用于确定血浆激肽释放酶系统生物标记的试验的制作方法
【专利摘要】确定活化水平的血浆激肽释放酶(pKal)系统的方法和试验和其在评估pKal调节剂对pKal系统活性中的用途。
【专利说明】用于确定血浆激化釋放酶系统生物标巧的试验
[0001]相关申请的交叉引用
[0002 ]本申请要求于2013年10月21日提交的美国临时申请号61 /893，505申请日的益处， 和2014年2月14日提交的美国临时申请号61/939,837申请日的益处，其每篇的全部内容通 过引用并入本文。
[000；3]背景
[0004] 血浆激肤释放酶(pKal)是循环中主要的产生缓激肤的酶。经接触系统发生地al的 活化，运已经与遗传性血管性水肿化AE)相关的疾病病理学联系起来。缓激肤是疼痛、炎症、 水肿和血管生成的关键介体。
【发明内容】
[0005] 血浆激肤释放酶(PKal)是接触系统的丝氨酸蛋白酶组分并且是循环中主要的产 生缓激肤的酶。当暴露于外源或带负电的表面时，接触系统被因子XIIa活化，或在内皮细胞 表面上时，被脯氨酸簇肤酶活化（Sainz I.M.等，Thromb化emost 98,77-83,2007)。血浆激 肤释放酶的活化经其因子XII的反馈活化增强了内源性凝血并且经促炎九肤缓激肤的产生 加重了炎症。作为循环中主要的激肤原酶，血浆激肤释放酶主要负责脉管系统中缓激肤的 产生。Cl-抑制剂蛋白质(Cl-INH)-一血浆激肤释放酶的主要天然抑制剂一一的遗传缺陷 导致遗传性血管性水肿(HAE)。患有HAE的患者遭受通常由于未知的触发而加剧的疼痛性水 肿发作（Zuraw B丄.等，N ^igl J Med 359，1027-1036,2008)。通过在动物模型中使用药理 学试剂或基因研究，血浆激肤释放酶-激肤系统(血浆KKS)设及各种疾病。
[0006] 本公开是基于许多生物标记试验的开发，包括如本文所描述的HMWK离体活化试 验、内源性切割的HMWK试验和pKal离体活化试验。运种试验可用于测量受试者的血浆中血 浆激肤释放酶(pKal)系统的活化水平。它们也可用于评估候选化合物调节（抑制或活化） 地al系统的活性。
[0007] 在一个方面中，本公开描述了离体活化方法，包括：（i)解育获得自受试者的血浆 样品与血浆激肤释放酶(pKal)系统的活化剂(例如，FXIIa);(ii)现慢解育之前和之后血浆 样品中完整的高分子量激肤原(HMWK)、切割的HMK或二者的水平;和(iii)确定活化之后样 品中完整的HMWK的下降。任选地，在存在pKa 1调节剂候选物（例如，抑制剂候选物比如 DX2930或活化剂候选物）的情况下解育血浆样品和活化剂。方法可进一步包括评估地al调 节剂候选物的活性。在一些实施方式中，通过蛋白质印迹分析测量完整的丽WK和切割的 HMWK的水平，比如Protein Simple蛋白质印迹分析。
[000引在另一方面中，本公开描述了评估受试者中血浆活化的方法，包括:提供来自受试 者的血浆样品；和测量血浆样品中切割的HMWK的水平。可通过，例如，蛋白质印迹比如 Protein Simple蛋白质印迹分析测量切割的HMWK的水平。在一些实施方式中，受试者患有 与地al系统相关的疾病或怀疑患有与地al系统相关的疾病。可选地或另外，用地al抑制剂 治疗受试者。本文所述的任何方法可进一步包括评估PKal抑制剂的效力，其中与治疗之前 相比，治疗之后下降的切割的HMWK的水平表示地al抑制剂是有效的。
