一种快速鉴定食用向日葵杂交种sh361真实性和纯度的方法

一种快速鉴定食用向日葵杂交种sh361真实性和纯度的方法
【专利摘要】本发明公布了一种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，通过在大量的SSR引物中筛选出SR-57、SR-123、SR-830、SR-1040和SR-1164，并在上述引物下获得了适于以食用向日葵杂交种SH361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的基因组DNA为模板的PCR扩增反应的最优组合，对比通过凝胶电泳处理获得的食用向日葵杂交种SH361及其标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，判定所述食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的鉴定，该方法方便、快捷，操作步骤简单，能够在短时间内对大量的待测食用向日葵杂交种SH361进行快速鉴定，测定结果准确。
【专利说明】
-种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方 法
技术领域
[0001] 本发明属于农业分子生物学领域，具体设及一种快速鉴定食用向日葵杂交种 SH361真实性和纯度的方法。
【背景技术】
[0002] 向日葵化elianthus annuus L.)为菊科（Composicae)向日葵属的双子叶植物。 向日葵原产于北美洲西南部，是唯一一种起源和驯化于北美洲并在全球范围内大面积栽培 的作物。向日葵分为油用型向日葵和食用型向日葵，染色体基数均为17,有二倍、四倍、六倍 不同倍数水平，其中栽培种为二倍体，属虫媒异花授粉作物。向日葵属喜光性短日植物，全 生育期有效积溫> 1800~2600°C ;耐旱耐盐碱，耐瘡薄，对±壤有极广的适应性，最适宜的 ±壤为壤±和沙壤±。因此，在我国北方干旱、降雨少、±壤盐碱化严重的地区，向日葵成为 当地农民脱贫致富、增产增收的经济作物。随着向日葵育种技术的不断发展和杂交品种的 广泛推广，向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定已越来越成为新品种保护W及保护种植 户利益的必要手段。
[0003] 向日葵杂交种的真实性和纯度是衡量种子质量的重要指标，直接影响农作物的产 量、品质和农民的利益。快速、准确、简便、经济地鉴定杂交向日葵种子真实性对育种和农业 生产都具有重要意义。传统的向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定采用形态鉴定法，依 赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期 长、成本高、受季节限制。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实 性与品种纯度鉴定。分子标记鉴定技术是W DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳 定遗传，可W反映生物的个体和群体特征。由于分子标记可W直接反映 DNA水平上的差 异，具有高度的专一性和特异性，用于鉴定种子纯度的分子标记主要的方法有RAPD、SSR和 SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)标记技术具有数量丰富、多态性高、共显性遗 传、扩增稳定、易于检测等方面的优点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、 标记和定位基因 W及分子标记辅助方面的应用。SSR标记通常具有共显性的特点，Fi杂交 种具有双亲等位基因的互补带型。鉴于不育系和其同型保持系遗传背景基本一致，只在不 育基因、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择DNA分子标记进行分析，从而 实现有效地区别和鉴定。SSR标记已成为现阶段用于鉴定种子纯度的常用方法，已广泛应 用于玉米、水稻、大豆的新品种纯度鉴定。但是目前在食用向日葵杂交种使用SSR分子标记 技术鉴定其真实性和纯度的报道鲜有，建立一套适于食用向日葵杂交种真实性和纯度鉴定 的SSR分子标记技术具有重要意义，可W克服传统的田间小区种植鉴定所带来的不足。 阳0化]SH361是北京=瑞农业科技有限公司2012年选育的食用向日葵晚熟杂交种，其亲 本组合为A436XR06-1264-1，生育期为118天左右；幼苗生长整齐，长势强；叶片上挺，卵圆 形，叶片数30片左右，叶色黄绿，叶片干净，株型紧凑；开花期一致，舌状花黄色；植株弯曲 度较大、株高190-220厘米左右；抗倒伏能力强；单盘粒数1010粒，单盘粒重126. 90克，粒 长2. 20厘米左右，宽0. 88厘米，百粒重17. 71克；巧粒色泽为黑色白边有细白色条纹，色 泽鲜亮，有光泽，巧仁饱满，外观商品性好；口感香甜，出仁率51. 31 %。该品种抗霜霉病， 中抗黄萎病；菌核病的发生率较低。该组合丰产性良好，最高亩产可达到320千克，适合各 类田块种植，中高肥力的田块种植更能充分发挥品种潜力。为保证该优质品种的最大经济 效益及其产业化的发展，需要一种权威的、高效准确的检测方法来鉴定所述食用向日葵杂 交种甜361的真实性和品种纯度，加快杂交种的质量检测进程。

【发明内容】

[0006] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种快速鉴定食用向日葵杂交种 SH361真实性和纯度的方法，所述方法方便、快捷，操作步骤简单，能够在短时间内对大量的 待测食用向日葵杂交种S册61样品进行快速鉴定，且测定结果准确。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实 性和纯度的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361 W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规的CTAB法提取上述各食用向日葵的 基因组DNA ; W09] 似W步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计如下SR-57、SR-123、 SR-830、SR-1040和SR-1164引物中的至少一种，分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
[0010] SR-57-F: 5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3';
[0011] SR-57-R: 5' -CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3，；
[0012] SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0013] SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,；
[0014] SR-830-F: 5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3，；
[0015] SR-830-R: 5' -GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3 ' ；
[0016] SR-1040-F: 5' -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3';
[0017] SR-1040-R:5'-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3'; 阳01 引 SR-1164-F: 5 ' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3 ' ；
[0019] SR-1164-R:5'-ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3';
[0020] (3)分别将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝 胶电泳处理，得到所述待测食用向日葵杂交种甜361 W及其亲本标准向日葵种子A436和 R06-1264-1的电泳图谱；
[0021] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 若所述杂交种甜361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则判定所 述待测食用向日葵杂交种甜361为真实；反之，为假。
[0022] 所述待测食用向日葵杂交种甜361的品种纯度按照公式所述杂交种甜361同时 具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带的样本种子数/检测的样本种子总 数X 100%计算得到所述待测食用向日葵杂交种甜361的品种纯度。
[0023] 优选的，所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，在所述 步骤（2)中，所述引物选自引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物SR-1040和引物 SR-1164中的任意两种。
[0024] 所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，所述步骤（2)中， 所述PCR反应体系包括：
