的方法，但是由于采用了有机溶剂，对人体有害，使用不便。因此，有必要提供一种新的高GC 含量基因的PCR扩增缓冲液解决上述技术问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述现有PCR扩增缓冲液对引物与模板结合的特异性作用小，扩增出目 的条带的机会小的技术问题，本发明提供一种对引物与模板结合的特异性作用明显，扩增 出目的条带的机会大的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液及其扩增方法。
[0006] 本发明提供一种高GC含量基因的PCR扩增缓冲液，所述缓冲液包括如下组分： Tris-Hcl 150 mmol/L (NH4)2SO4 40 mmol/L
[0007] 一 水甜菜減 2.6mol/L 乳化剂 Tween 20 0.02% PCR反应增强剂 20%。
[0008] 在本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的一种较佳实施例中，所述TriS- He 1的PH值为8.8。
[0009] 在本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的一种较佳实施例中，所述PCR反 应增强剂为DMS0、甘油、甲酰胺及硫酸铵中的任意一种。
[0010] 在本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的一种较佳实施例中，所述高GC 含量基因中GC含量高达80%，所述PCR扩增缓冲液适用于人类和动物的基因扩增。
[0011] 本发明提供一种高GC含量基因的PCR扩增方法，包括以下步骤：
[0012] 步骤一、准备PCR反应体系：包括DNA聚合酶、高GC含量基因的PCR扩增缓冲液、 dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板和双蒸水；
[0013] 步骤二、进行PCR扩增程序：
[0014] 预处理:95°C 变性 5min;
[0015] PCR 反应：95°C 变性40-60s，50-65°C 退火40-60s，72°C 延伸 50-120s，共 25-35 个循 环；
[0016] 延伸:72°C 延伸 IOmin;
[0017]扩增结束后温度降至4°C保存。
[0018]本发明还提供一种高GC含量基因的PCR扩增缓冲液在高GC含量基因 PCR扩增实验 中的应用。
[0019]相较于现有技术，本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液及其扩增方法具 有以下有益效果：
[0020] -、本发明用(NH4)2S〇4替代现有PCR扩增缓冲液普遍使用的KCL，可以增加引物与 模板的特异性结合，并能兼容更广谱的Mg2+范围。
[0021] 二、本发明加入了适量的DMSO等协效制剂，用以对复杂的如"GC-rich"的模板的扩 增，降低DNA二级结构的形成，增加引物与模板的特异性结合，降低因引物设计不够理想而 无法扩增出目的条带的机会。
[0022]三、本发明使用Tween-20作为乳化剂，其具有复性抗原的作用，可提高特异性的识 别能力，可以封闭膜上的未结合位点降低抗体的非特异性结合，而不替换膜上的靶蛋白、不 结合靶蛋白的标位、也不与抗体或检测试剂发生交叉反应。
[0023]四、本发明加入了Tris-Hcl，用以在PCR扩增缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳 定扩增过程中的PH值。
[0024]五、本发明使用了一水甜菜碱来避免高浓度盐对DNA聚合酶活性的毒害。
[0025] 六、本发明初步的实验表明该缓冲液对一些困难的PCR扩增有很好的增强作用，比 甲酰胺等经典的PCR扩增添加试剂具有更多的优势，扩增出的条带更亮。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它 的附图，其中：
[0027] 图1是本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的一较佳实施例的电泳图。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029] 实施例1
[0030] NKX3 · 1 基因 ORF 的 PCR 扩增
[0031] NKX3.1基因 ORF全长为705bp，在其前200多个碱基，GC含量高达80%，是一种典型 的局部高GC含量基因。
[0032] 1、模板制备
[0033] 应用市售基因组DNA提取试剂盒，提取DNA的浓度为lOOng/μΙ，260/230值大于2.0， 260/280值大于1.8。
[0034] 2、引物设计
[0035] 根据NKX3.1基因序列，采用01ig〇6.0软件设计引物如下：
[0036] 上游引物：5 ' -CGACCTGTCACCGCCCTTCAG-3 '
[0037] 下游引物：5 ' -AGCCCCGCACTTCCACCACC-3 '
[0038] 3、PCR 反应
[0039] PCR扩增体系1:
[0040] 10\811打6『，541;(1町？8(2.5111111〇1/1)441;上游引物（1(^111〇1/1)叫1 ;下游引物（1(^ mol/L) ΙμL; DNA300ng; DNA聚合酶（2 · 5UAU) 2μ1; CldH2O补足至50μ1。
[0041 ] PCR扩增体系2:
[0042] 10\811打6『，541;(1町？8(2.5111111〇1/1)441;上游引物（1(^111〇1/1)叫1 ;下游引物（1(^ mol/υ?μL; 10%DMS01yl ;DNA300ng;DNA聚合酶（2· 5υ/μ1)2μ1 ;ddH20补足至50μ1。
[0043] PCR扩增体系3:
[0044] 10\811打6『，541;(1町？8(2.5111111〇1/1)441;上游引物（1(^111〇1/1)叫1 ;下游引物（1(^ mol/L) ΙμL; 10% 甲酰胺ΙμL;DNA300ng;DNA聚合酶（2 · 5UAU)2μ1; CldH2O补足至50μ1。
[0045] PCR扩增体系4:
[0046] 2 X Buffer，5μ1; dNTPs (2 · 5mmoI/L)4μ1;上游引物（1 ΟμπιοI/L) ΙμL;下游引物（10μ mol/L) ΙμL; DNA300ng; DNA聚合酶（2 · 5υ/μ1) 2μ1; CldH2O补足至50μ1。
[0047] 其中，卩〇財广增体系1-3中，811打61包括：30〇11111^8-!1(：1(口!18.8)，2〇11111((：1 ;
[0048] PCR扩增体系4中的2 XBuff er缓冲液包括如下组分： Tris-Hd 150 inmol/L (NH4)2SO4 40 mmol/L
[0049] 一水甜菜碱 2.6mol/L 乳化剂 Tween 20 0.02% PCR反应增强剂 20%
[0050] 配置后，过滤去菌，-20°c保存。
[0051] 具体地，所述PCR反应增强剂为DMS0、甘油、甲酰胺及硫酸铵中的任意一种，本实施 例中优选DMSO。
[0052] PCR扩增程序：
[0053] ①预处理：95Γ变性5min。
[0054] ②PCR反应:95 °C变性50s，62 °C退火40s，72 °C延伸Imin，共30个循环。
[0055] ③延伸：72°C10min。
[0056] ④扩增结束后温度降至4°C保存。
[0057] 4、核酸电泳检测PCR扩增产物
[0058] 1.5 %琼脂糖电泳，加入EB，紫外检测PCR产物约为705bp ICR扩增产物的电泳图结 果见图1。从图1中可以看出，本实施例的扩增体系4能够扩增GC含量80%的目的基因，且PCR 扩增产物特异性高，条带单一。
[0059] 请参阅图1，是本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的一较佳实施例的电 泳图。第一道为常规扩增，使用promega的扩增试剂，扩增用buffer为promega的PCR 10 X buffer。第二道为在常规扩增试剂基础上加入10%DMS0(sigma)，扩出非常淡的条带。第三 道为在常规扩增基础上加入10%甲酰胺（sigma)，未扩增出明显条带。DMSO与甲酰胺均是常 用的协效制剂，但在扩增一些相当高GC含量基因时仍存在一定问题。第四道使用了所述高 GC含量基因的PCR扩增缓冲液，用该buffer替代promega的10 X buffer，余试剂及扩增程序 不变，扩增出目的条带。
[0060] 由上述实验结果可知，高GC含量基因的PCR扩增缓冲液可应用于高GC含量基因扩 增等困难PCR扩增中，扩增出的条带更亮。
[0061] 本发明提供的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液及其扩增方法和应用具有以下有益 效果：
[0062] -、本发明用(NH4)2S〇4替代现有PCR扩增缓冲液普遍使用的KCL，可以增加引物与 模板的特异性结合，并能兼容更广谱的Mg 2+范围。
[0063]二、本发明加入了适量的DMSO等协效制剂，用以对复杂的如"GC-rich"的模板的扩 增，降低DNA二级结构的形成，增加引物与模板的特异性结合，降低因引物设计不够理想而 无法扩增出目的条带的机会。
[0064]三、本发明使用Tween-20作为乳化剂，其具有复性抗原的作用，可提高特异性的识 别能力，可以封闭膜上的未结合位点降低抗体的非特异性结合，而不替换膜上的靶蛋白、不 结合靶蛋白的标位、也不与抗体或检测试剂发生交叉反应。
[0065]四、本发明加入了Tris-Hcl，用以在PCR扩增缓冲液中与甘氨酸构成缓冲体系，稳 定扩增过程中的PH值。
[0066] 五、本发明使用了一水甜菜碱来避免高浓度盐对DNA聚合酶活性的毒害。
[0067] 六、本发明初步的实验表明该缓冲液对一些困难的PCR扩增有很好的增强作用，比 甲酰胺等经典的PCR扩增添加试剂具有更多的优势，扩增出的条带更亮。
[0068] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技 术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种高GC含量基因的PCR扩增缓冲液，其特征在于，所述缓冲液包括如下组分： Tris-Hcl 150 mmol/L (NH4)2S04 40 mmol/L 一水甜菜碱 2.6mol/L 乳化剂 Tween 20 0.02% PCR反应增强剂 20%。2. 根据权利要求1所述的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液，其特征在于，所述Tris-Hcl 的PH值为8.8。3. 根据权利要求1所述的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液，其特征在于，所述PCR反应增 强剂为DMS0、甘油、甲酰胺及硫酸铵中的任意一种。4. 根据权利要求1所述的高GC含量基因的PCR扩增缓冲液，其特征在于，所述高GC含量 基因中GC含量高达80%，所述PCR扩增缓冲液适用于人类和动物的基因扩增。5. -种基于权利要求1-4中任一项所述高GC含量基因的PCR扩增缓冲液的PCR扩增方 法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、准备PCR反应体系：包括DNA聚合酶、所述高GC含量基因的PCR扩增缓冲液、 dNTP、上游引物、下游引物、DNA模板和双蒸水； 步骤二、进行PCR扩增程序： 预处理:95°C变性5min; PCR 反应:95 °C 变性40-60s，50-65 °C 退火40-60s，72 °C 延伸 50-120s，共 25-35个循环； 延伸:72°C延伸lOmin; 扩增结束后温度降至4°C保存。6. 如权利要求1-4中任一项所述高GC含量基因的PCR扩增缓冲液在高GC含量基因 PCR扩 增实验中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK105861491SQ201610250347
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】马琪, 程跃, 俞鑫, 王平, 郁芮, 虞碧霞
【申请人】马琪