[0009] 在仍另一方面中，本公开提供了用于确定样品（例如，来自受试者的血浆样品）中 地曰1活性的离体试验，包括：（i)在存在地al底物的情况下，解育样品与地al系统活化剂(例 如，因子XIIa或FXIIa),和（ii)基于底物的切割速率测量地al的活性。在一些实施例中，底 物连接至标签，所述标签能够在被地al切割之后释放可检测的信号并且基于可检测的信号 的强度(magnitude)测定底物的切割速率。在一些实施例中，血浆样品与活化剂、pKal底物 和地al调节剂候选物(例如，抑制剂调节剂或活化剂调节剂)一起解育。方法可进一步包括 评估pKa 1调节剂候选物的活性（例如，DX-2930)，其中在存在地a 1调节剂候选物的情况下 地al活性水平相对于在没有地al抑制剂候选物的情况下地al活性水平的变化表示抑制剂 候选物是有效的。例如，下降水平的地al活性表示地al调节剂候选物是地al抑制剂;而升高 水平的地al活性表示地al调节剂候选物是地al活化剂。本文所述的任何试验方法可在微板 中进行。
[0010] 在本文所述的任何试验方法中，方法可进一步包括评估受试者是否患有与地al相 关的疾病（例如，HAE)或处在与pKal相关的疾病（例如，HAE)的风险中；其中与预定的值相 比，升高水平的切割的HMWK表示受试者患有疾病或处在疾病的风险中。在一些实施方式中， 受试者可W是患有与pKal相关的疾病（例如，HAE)的人类患者并且进行疾病治疗（例如， 地al抑制剂比如DX2930)。可在治疗过程之后或在治疗过程期间获得血浆样品。在一些实施 方式中，方法进一步包括评估治疗的效力；其中与治疗(例如，PKal抑制剂比如DX2930)之前 相比下降的切割的HMWK的水平或治疗(例如，地al抑制剂比如DX2930)过程期间下降的切割 的HMWK的水平表示治疗是有效的。
[0011] 此外，本公开提供了评估受试者，例如，处在地al介导的或缓激肤介导的疾病的风 险中或患有地al介导的或缓激肤介导的疾病的受试者的方法，该方法可设及本文所述的任 何试验方法。提供的方法允许分析患有血浆激肤释放酶介导的血管性水肿化MA)，或地al介 导的其他疾病的患者，用于评估和治疗。
[0012] 本公开的实施方式提供了生物标记和其在鉴定和治疗患者中的用途，例如，所述 患者是遭受由血浆激肤释放酶产生的缓激肤造成的水肿的患者。可W许多方式使用本文公 开的方法、组合物和设备。例如，PKal标记的水平可用于鉴定与升高的接触系统活化相关的 疾病。初始筛选可根据例如疾病的临床前模型中血浆激肤释放酶抑制剂（例如，DX-88、 EPIKAL2或DX-2930)的体外或体内测试。本文公开的标记也可用作药效生物标记或W其他 方式监测受试者对激肤释放酶抑制剂的应答。本文公开的标记可用于伴随诊断W确保治疗 血浆激肤释放酶介导的疾病，控制地al介导的或缓激肤介导的疾病的预防性疗法期间的剂 量，所述地al介导的或缓激肤介导的不适，例如，HAE、非组胺依赖性特发性血管性水肿、类 风湿性关节炎、克罗恩氏病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、脈毒性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注 损伤、脑水肿、糖尿病视网膜病变、糖尿病型肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形 成、与屯、室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素诱导的血小板减少、血栓 栓塞病、和具有不稳定的屯、绞痛的冠屯、病、水肿、眼部疾病、痛风、肠道肠疾病、口腔黏膜炎、 神经性疼痛、炎症疼痛、椎管狭窄-退行性脊椎病、术后肠梗阻、大动脉动脉瘤、骨关节炎、遗 传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或周围肿瘤脑水肿、脈毒、急性中脑动脉(MCA)缺 血性事件（中风）、再狭窄(例如，血管成形术之后）、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫性疾病、 炎性疾病、屯、血管疾病、神经疾病、蛋白质错折叠相关的疾病、血管生成相关的疾病、高血压 肾病和糖尿病型肾病、过敏和呼吸疾病(例如过敏、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘 迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤）。
