基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法，本发明先通过第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度和纯度；然后在一种纳米元件上同时修饰第二生物识别元件以及预定酶，通过三明治夹心方式在检测体系中引入催化生物反应的酶，利用预定酶催化生物反应改变待催化溶液的pH值；最后加入酸碱指示剂，并利用酸碱指示剂的颜色变化测定待测样本中目标微生物含量。该方法兼有免疫磁分离的纯化富集特点、生物催化的催化放大特点和酸碱指示剂的简单测定特点，可有效提高检测灵敏度，减少检测时间，简化检测过程，降低检测成本。
【专利说明】
基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物检测领域，更具体涉及一种基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法。
【背景技术】
[0002]当前我国面临着严峻的食品安全形势，食品安全事件频发。据国家疾病预防控制中心统计，2005-2014年我国食物中毒事件中超过50 %是由微生物引起的。食品安全预防与控制的关键在于致病微生物的早发现、早预警和早处理，建立灵敏、快速的致病微生物检测方法具有重要的意义。虽然国内外科研人员在提高微生物检测灵敏度和减少检测时间方面开展了大量的研究，但是实现食品中致病微生物的快速检测依然是一个巨大的挑战，主要是因为被污染的食品中致病微生物数量通常较少，加上食品基质复杂，常规分析方法很难对致病微生物进行高灵敏、高特异的检测。
【发明内容】
[0003](一)要解决的技术问题
[0004]本发明要解决的技术问题是如何提高检测微生物的灵敏度、降低检测成本、缩短检测时间。
[0005](二)技术方案
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]S1、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，形成磁性元件-目标微生物复合物，并通过磁场对所述磁性元件-目标微生物复合物进行分离，实现样品中少量目标微生物的特异性分离富集；
[0008]S2、利用预定酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米元件与所述磁性元件-目标微生物复合物进行结合，形成磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物；
[0009]S3、利用所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中的所述预定酶催化与所述预定酶对应的待催化溶液，改变所述待催化溶液的PH值；
[0010]S4、检测催化反应后所述待催化溶液的pH值，根据所述pH值得到所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中所述预定酶的浓度，根据所述预定酶的浓度确定所述目标微生物的浓度。
[0011 ]优选地，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与所述目标微生物的结合位点不同。
[0012]优选地，所述步骤SI具体包括以下步骤:
[0013]S11、利用生物素、链霉亲和素、磁性材料以及所述第一生物识别元件制备所述免疫磁性元件，将所述免疫磁性元件溶解于磷酸盐缓冲液；
[0014]S12、将所述免疫磁性元件与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁性元件捕获所述目标微生物，形成所述磁性元件-目标微生物复合物；
[0015]S13、利用磁场从所述免疫磁性元件与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁性元件-目标微生物复合物。
[0016]优选地，所述步骤SI I中制备所述免疫磁性元件具体包括以下步骤:
[0017]SI 11、将所述链霉亲和素与磁性元件偶联；
[0018]S112、将所述生物素与所述第一生物识别元件偶联；
[0019]S113、将所述链霉亲和素修饰的磁性元件与所述生物素修饰的第一生物识别元件进行孵育通过生物素-链霉亲和素的结合形成所述免疫磁性元件。
[0020]优选地，所述纳米元件为胶体金花，所述预定酶为脲酶；
[0021]所述步骤S2具体包括以下步骤:
[0022]S21、利用采用种子生长法制备胶体金花；
[0023]S22、对所述胶体金花进行所述脲酶和所述第二生物识别元件的修饰，形成免疫胶体金花，将所述免疫胶体金花溶解于超纯水；
[0024]S23、将所述免疫胶体金花与所述磁性元件-目标微生物复合物的溶液进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物；
[0025]S24、利用磁场从所述免疫胶体金花与所述磁性元件-目标微生物复合物的溶液形成的混合溶液中分离出所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物。
[0026]优选地，所述步骤S4具体包括以下步骤:
[0027]S41、利用磁场捕获所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物并分离得到上清液。
[0028]S42、将所述上清液与酸碱指示剂混合，所述酸碱指示剂的颜色发生变化，利用光谱仪检测溶液的颜色变化程度，得到所述磁性材料-目标物-胶体金花-脲酶复合体中的脲酶的浓度，从而得到所述纳米元件的浓度，根据所述纳米元件的浓度得到目标微生物的浓度。