[00巧]DNA 模板，30ng，1 Ji L ; 阳0%]引物，0.2 yM，Iii L ;
[0027] 10 X Easyhp Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mgh)，2mM，2. 5 y L ;
[0028] dNTPs,2. 5mM,2iiL ；
[0029] Eas}fTap DNA Polymerase for PAGE (Taq DNA 聚合酶），2.加 nits, 0. 5 y L ;
[0030] (1地2〇，17化。
[0031] 所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，所述步骤（2)中， PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每个 循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进行30个 循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C或-20°C保存，备用。
[0032] 所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，所述步骤（3)中， 所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶包括：
[0033] 尿素（Urea)，420g ;
[0034] 5 X TBE，IOOmL; 阳0对丙締酷胺，57g;
[0036] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ;
[0037] (1地2〇 定容至 1L。
[0038] 所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性的方法，所述步骤（3)中包括如 下步骤：取步骤（2)获得的PCR扩增产物加入IOiiL的Ix上样缓冲液（二甲苯菁0.025邑， 漠酪蓝0. 025g，0. 5M/L邸TA (PH = 8. 0) 2ml，去离子甲酯胺98ml)混合均匀，95 °C变性 5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电泳 比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后，经 3 X GelSafe核酸染料浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪，在波长为302nm紫外光激发 下拍照。
[0039] 所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性的方法，所述步骤（1)中，所述食 用向日葵的基因组DNA的提取步骤具体包括： W40] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0041] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳0创 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清600-800 yL至2ml离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris 饱和酪构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清 400-600 y L至2mL离屯、管中，备用； 阳0创 d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清300-400 yL至1.5血离屯、管中，备用；
[0044] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； W45] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得。
[0046] 所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性的方法，所述步骤（1)中还包括 将提取得到的基因组DNA模板进行定量检测和/或质量检测的步骤；
[0047] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用。
[0048] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积eXLoading Buffer混 合，并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样 孔中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带 型弥散，则表明DNA已降解不可用。
[0049] 本发明提供了一种由上述的方法在检测及鉴定食用向日葵杂交种真实性和品种 纯度领域的应用。
[0050] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有W下优点：
[0051] (1)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性的方法，通过对大量 向日葵的553引物进行筛选研究，特定选择引物51?-57、51?-123、51?-830、51?-1040和51?-1164 中的一个或多个做为引物，对提取的食用向日葵杂交种SH361及其亲本种植的向日葵的基 因组DNA进行PCR扩增，然后经凝胶电泳获得食用向日葵杂交种甜361及其亲本的电泳图 谱，用于所述食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的检测及鉴定，该检测方法方便、快 捷，操作步骤简单，能够在短时间内对大量的待测食用向日葵杂交种SH361样品进行快速 鉴定，测定结果准确、稳定可靠、检测费用低；
[0052] (2)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，特定 选择引物SR-57、SR-123、SR-830、SR-1040和SR-1164中的任意两种做为引物进行PCR扩 增，使得对所述食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的检测及鉴定更加准确可靠；
[0053] (3)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，通过 优化PCR的反应体系对向日葵的基因组DNA进行PCR扩增，更加有助于快速鉴定食用向日 葵杂交种SH361真实性和纯度的方法的优化，通过优化的PCR的扩增程序对食用向日葵的 基因组DNA进行PCR扩增，能够快速准确的测定待测食用向日葵杂交种甜361的真实性和 品种纯度；
[0054] (4)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，通过 优化食用向日葵基因组DNA的提取步骤，获得了纯度较高的DNA，更加有利于向日葵基因组 DNA的PCR扩增，使得对食用向日葵杂交种甜361的鉴定结果更加准确； 阳化5] (5)本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，通过 改进变性聚丙締酷胺凝胶显影步骤，步骤简单、安全，获得的电泳图谱清晰，便于对食用向 日葵杂交种甜361的品种鉴定，检测结果准确。
【附图说明】
[0056] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中 阳057] 图1是本发明实施例1的食用向日葵杂交种甜361 W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1的电泳图谱；
[0058] 图2是本发明实施例2的食用向日葵杂交种甜361 W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1的电泳图谱；
[0059] 图3是本发明实施例3的食用向日葵杂交种甜361 W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1的电泳图谱； W60] 图4是本发明实施例4的食用向日葵杂交种甜361 W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1的电泳图谱；
[0061] 图5是本发明实施例5的食用向日葵杂交种甜361 W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1的电泳图谱。
【具体实施方式】
[0062] 本发明所使用的主要试剂如下：
[0063] RNase A生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为GElOl ;
[0064] GelSafe核酸染料生产厂家为北京原平瞧生物技术有限公司，型号为EP106-01 ; [00化]所使用的SSR引物生产厂家为生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0066] Eas}fTap Buffer for PAGE、dNTPs、EasyTap DNA Polymerase for PAGE 和 6 X Loading Buffer生产厂家均为北京全式金生物技术有限公司、型号为API 12-02 ;
[0067] TEMED生产厂家为SIGMA,型号为T8133 ;