[0013] 在一个方面中，本公开提供了评估或治疗受试者的方法，例如，讲PKal介导的疾 病，比如缓激肤介导的血管性水肿与组胺介导的疾病区分开，或预测地al介导的疾病的将 来的发作，包括获取，例如，确定与本文公开的地al活化相关联的一种或多种标记(pKal标 记），例如，前激肤释放酶，活性地al、a2M-pKal、Cl-INH-pKal、完整的激肤原和切割的激肤 原的水平，从而评估或治疗所述受试者。在一些实施方式中，方法包括获取，例如，检测，与 组胺介导的炎症反应相关联的一种或多种标记化-标记），例如，类膜蛋白酶的水平。
[0014] 在一些实施方式中，所述pKal介导的疾病是HAE、IAE、I抓或IBS。在一些实施方式 中，所述地al介导的疾病选自非组胺依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩氏 病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、脈毒性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病视 网膜病变、糖尿病型肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与屯、室辅助设备或支 架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素诱导的血小板减少、血栓栓塞病和具有不稳定的 屯、绞痛的冠屯、病、水肿、眼部疾病、痛风、肠道肠疾病、口腔黏膜炎、神经性疼痛、炎症疼痛、 椎管狭窄-退行性脊椎病、术后肠梗阻、大动脉动脉瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓 塞、中风、头部创伤或周围肿瘤脑水肿、脈毒、急性中脑动脉(MCA)缺血性事件（中风）、再狭 窄（例如，血管成形术之后）、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫性疾病、炎性疾病、屯、血管疾 病、神经疾病、蛋白质错折叠相关的疾病、血管生成相关的疾病、高血压肾病和糖尿病型肾 病、过敏和呼吸疾病(例如过敏、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤 维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如，烧伤或化学损伤）。
[0015] 在另一方面中，本公开提供了评估或治疗受试者的方法，所述受试者具有与地al 介导的疾病，例如，缓激肤介导的血管性水肿，和组胺相关的疾病一致的症状，所述方法包 括a)任选地，确定所述受试者具有与地al介导的疾病和组胺相关疾病的一种或二者一致的 症状，例如，水肿或腹部不适;b)如果所述受试者还未W用于所述症状的抗组胺疗法治疗， 那么用抗组胺疗法治疗所述受试者；C)获取，例如，检测，与地al活化相关的一种或多种标 记(pKal标记）的水平，例如，前激肤释放酶、活性地al、a2M-地al、Cl-INH-pKal、完整的激肤 原和切割的激肤原的水平;d)如果所述水平符合预定的标准，例如，如果其为参考水平或高 于参考水平:为激肤释放酶抑制剂疗法选择受试者;或施用激肤释放酶抑制剂至所述受试 者，从而评估或治疗所述受试者。在一些实施方式中，方法包括为激肤释放酶抑制剂疗法选 择受试者。在某些实施方式中，方法包括施用激肤释放酶抑制剂至所述受试者。在具体的实 施方式中，为激肤释放酶抑制剂疗法选择受试者;或施用激肤释放酶抑制剂至所述受试者， 在测定受试者已经显示对所述抗组胺疗法可接受的响应之前进行，例如，在用抗组胺疗法 的所述治疗的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时内进行。在一些实施方式中，测定所述受试者具 有与地al介导的疾病和组胺相关的疾病二者一致的症状和从所述患者获取用于确定pKal 标记的水平的样品在彼此的30分钟、1、2或3个小时内进行;或与在访问健康护理提供人员 的同时进行。