[0029 ]优选地，所述待催化溶液为尿素溶液;所述酸碱指示剂为溴甲酚紫。
[0030]所述步骤S24之后还包括以下步骤:
[0031]S25、依次使用含有吐温的氯化钠溶液(pH值与溴甲酚紫相同)和纯的氯化钠溶液洗涤以除去所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物的溶液中未与所述目标微生物结合的所述纳米元件，其中所述含有吐温的氯化钠溶液的P H值与所述溴甲酸紫的P H值相同，以保证pH值不受洗涤液影响。
[0032]优选地，所述步骤S23中，首先利用磁场捕获所述磁性元件-目标微生物复合物并除去上清液，再利用所述免疫胶体金花溶解所述磁性元件-目标微生物复合物，之后进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物。
[0033]优选地，所述步骤S3具体包括以下步骤:
[0034]S31、利用所述尿素溶液溶解所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物；
[0035]S32、利用所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中的预定酶催化尿素水解反应。
[0036]优选地，所述步骤S31中，利用超纯水溶解尿素形成所述尿素溶液。
[0037](三)有益效果
[0038]本发明提供了一种基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法，本发明首先通过生物识别元件修饰的免疫磁性元件分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度，之后利用预定酶催化反应改变待催化溶液的PH值，有效地放大了检测信号，可以大幅度提高检测灵敏度，且该酶催化反应属于液-液相反应，反应效率高于传统的固-液相反应，可以大幅度提高检测速度，在2小时内可得到极少量微生物的定量检测结果。同时，本发明通过酶催化待催化溶液改变待催化溶液的PH值，pH值得变化可以通过酸碱指示剂颜色的变化进行直观的观察或者用光谱仪进行定量观察，无需复杂的设备，因此利用本发明的方法可以大幅度降低检测成本。
【附图说明】
[0039]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0040]图1为本发明的基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法的流程图；
[0041]图2为本发明的基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法的工作原理示意图；
[0042]图3为本发明中不同浓度碳酸铵溶液与溴甲酚紫孵育后的溶液的全光谱图；
[0043]图4为本发明中不同浓度碳酸铵溶液与溴甲酚紫孵育后的溶液在特征波长下的光强值。
【具体实施方式】
[0044]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
[0045]—种基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤:
[0046]S1、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，形成磁性元件-目标微生物复合物，并通过磁场对所述磁性元件-目标微生物复合物进行快速分离，从而实现样品中少量致病菌的特异性分离富集；
[0047]S2、利用预定酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米元件与所述磁性元件-目标微生物复合物进行结合，形成磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物；
[0048]S3、利用所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中的所述预定酶催化与所述预定酶对应的待催化溶液，改变所述待催化溶液的PH值；
[0049]S4、检测催化反应后所述待催化溶液的pH值，根据所述pH值得到所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中所述预定酶的浓度，根据所述预定酶的浓度确定所述目标微生物的浓度。
[0050]上述方法中，免疫磁分离技术具有操作简单、分离效率高等优点，其主要原理是利用修饰有生物识别元件(抗体等)的磁性材料，特异性地识别食品基质中的目标致病菌，并通过磁场对磁性材料进行快速分离，从而实现食品样品中少量致病菌的特异性分离富集。同时，上述方法兼有免疫磁分离的纯化富集特点、生物催化的催化放大特点和酸碱指示剂的简单测定特点，可有效提高检测灵敏度，减少检测时间，简化检测过程，降低检测成本。
[0051]进一步地，所述步骤SI具体包括以下步骤:
[0052]Sll、利用生物素、链霉亲和素、磁性材料以及所述第一生物识别元件制备所述免疫磁性元件，将所述免疫磁性元件溶解于磷酸盐缓冲液；
[0053]S12、将所述免疫磁性元件与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁性元件捕获所述目标微生物，形成所述磁性元件-目标微生物复合物；
[0054]S13、利用磁场从所述免疫磁性元件与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁性元件-目标微生物复合物。
[0055]所述步骤SI I中制备所述免疫磁性元件具体包括以下步骤:
[0056]SI 11、将所述链霉亲和素与磁性元件偶联；
[0057]S112、将所述生物素与所述第一生物识别元件偶联；
[0058]SI 13、将所述链霉亲和素修饰的磁性元件与所述生物素修饰的第一生物识别元件进行孵育通过生物素-链霉亲和素的结合形成所述免疫磁性元件。
[0059]进一步地，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与所述目标微生物的结合位点不同，以保证第一生物识别元件和第二生物识别元件能够通过不同的结合位点同时与目标微生物结合，互不影响对方的结合率。
[0060]优选地，所述第一生物识别元件为单克隆抗体，所述磁性元件为磁珠，所述免疫磁性元件为免疫磁珠，应当明确的是本发明并不限定第一生物识别元件为单克隆抗体，也可以根据实际情况选用其他的生物识别材料，同样地本发明并不限定磁性元件为磁珠，也可以根据实际情况选用其他的磁性材料。
[0061]所述纳米元件是但不限于是胶体金花，所述预定酶是但不限于是脲酶，所述待催化溶液是但不限于是尿素溶液;所述酸碱指示剂是但不限于是溴甲酚紫，可以根据实际情况具体选取。
[0062]采用抗体等生物识别元件特异性分离目标物，具有较好的检测特异性，可以减少样本背景中其它分子的干扰影响;采用专一性较好的脲酶催化尿素产生铵根离子和碳酸根离子，可以降低其它分子的干扰影响。
[0063 ] 进一步地，所述步骤S2具体包括以下步骤:
[0064]S21、利用采用种子生长法制备胶体金花；
[0065]S22、对所述胶体金花进行所述脲酶和所述第二生物识别元件的修饰，形成所述免疫胶体金花，将所述免疫胶体金花溶解于超纯水；
[0066]S23、将所述免疫胶体金花与所述磁性元件-目标微生物复合物的溶液进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物；
[0067]S24、利用磁场从所述免疫胶体金花与所述磁性元件-目标微生物复合物的溶液形成的混合溶液中分离出所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物。
[0068]S25、依次使用含有吐温的氯化钠溶液(pH值与溴甲酚紫相同)和纯的氯化钠溶液洗涤以除去所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物的溶液中未与所述目标微生物结合的所述纳米元件，其中所述含有吐温的氯化钠溶液的P H值与所述溴甲酸紫的P H值相同，以保证pH值不受洗涤液影响。
[0069]优选地，所述步骤S23中，首先利用磁场捕获所述磁性元件-目标微生物复合物并除去上清液，再利用所述免疫胶体金花溶解所述磁性元件-目标微生物复合物，之后进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物。利用磁场富集磁性元件-目标微生物复合物进一步地提高了检测的精确度。
[0070]步骤S2中，通过磁分离及不同溶液洗涤除去未结合的胶体金花和不改变复合物的PH，降低了背景噪声，提高了系统信噪比，提高了检测精度。
[0071]进一步地，所述步骤S3具体包括以下步骤:
[0072]S31、利用所述尿素溶液溶解所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物；
[0073]S32、利用所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中的预定酶催化尿素水解反应。
[0074]其中，步骤S31中利用超纯水溶解尿素形成所述尿素溶液。
[0075]进一步地，所述步骤S4具体包括以下步骤:
[0076]S41、利用磁场捕获所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物并分离得到上清液。
[0077]S42、将所述上清液与酸碱指示剂混合，所述酸碱指示剂的颜色发生变化，利用光谱仪检测溶液的颜色变化程度，得到所述磁性材料-目标物-胶体金花-脲酶复合体中的脲酶的浓度，从而得到所述纳米元件的浓度，根据所述纳米元件的浓度得到目标微生物的浓度。应当说明的是，步骤S42中，也可以直接通过脲酶的浓度确定目标微生物的浓度。
[0078]由于酶催化具有放大信号，从而能够提高检测灵敏度的作用，被广泛应用检测领域，本发明利用脲酶催化尿素产生碳酸根及铵根离子，导致尿素溶液PH值升高而改变酸碱指示剂-溴甲酚紫的颜色的原理，实现对微生物的检测。图3为本发明中不同浓度碳酸铵溶液与溴甲酚紫孵育后的溶液的全光谱图，图4为本发明中不同浓度碳酸铵溶液与溴甲酚紫孵育后的溶液在特征波长下的光强值，拟合曲线为:y = 4384.41n(x)+123.6，其中:x为碳酸铵浓度，y为光强度，R2为0.98。根据图3和图4，利用溴甲酚紫的颜色变化得到碳酸铵的浓度，从而确定脲酶的浓度，根据脲酶的浓度即可确定目标微生物的浓度。
[0079]图2为本发明的基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法的工作原理示意图，如图2所示，本发明先通过单克隆抗体或其它生物识别材料修饰的免疫磁珠捕获目标微生物，形成磁性元件-目标微生物复合物，例如单增李斯特菌，之后利用磁场分离并富集目标微生物，提高了目标微生物的浓度和纯度;然后，在胶体金花或其它纳米材料上同时修饰多克隆抗体或另一种生物识别材料以及脲酶或其它相似功能的酶，与磁性元件-目标微生物复合物结合，通过双抗夹心方式在检测体系中引入脲酶，利用脲酶催化尿素水解反应改变尿素溶液的PH值;最后，加入溴甲酚紫或其它酸碱指示剂，并利用酸碱指示剂的颜色变化测定待测样本中目标微生物含量。该方法兼有免疫磁分离的纯化富集特点、脲酶的催化放大特点和酸碱指示剂的简单测定特点，可有效提高检测灵敏度，减少检测时间，简化检测过程，降低检测成本。