[0068] 本发明所使用的主要设备如下： W例高速冷冻离屯、机生产厂家为SIGMA、型号为3K15 ; 阳070] 电泳仪生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYY-8C ;
[0071] 水平电泳槽生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYCP-31E ;
[0072] 凝胶成像系统生产厂家为北京赛智创业科技有限公司，型号为化ampGel5000。 阳〇7引 实施例1
[0074] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤：
[00巧](1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下：
[0076] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0077] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳07引 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清750 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 y L 至2血离屯、管中，备用；
[0079] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积立氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清400 Ji L至1. 5血离屯、管中，备用；
[0080] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳0川 f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0082] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0083] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0084] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用；
[00化](2) W步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-57,分别对所述基 因组DNA进行PCR扩增；
[0086] SR-57-F: 5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3';
[0087] SR-57-R:5'-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3'; 阳0蝴 PCR反应体系如下：
[0089] DNA 模板，30ng，l 化；
[0090] 引物，0.2 yM，Iii L ;
[0091] 10 X Easyhp Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2〇，2mM，2. 5 y L ;
[0092] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0093] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0. 5 y L ;
[0094] (1地2〇，17化； 阳0巧]PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0096] 做将步骤似获得的PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到 所述食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤：
[0097] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括：
[0098] 尿素 （Urea)，420g ;
[0099] 5 X TBE，IOOmL ;
[0100] 丙締酷胺，57g 阳101] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g; 阳102] (1地2〇定容至1L; 阳10引 A)配制尿素6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热；
[0104] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠 酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳1化](4)收集食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1 种植得到的标准向日葵按照上述步骤（1)-(3)所获得的电泳图谱，将所述待测向日葵杂 交种甜361的图谱与其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的图谱进行比对，如图1 所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜361的亲本标准向日葵种子A436和 R06-1264-1，Fi为食用向日葵杂交种甜361，从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种 SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂 交种甜361为真实的。 阳106] 实施例2 阳107] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤：
[0108] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下： 阳109] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0110] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳1川 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于1200化pm下离屯、IOmin后，吸 取上清600 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清400 y L 至2血离屯、管中，备用；
[0112] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清300 Ji L至1. 5血离屯、管中，备用；
[0113] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀；
[0114] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0115] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0116] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0117] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用；
[0118] (2) W步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-123分别对各所述 基因组进行PCR扩增；
[0119] SR-123-F: 5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0120] SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3' ； 阳12U PCR反应体系如下： 阳12引 DNA模板，30ng，l化； 阳 123]引物，0.2 yM，Iii L ;
[0124] 10 X Easyhp Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2〇，2mM，2. 5 y L ; 阳 12引 dNTPs，2. 5mM，2 Ji L ; 阳 126] Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 阳 127] ddH2〇，17yL; 阳128] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0129] (3)将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，得到所述食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电 泳图谱，所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤：
[0130] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括：
[0131] 尿素 OJrea)，420g ; 阳13引 5 X T邸，100血； 阳133] 丙締酷胺，57g