[0016] 在一些实施方式中，所述地al抑制剂选自DX-88、DX-2930或化化al-2。
[0017] 在一些实施方式中，方法包括获取，例如，确定，与组胺介导的炎症反应相关的一 种或多种标记化-标记）的水平。在某些实施方式中，评估所述受试者对地al介导的疾病的 易感性。在某些实施方式中，所述受试者具有例如与pKal介导的疾病，例如，水肿，例如， HAE，一致的症状。在某些实施方式中，所述受试者具有特征在于不期望的地al活化的疾病 的症状并且所述受试者已经被施用抗组胺疗法。在具体的实施方式中，所述抗组胺疗法在 如本文公开的确定步骤之前或之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时内施用。在具体的实施 方式中，方法进一步包括例如在如本文公开的评估或确定之前、之后或期间施用抗组胺疗 法至所述受试者。
[0018]在一些实施方式中，响应所述测定或评估，施用激肤释放酶抑制剂至所述受试者。 在某些实施方式中，所述受试者具有一种或多种或所有的下述症状或特性:复发性肿胀发 作；肿胀，其中所述肿胀完全或主要是外周性的，例如，受试者没有明显的腹部或呼吸道肿 胀;等麻疹;在没有感染迹象的情况下的红肿、疼痛和肿胀;对抗组胺剂或皮质激素疗法无 响应;或具有非组胺介导的水肿。在某些实施方式中，所述受试者具有持久的或复发性水肿 并且对抗组胺疗法和类固醇疗法中的一种或二者无应答。在某些实施方式中，受试者没有 地al介导的疾病例如HAE、IAE、I抓或IBS的历史;受试者具有地al介导的疾病例如HAE、IAE、 IBD或IBS的历史，受试者没有HAE的历史;受试者具有HAE的历史;受试者没有IAE的历史;受 试者具有IAE的历史;受试者没有IBD或IBS的历史;受试者具有IBD或IBS的历史;受试者没 有组胺介导的疾病的历史，例如，食品过敏;受试者具有组胺介导的疾病的历史，例如，食品 过敏;受试者没有PKal介导的疾病例如HAE、IAE、I抓或IBS的历史，并且没有组胺介导的疾 病的历史，例如，食品过敏;或受试者没有地al介导的疾病例如HAE、IAE、IBD或IBS的历史， 并且具有组胺介导的疾病的历史，例如，食品过敏:受试者具有地al介导的疾病例如HAE、 IAEJBD或IBS的历史，并且没有组胺介导的疾病的历史，食品过敏;或受试者具有地al介导 的疾病例如HAE、IAE、I抓或IBS的历史，并且具有组胺介导的疾病的历史，例如，食品过敏。 [00 19]在一些实施方式中，受试者已经用激肤释放酶抑制剂，例如，在用于例如有HAE的 预防性疗法中，治疗，并且受试者被评估或监测对激肤释放酶抑制剂的应答，和任选地，响 应所述监测，选择或施用疗法，例如，响应测定，调整激肤释放酶抑制剂的剂量。在一些实施 方式中，在伴随诊断的背景下进行测定地al标记，和任选地，基于测定给予或取消施用疗 法。在某些实施方式中，响应所述获取，鉴定即将发生的急性发作，例如HAE或IEA发作。在具 体的实施方式中，评估所述受试者对特发性血管性水肿的易感性。在具体的实施方式中，所 述评估包括确定所述受试者是否遭受PKal介导的疾病，例如，缓激肤介导的疾病，例如， 地al介导的血管性水肿，或组胺介导的疾病，例如，食品过敏反应。