[0080]以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种基于免疫磁分离以及生物催化的微生物浓度检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 51、利用目标微生物的第一生物识别元件修饰的免疫磁性元件对所述目标微生物进行捕获，形成磁性元件-目标微生物复合物，并通过磁场对所述磁性元件-目标微生物复合物进行分离，实现样品中少量目标微生物的特异性分离富集； 52、利用预定酶和所述目标微生物的第二生物识别元件共同修饰的纳米元件与所述磁性元件-目标微生物复合物进行结合，形成磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物； 53、利用所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中的所述预定酶催化与所述预定酶对应的待催化溶液，改变所述待催化溶液的PH值； 54、检测催化反应后所述待催化溶液的pH值，根据所述pH值得到所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中所述预定酶的浓度，根据所述预定酶的浓度确定所述目标微生物的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一生物识别元件和第二生物识别元件与所述目标微生物的结合位点不同。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤SI具体包括以下步骤: 511、利用生物素、链霉亲和素、磁性材料以及所述第一生物识别元件制备所述免疫磁性元件，将所述免疫磁性元件溶解于磷酸盐缓冲液； 512、将所述免疫磁性元件与含有所述目标微生物的样本溶液进行混合孵育，所述免疫磁性元件捕获所述目标微生物，形成所述磁性元件-目标微生物复合物； 513、利用磁场从所述免疫磁性元件与所述样本溶液形成的混合溶液中分离并富集所述磁性元件-目标微生物复合物。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤Sll中制备所述免疫磁性元件具体包括以下步骤: SI 11、将所述链霉亲和素与磁性元件偶联； 5112、将所述生物素与所述第一生物识别元件偶联； 5113、将所述链霉亲和素修饰的磁性元件与所述生物素修饰的第一生物识别元件进行孵育通过生物素-链霉亲和素的结合形成所述免疫磁性元件。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述纳米元件为胶体金花，所述预定酶为脲酶； 所述步骤S2具体包括以下步骤: 521、利用采用种子生长法制备胶体金花； 522、对所述胶体金花进行所述脲酶和所述第二生物识别元件的修饰，形成免疫胶体金花，将所述免疫胶体金花溶解于超纯水； 523、将所述免疫胶体金花与所述磁性元件-目标微生物复合物的溶液进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物； 524、利用磁场从所述免疫胶体金花与所述磁性元件-目标微生物复合物的溶液形成的混合溶液中分离出所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括以下步骤: S41、利用磁场捕获所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物并分离得到上清液； S42、将所述上清液与酸碱指示剂混合，所述酸碱指示剂的颜色发生变化，利用光谱仪检测溶液的颜色变化程度，得到所述磁性材料-目标物-胶体金花-脲酶复合体中的脲酶的浓度，从而得到所述纳米元件的浓度，根据所述纳米元件的浓度得到目标微生物的浓度。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待催化溶液为尿素溶液;所述酸碱指示剂为溴甲酚紫； 所述步骤S24之后还包括以下步骤: S25、依次使用含有吐温的氯化钠溶液(pH值与溴甲酚紫相同)和纯的氯化钠溶液洗涤以除去所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物的溶液中未与所述目标微生物结合的所述纳米元件，其中所述含有吐温的氯化钠溶液的PH值与所述溴甲酚紫的pH值相同，以保证PH值不受洗涤液影响。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S23中，首先利用磁场捕获所述磁性元件-目标微生物复合物并除去上清液，再利用所述免疫胶体金花溶解所述磁性元件-目标微生物复合物，之后进行混合孵育，形成所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以下步骤: 531、利用所述尿素溶液溶解所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物； 532、利用所述磁性元件-目标微生物-纳米元件-酶复合物中的预定酶催化尿素水解反应。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤S31中，利用超纯水溶解尿素形成所述尿素溶液。
【文档编号】C12Q1/06GK105861629SQ201610183221
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】林建涵, 甘承奇, 白珊珊, 陈奇, 蔡杲哲, 王丹
【申请人】中国农业大学