[0134] N、N' -亚甲基双丙締酷胺，3g; 阳135] (1地2〇定容至1L; 阳136] A)配制尿素6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热； 阳137] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。
[0138] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 如图2所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜361的亲本标准向日葵种子A436 和R06-1264-1，Fi为食用向日葵杂交种甜361，从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种 SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂 交种甜361为真实的。 阳139] 实施例3
[0140] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤：
[0141] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下： 阳14引 a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0143] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳144] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000rpm下离屯、IOmin后，吸 取上清800 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清600 y L 至2血离屯、管中，备用；
[0145] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清350 Ji L至1. 5血离屯、管中，备用；
[0146] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀；
[0147] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0148] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0149] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0150] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用； 阳15U (2) W步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-830分别对各所述 基因组DNA进行PCR扩增；
[0152] SR-830-F: 5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3 ' ；
[0153] SR-830-R: 5' -GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3'; 阳154] PCR反应体系如下： 阳155] DNA 模板，3〇ng，lyL; 阳 156]引物，0.2 yM，Iii L ; 阳 157] IOXEasyTap Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2+)，2mM，2. 5yL ; 阳 15引 dNTPs，2. 5mM，2 Ji L ; 阳 159] Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ;
[0160] (1地2〇，17化； 阳161] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0162] (3)将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，得到所述食用向日葵杂交种甜361 W及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的 电泳图谱，所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤：
[0163] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括：
[0164] 尿素 OJrea)，420g ; 阳 1 化]5 X TBE ,IOOmL; 阳166] 丙締酷胺，57g 阳167] N、N' -亚甲基双丙締酷胺，3g;
[0168] (1地2〇 定容至 1L; 阳169] A)配制尿素6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热； 阳170] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳171] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 如图3所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜361的亲本标准向日葵种子A436 和R06-1264-1，Fi为食用向日葵杂交种甜361，从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种 SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向日葵杂 交种甜361为真实的。 阳172] 实施例4
[0173] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤：
[0174] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下： 阳17引 a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用； 阳176] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳177] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清700 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 y L 至2血离屯、管中，备用；
[0178] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清400 yL至1. 5血离屯、管中，备用；
[0179] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀；
[0180] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得； 阳1W] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0182] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0183] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用；
[0184] (2) W步骤（1)的所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-1040分别对各所 述基因组DNA进行PCR扩增； 阳化5] SR-1040-F: 5 > -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3 > ; 阳 186] SR-1040-R:5,-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3,； 阳187] PCR反应体系如下： 阳 1蝴 DNA 模板，3〇ng，lyL; 阳189]引物，0. 2 yM，1 化； 阳 190] IOXEasyTap Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2+)，2mM，2. 5yL ;
[0191] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 阳 19引 Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 阳 19引（1地2〇，17^1; 阳194] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0195] (3)将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，得到所述食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电 泳图谱，所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤：
[0196] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括：