[0020]在一些实施方式中，受试者没有地al介导的疾病的历史，例如，HAE或IAE。在一些 实施方式中，受试者具有地al介导的疾病的历史，例如，HAE或IAE。在一些实施方式中，受试 者没有地al介导的疾病的历史，例如，HAE、IAE、I抓或IBS;受试者具有地al介导的疾病的历 史，例如，HAE、IAEJBD或IBS,受试者没有HAE的历史；受试者具有HAE的历史;受试者没有 IAE的历史;受试者具有IAE的历史;受试者没有IBD或IBS的历史;受试者具有IBD或IBS的历 史;受试者没有组胺介导的疾病的历史，例如，食品过敏;受试者具有组胺介导的疾病的历 史，例如，食品过敏;受试者没有地al介导的疾病的历史，例如，HAE、IAE、I抓或IBS，并且没 有组胺介导的疾病的历史，例如，食品过敏;或受试者没有PKal介导的疾病的历史，例如， HAE、IAE、I抓或IBS,并且具有组胺介导的疾病的历史，例如，食品过敏:受试者具有地al介 导的疾病的历史，例如，HAE、IAE、I抓或IBS,并且没有组胺介导的疾病的历史，食品过敏;或 受试者具有地al介导的疾病的历史，例如，HAE、IAE、I抓或IBS,并且具有组胺介导的疾病的 历史，例如，食品过敏。
[0021] 在一些实施方式中，用基于抗体的试剂检测pKal标记，例如，本文公开的pKal标 记。在某些实施方式中，用夹屯、免疫试验检测地al标记。在某些实施方式中，方法包括例如 通过夹屯、免疫试验，获取例如检测a2M-地a巧日Cl-INH-地al的水平。在某些实施方式中，方 法包括例如通过电泳分离试验例如蛋白质印迹，获取例如检测激肤原例如完整的或切割的 激肤原之一或二者的水平。在一些实施方式中，在试验中检测地al标记，例如，激肤原，所述 试验依赖于例如通过来自其他产品的分析物的蛋白质印迹分离，例如，电泳分离。在一些实 施方式中，用Simple Western?试验检测地al标记。Simple Western?试验是本领域已知的 (见，例女曰，Rustandi等.Qualitative and quantitative evaluation of Simon?,a new CE-based automated Western blot system as applied to vaccine development.Electrophoresis.2012 Sep;33(17):2790-7)。
[0022] 在一些实施方式中，用夹屯、免疫试验检测前激肤释放酶的第一pKal标记，例如活 性preKal、a2M-pKal或Cl INH-pKal并且在依赖于从其他产品分离，例如，电泳分离，例如通 过蛋白质印迹或Simple Western?,分析物的试验检测第二地al标记，例如，激肤原。在某些 实施方式中，PKal标记的检测是定性的。在某些实施方式中，PKal标记的检测是定量的。在 具体的实施方式中，方法包括确定Cl-INH-pKal和a2M-地al的水平。在具体的实施方式中， 方法包括确定活性地al的水平。在具体的实施方式中，各自检测前激肤释放酶、活性地al、a 2M-pKal、Cl-INH-pKal、完整的激肤原和切割的激肤原的水平。
[0023] 在一些实施方式中，方法包括比较P K a 1标记的水平，例如，前激肤释放酶、活性 地al、a2M-pKal、Cl-INH-pKal、完整的激肤原或切割的激肤原的水平与参考值。在某些实施 方式中，所述参考值是HAE，例如，一个或多个HAE受试者中所述地al标记的水平的函数。在 某些实施方式中，所述参考值是例如急性发作期间一个或多个HAE受试者中发作期间HAE中 所述地al标记的水平的函数。在某些实施方式中，所述参考值是IAE，例如，一个或多个IAE 受试者中地al标记的水平的函数。在某些实施方式中，所述参考值是急性发作期间IAE中， 例如，急性发作期间一个或多个IAE受试者中地al标记的水平的函数。在某些实施方式中， 所述参考值是在没有HAE或IAE的情况下，例如，在没有HAE或IAE历史的一个或多个受试者 中，pKa 1标记的水平的函数。