[0197] 尿素 OJrea)，420g ; 阳 19引 5XTBE，100mL; 阳199] 丙締酷胺，57g 阳200] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ; 阳201] (1地2〇定容至1L; 阳202] A)配制尿素6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热； 阳20引 B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳204] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 如图4所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜361的亲本标准向日葵种子A436 和R06-1264-1，Fi为食用向日葵杂交种甜361，从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种 SH361同时具有其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向 日葵杂交种甜361为真实的。 阳205] 实施例5 阳206] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤： 阳207] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下： 悦0引 a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0209] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次；
[0210] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清650 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清550 y L 至2血离屯、管中，备用； 悦11] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血离屯、管中，备用； 阳212] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳21引 f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0214] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0215] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0216] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用；
[0217] 似W步骤（1)的所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-1164分别对各所 述基因组DNA进行PCR扩增； 阳21 引 SR-1164-F: 5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3，；
[0219] SR-1164-R: 5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3';
[0220] PCR反应体系如下： 阳 22 U DNA 模板，30ng，l 化； 阳22引 引物，0.2 yM，Iii L ; 阳22引 10 X Easyhp Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2〇，2mM，2. 5 y L ; 阳224] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 阳22引 Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0. 5 y L ; 阳226] (1地2〇，17^1; 阳227] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用； 阳22引 （3)将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，得到所述食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电 泳图谱，所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤：
[0229] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括： 阳230]尿素（Urea)，420g ; 阳 23U 5 X T邸，100血； 阳232] 丙締酷胺，57g 阳23引 N、N' -亚甲基双丙締酷胺，3g ; 阳234] (1地2〇定容至IL ;
[02对 A)配制尿素6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地20混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30mL，10 % APS 180化， TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量I X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热；
[0236] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入10化的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳237] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 如图5所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜361的亲本标准向日葵种子A436 和R06-1264-1，Fi为食用向日葵杂交种甜361，从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种 SH361同时具有其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则所述待测食用向 日葵杂交种甜361为真实的。 阳23引 实施例6
[0239] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤： 悦40] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下： 阳241] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0242] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳2创 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于1200化pm下离屯、IOmin后，吸 取上清750 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 y L 至2血离屯、管中，备用；
[0244] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清400 yL至1. 5血离屯、管中，备用；
[0245] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀；
[0246] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得； 阳247] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0248] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围I. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0249] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用；
[0250] 似W步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计引物SR-57和引物SR-1164 分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增； 阳巧 1 ] SR-57-F: 5 ' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3，； 阳巧2] SR-57-R:5'-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3,； 阳巧3] SR-1164-F: 5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3，；
[0254] SR-1164-R: 5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3'; 阳巧引 PCR反应体系如下： 阳巧6] DNA模板，30ng，l化； 阳巧7]引物，0.2 yM，Iii L ; 阳巧引 10 X Easyhp Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2〇，2mM，2. 5 y L ; 阳巧9] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0260] Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0. 5 y L ; 阳 26U (1地2〇，17^1;
[0262] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用； 阳％3] (3)将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，得到所述食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电 泳图谱，所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤：
[0264] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括：
[02化]尿素 （Urea)，420g ; 阳266] 5 XTBE, IOOmL ； 阳％7] 丙締酷胺，57g 阳268] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ;
[0269] (1地2〇 定容至 IL ;
[0270] A)配制尿素 6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30mL，10 % APS 180化， TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热； 阳27U B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳272] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 若所述待测食用向日葵杂交种甜361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征 谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。 阳273] 实施例7
[0274] 本发明所述的快速鉴定食用向日葵杂交种甜361真实性和纯度的方法，包括如下 步骤： 阳275] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜361、W及标准向日葵种子A436和 R06-1264-1种植得到的向日葵真叶为材料，利用CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组 DM，具体步骤如下：
[0276] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0277] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳27引 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于1200化pm下离屯、IOmin后，吸 取上清750 y L至2血离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的S氯甲烧和Tris饱和酪 构成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清600 y L 至2血离屯、管中，备用；
[0279] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积立氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血离屯、管中，备用； 阳280] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳281] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得； 阳28引将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测： 阳28引所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用； 阳284] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一的lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DM纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用； 阳285] (2) W步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计如下引物SR-57、SR-123、 SR-830、SR-1040和SR-1164引物，对各所述基因组DNA进行PCR扩增； 阳286] SR-57-F: 5 ' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3，； 阳287] SR-57-R:5'-CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3'; 阳288] SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 阳289] SR-123-R:5,-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,； 阳290] SR-830-F: 5，-CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3，； 阳291] SR-830-R:5,-GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3,； 阳292] SR-1040-F:5'-CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3,； 阳293] SR-1040-R:5'-TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3' ； 阳294] SR-1164-F: 5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3 ' ； 阳2巧]SR-1164-R: 5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3'; 阳296] PCR反应体系如下： 阳297] DNA 模板，30ng，l 化； 阳298]引物，0.2 yM，Iii L ; 阳299] 10 X Easyhp Buffer for PAGE (扩增缓冲液，含 Mg2〇，2mM，2. 5 y L ; 阳300] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ； 阳 3〇U Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 阳 30引（1地2〇，17^1; 阳303] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54退火30s，72°C延伸30s，进 行30个循环，最终72°C延伸20min，获得的扩增产物4°C保存，备用； 阳304] (3)将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电 泳，得到所述食用向日葵杂交种甜361及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1的电 泳图谱，所述6%尿素变性聚丙締酷胺凝胶电泳包括如下步骤： 阳305] 所述6 %尿素变性聚丙締酷胺凝胶成分包括： 阳306]尿素 OJrea)，420g ; 阳307] 5 X TBE ,IOOmL; 阳30引丙締酷胺，57g 阳309] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ; 阳310] (1地2〇定容至1L;
[0311] A)配制尿素6%变性聚丙締酷胺凝胶（Acr:Bis = 19:1):按照上述凝胶电泳体 系取化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液， 待充分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质 量浓度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30mL，10 % APS 180化， TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶 凝固后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽， 固定在电泳槽上，电泳槽中加入适量I X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条 件下预电泳比，使凝胶预热； 阳31引 B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。
[0313] (4)对比上述杂交种甜361 W及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱， 若所述待测食用向日葵杂交种甜361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征 谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH361为真实的。