[0024] 在具体的实施方式中，方法包括例如，响应比较，使受试者分类，例如，就地al介导 的疾病的风险使受试者分类，或施用或取消所述受试者的疗法。在某些实施方式中，方法包 括，例如，响应比较，选择对所述受试者的治疗。在一些实施方式中，方法包括，例如，响应比 较，施用或取消所述受试者的疗法，例如，激肤释放酶结合试剂;缓激肤B2受体括抗物;或 Cl-INH替换试剂。在具体的实施方式中，所述治疗是施用pKal抑制剂，例如，选自DX-88、 化化al-巧阳X-2930的地al抑制剂。
[0025] 在一些实施方式中，来自所述受试者的样品接触包括用于本文下面公开的两种或 更多种标记的捕获试剂的底物，例如：前激肤释放酶，例如，抗前激肤释放酶抗体；活性 pKal，例如，抗活性pKal抗体；a2M-pKal，例如，抗a2M-pKal抗体；ClINH-pKal，例如，抗 Cl INH-地al抗体;或H标记，例如，抗H标记抗体;任选地，其中至少一种捕获试剂是用于地al 标记的捕获试剂。
[0026] 在一些实施方式中，方法包括从所述受试者获取样品，例如，血液或血浆样品。
[0027] 在一些实施方式中，所述底物包括：用于Cl-INH-pKal的捕获试剂；和用于a2M-地al的捕获试剂。在某些实施方式中，所述底物进一步包括下述之一或二者:用于前激肤释 放酶的捕获试剂，例如，抗前激肤释放酶抗体;用于活性地al的捕获试剂，例如，抗活性地al 抗体。
[0028] 在一些实施方式中，第一捕获试剂（用于第一标记)和第二捕获试剂（用于第二标 记)放置在底物上，使得对于存在第一标记的信号可与对于存在第二标记的信号区分开。在 某些实施方式中，所述第一捕获试剂(用于第一标记)位于第一位置或地址并且所述第二捕 获试剂（用于第二标记)位于第二位置或地址。在具体的实施方式中，所述第一位置或地址 和所述第二位置或地址不在所述底物上重叠。在某些实施方式中，所述第一捕获试剂是用 于第一地al标记。在某些实施方式中，所述第一捕获试剂是用于第一PKal标记并且所述第 二捕获试剂是用于第二地al标记。在某些实施方式中，所述第一捕获试剂是用于地al标记 并且所述第二捕获试剂是用于H-标记。在某些实施方式中，所述第一标记是2M-pKal并且所 述第二标记是ClINH-pKal。在某些实施方式中，用于2M-pKal的捕获试剂是抗2M-pKal抗体 和用于Cl INH-pKal的捕获试剂是抗Cl INH-pKal抗体。
[0029] 在某些实施方式中，方法包括使底物接触可检测的，例如，标记的，抗2M-地al抗体 和可检测的，例如，标记的，抗ClINH-pKal抗体，W确定地al标记的存在或量。在某些实施方 式中，所述抗体用产生有色产物、发射光子、吸收光子、改变底物，或改变底物的导电性的部 分标记。在某些实施方式中，所述抗体用使用电化学发光的部分标记。在某些实施方式中， 所述抗体用聚苯乙締横酸钢标记。在具体的实施方式中，所述底物提供在Meso Scale Discovery设备中。在具体的实施方式中，所述底物提供为浸溃棒设备，适于与血液和血浆 之一或二者一起使用。在具体的实施方式中，所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂放置 在共有或流体连接腔室中，例如，腔，例如，多腔设备，例如，多孔板的孔或凹陷中。在具体的 实施方式中，所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂印刷在底物上。
[0030] 在一些实施方式中，用于第一地al标记的所述捕获试剂在所述底物上的第一位置 并且用于第二地al标记的所述捕获试剂在所述底物上的第二位置，并且所述第一和第二位 置放置在所述底物上，使得存在第一 PKal标记的信号可与来自第二PKal标记的信号区分 开。在某些实施方式中，所述底物在第=位置包括用于第=标记的捕获试剂，并且第=位置 是放置在所述底物上，使得对于存在第=标记的信号可与来自所述第一和第二标记的信号 区分开。在具体的实施方式中，所述第一捕获试剂对于a2M-pKal或ClINH-地al是特异的。在 具体的实施方式中，所述第一捕获试剂对于02M-地al是特异的并且所述第二捕获试剂对于 Cl INH-pKal是特异的。
[0031] 在一些实施方式中，样品中地al标记的水平的测定可在底物接触所述样品的1、2、 3、4或5个小时内进行。在一些实施方式中，样品中两个地al标记的水平的测定可在底物接 触所述样品的1、2、3、4或5个小时内进行。在一些实施方式中，两个地a 1标记的水平的测定 可在同时进行的试验例如，解育中进行，或对于彼此重叠的试验的其他间隔进行。
[0032] 在另一方面中，本公开提供了包括用于例如，如本文所描述的多种PKal标记的捕 获试剂的底物。
[0033] 在进一步的方面中，本公开提供了确定疾病是否容易受地al抑制剂的治疗影响的 方法，包括:评估一种或多种例如本文所描述的地al标记在例如，遭受所述疾病的受试者， 或所述疾病的动物模型中的水平；比较测定的水平与参考，其中符合预定标准的水平，例 如，如果其为参考水平或高于参考水平，表示疾病容易受用地al抑制剂的治疗的影响。在一 些实施方式中，方法包括评估激肤释放酶抑制剂体外或体内的作用，或在所述疾病的动物 模型中的作用。
[0034] 在另一方面中，本公开提供了治疗患有地al介导的疾病，例如，缓激肤介导的疾病 的受试者的方法，包括通过例如本文所述的方法评估本文所述的地al标记的水平，确定，和 响应所述评估，选择治疗，例如，选择激肤释放酶抑制剂的剂量或给药频率之一或二者。在 一些实施方式中，方法包括施用激肤释放酶抑制剂至所述受试者。在一些实施方式中，所述 患者在所述评估之前已经施用激肤释放酶抑制剂。在某些实施方式中，方法包括W所述选 择的剂量或频率施用激肤释放酶抑制剂。
[0035] 在进一步的方面中，本公开提供了确定疾病是否容易受到地al抑制剂治疗的影响 的方法，包括:评估例如本文所描述的一种或多种地al标记在例如遭受所述疾病的受试者， 或所述疾病的物模型中的水平；比较测定的水平与参考，其中符合预定标准的水平，例如， 如果其为参考水平或高于参考水平表示疾病容易受到地al抑制剂治疗的影响。在一些实施 方式中，方法包括评估激肤释放酶抑制剂体外或体内，或在所述疾病的动物模型中的作用。
[0036] 在另一方面中，本公开描述了 W最小的接触活化，收集样品，例如，血液的方法和 设备。在一个实施方式中，本公开描述了容器，其中放置本文所述的捕获试剂，例如，激肤释 放酶抑制剂，例如，序列与DX-88类似的多肤，例如，与DX-88的差异不多于1、2或5个氨基酸 残基的多肤，例如，EPIKAk2。容器配置为例如具有开口、开孔、隔膜等，W便使得从受试者 收集样品，例如，血液，并且在相同容器中结合样品中地al相关的标记，例如，PKal与捕获试 剂。测量结合的物质，例如，PKal，可在相同容器中进行或在实施方式中，从之前的容器去除 底物，W测量，例如，测量可在另一设备中或其上。在实施方式中，容器的体积是0.5-100、 0.5-50、5-10、1-100、1-50、l-25ml。在实施方式中，捕获试剂，例如，pKal捕获试剂放置在容 器的内表面。捕获试剂可结合表面，第一特异性结合伴侣结合表面并且第二特异性结合伴 侣结合捕获试剂。特异性结合伴侣的例子是生物素和抗生物素蛋白。在实施方式中，生物素 化的捕获试剂，例如，PKal捕获试剂，例如，激肤释放酶抑制剂，例如，序列与DX-88类似的多 肤，例如，与DX-88的差异不多于1、2或5个氨基酸残基的多肤，例如，Epil?d-2是放置在涂布 有抗生物素蛋白的容器的表面。