[0314] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其它不同形式的变化或 变动。运里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 分别取由待测食用向日葵杂交种SH361、以及标准向日葵种子A436和R06-1264-1 种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA ; (2) 以步骤（1)所得的各所述基因组DNA为模板，设计如下SR-57、SR-123、SR-830、 SR-1040和SR-1164引物中的至少一种，分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增； SR-57-F:5' -TTCCATTTCCACCATTTTGG-3' ； SR-57-R:5' -CATTCATGGCCTAAAAGGTTC-3' ； SR-123-F:5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3' ； SR-123-R:5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3' ； SR-830-F:5' -CAAGTGCATTAGGTGGTTCTAACA-3' ； SR-830-R:5' -GCCCTCTGACTGTTGTATGACTG-3' ； SR-1040-F:5' -CTGCTGATCGTTTCTTGGATAGA-3' ； SR-1040-R:5' -TGCTAATCCTTCTAATCAACTTCCAC-3' ； SR-1164-F:5' -TGATCAACCTTTGTGATTTGGAG-3' ； SR-1164-R:5' -ATCTTTGACTCCCTCGCTTTCT-3' ； (3) 分别将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳处理，得到所述食用向日葵杂交种SH361以及其亲本标准向日葵种子A436和R06-1264-1 的电泳图谱； (4) 对比上述杂交种SH361以及其亲本标准种子A436和R06-1264-1的电泳图谱，若所 述杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R06-1264-1的特征谱带，则判定所述待 测食用向日葵杂交种SH361为真实；反之，为假；所述待测食用向日葵杂交种SH361纯度按 照公式所述杂交种SH361同时具有其亲本标准种子A436和R02-1264-1的特征谱带的样本 种子数/检测的样本种子总数X 100 %计算得到。2. 根据权利要求1所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法， 其特征在于，所述步骤（2)中，所述引物选自引物SR-57、引物SR-123、引物SR-830、引物 SR-1040和引物SR-1164中的任意两种。3. 根据权利要求1或2所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方 法，其特征在于，所述步骤（2)中，所述PCR反应体系包括： DNA 模板，30ng，1 μ L ; 引物，(λ 2μΜ，1 yL ; 10 X 扩增缓冲液，含 Mg2+，2mM，2· 5 μ L ; dNTPs，2. 5mM，2 yL ; Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ; ddH20,17 μ L。4. 根据权利要求3所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，其 特征在于，所述步骤（2)中，PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火 30s，72 °C延伸30s，之后每个循环退火温度下降0. 5 °C，直至54 °C，94 °C变性30s，54退火 30s，72°C延伸30s，进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物 4°C或-20°C保存，备用。5. 根据权利要求1-4任一所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方 法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述6%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶包括： 尿素，420g ; 5XTBE，lOOmL ; 丙烯酰胺，57g N、N' -亚甲基双丙烯酰胺，3g ; ddH20定容至1L。6. 根据权利要求5所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方法，其 特征在于，所述步骤（3)中包括如下步骤：取步骤（2)获得的PCR扩增产物加入10 μ L的 1 X上样缓冲液混合均匀，95°C变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 μ L，于恒定 电压300V，电流50mA-60mA下电泳lh，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿lcm时，停止电泳，取 出胶板，用ddH 20冲洗干净后，经3XGelSafe核酸染料浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成 像仪下，在波长为302nm紫外光激发下拍照。7. 根据权利要求1-6任一所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的方 法，其特征在于，所述步骤（1)中，所述食用向日葵的基因组DNA的提取步骤具体包括： a) 取所述食用向日葵真叶10mg置于装有研磨珠的2mL离心管中，置于液氮中预冷冻， 并将预冷冻过的离心管置于研磨器中在30Hz条件下研磨30s，随后迅速转移所述离心管于 液氮中待用； b) 取出步骤a)的离心管并加入1000 μ L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲液和 巯基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每lOmin取出所述离心管 上下颠倒混匀一次； c) 将步骤b)反应后的离心管放入4°C离心机中，于12000rpm下离心10min后，吸取 上清600-800 μ L至2mL离心管中，并加入等体积的由体积比为1:1的三氯甲烷和Tris饱 和酸构成的混合液，震荡混勾，放入4°C离心机中，于12000rpm离心15min后，吸取上清 400-600 yL至2mL离心管中，备用； d) 向步骤c)中的所述离心管中加入等体积三氯甲烷混匀，静置3min后，放入4°C离心 机中，12000rpm离心10min，吸取上清300-400 yL至1. 5mL离心管中，备用； e) 向步骤d)中的所述离心管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入4°C离 心机，7500印111离心71]1；[11，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入111^质量浓度为75%的乙醇，摇 晃离心管，充分洗涤所述沉淀，然后放入4°C离心机，7500rpm离心7min，弃去上清液，晾干 沉淀； f) 向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 μ L的无菌ddH20溶解DNA，再加入1 μ L 的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或_20°C条件下保存溶液，即得。8. 根据权利要求1-7任一所述的快速鉴定食用向日葵杂交种SH361真实性和纯度的 方法，其特征在于，所述步骤（1)中还包括将提取得到的基因组DNA模板进行定量检测和/ 或质量检测的步骤； 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 μ L用ddH20稀释400倍，用紫外分光光度 仪测定0D26Q、0D2S。，并计算0D26Q/0D2S。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯且可 用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用； 所述质量检测步骤具体包括：取5 μ L样品DNA与等体积6 X LoadingBuffer混合，并加 入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔中，180V 电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥散，则 表明DNA已降解不可用。9. 一种权利要求1-8任一所述的方法在检测及鉴定向日葵杂交种真实性和品种纯度 领域的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105861639SQ201510033343
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】张永平, 马德甯, 姚梅园, 司立平, 万县贞
【申请人】北京三瑞农业科技有限公司, 内蒙古三瑞农业科技有限公司, 甘肃德瑞农业科技有限公司