[0037] 本公开提供了用于评估和治疗的、能够鉴定患有血浆激肤释放酶介导的血管性水 月中化MA )，或由地a 1介导的其他疾病的患者的生物标记。
[0038] 经生物标记显示具备地al活化的患者是用于用地al抑制剂，比如DX-88-一一种 批准用于治疗与HAE相关的急性水肿发作的地al的小蛋白质抑制剂一一治疗的候选。其他 地al抑制剂包括DX-2930,其是全人抗体抑制剂。在一些实施方式中，经生物标记显示具备 pKal活化的患者是用于用缓激肤B2受体括抗物，例如，Incatibant((Firazyr?p治疗的候 选。在一些实施方式中，经生物标记显示具备地al活化的患者是用于用Cl-INH替换试剂，例 如，纯化的人己氏消毒的纳米过滤的Cl-INH浓缩物((Bcrin饥"))治疗的候选。
[0039] 本公开的实施方式提供了生物标记和其在鉴定和治疗患者中的用途，例如，遭受 由血浆激肤释放酶产生的缓激肤造成的水肿的患者。本文公开的方法、组合物和设备用于 许多方面。例如，PKal标记的水平可用于鉴定与升高的接触系统活化相关的疾病。初始筛选 可根据用血浆激肤释放酶抑制剂(例如，DX-88、EPIKAk2或DX-2930)，例如，在疾病的临床 前模型中的体外或体内测试。本文公开的标记也可用作药效生物标记或W其他方式监测受 试者对激肤释放酶抑制剂的应答。本文公开的标记可用于伴随诊断W确保治疗血浆激肤释 放酶介导的疾病，控制HAE的预防性疗法期间的剂量，或鉴定即将发生的急性HAE发作。
[0040] 其他示例性实施方式包括：
[0041] 基于微板的地al活性试验，包括：（a)提供来自受试者的血浆样品；（b)在存在地al 底物的情况下解育血浆样品与地al系统活化剂，其中底物连接至能够在被地al切割之后释 放可检测的信号的标签;和山)基于可检测的信号的密度测量地al的活性。活化剂可W是因 子FXIIa。在一些实施例中，血浆样品可与活化剂、pKal底物和地al抑制剂候选物一起解育。 在一些实施例中，方法可进一步包括评估地al抑制剂候选物的活性，其中与在没有地al抑 制剂候选物的情况下地al活性的水平相比，在存在地al抑制剂候选物的情况下下降水平的 地al活性表示抑制剂候选物是有效的。
[0042] 在下面的描述中阐释一个或多个本公开的实施方式的细节。本公开的其他特征或 优势将从下述附图和数个实施方式的详细描述，W及所附的权利要求中是显而易见。
【附图说明】
[0043] 图1是参与血浆激肤释放酶的接触系统活化的要素的描述。切割的HMWK可通过蛋 白质印迹测定。a 2M-pKa 1和C11 NH-pKa 1可通过免疫试验(MSD平台）测定。
[0044] 图2显示通过蛋白质印迹分析的切割的激肤原检测。在还原条件下使用SDS-PAGE (3-8%化iS-乙酸盐)分析样品，随后转印至PVDF膜并且免疫印迹。泳道1 -50nM完整的激肤 原;泳道2-50nM切割的激肤原;泳道3-50nM低分子量激肤原;泳道4-1:20巧樣酸钢化的人血 浆(玻璃收集管）；泳道5-激肤释放酶处理的1:20巧樣酸钢化的人血浆(塑料）；泳道6-1:20 巧樣酸钢化的人血浆(塑料）；泳道7-1:20巧樣酸钢化的人血浆(塑料），添加20nM 2链激肤 原。
[0045] 图3显示ClINH-pKal复合物的纯化。阳离子交换色谱图（图A)表明了ClINH、pKa巧口 复合物的分离。收集来自阳离子交换的组分并且通过SDS-PAGE分析(图B)。
[0046] 图4显示人血浆中ClI NH-pKa 1检测的夹屯、ELISA标准曲线。将小鼠抗pKa 1 (克隆 13G11)铺平板并且将山羊抗Cl抑制剂用于检测。
[0047] 图5显示人血浆中ClINH-地al检测的夹屯、ELISA标准曲线。将山羊抗Cl-INH铺平板 并且将小鼠抗地al(克隆13G11)用于检测。
[004引图6显示a2M-pKal复合物的纯化。通过尺寸排阻色谱纯化复合物（图A)并且通过 SDS-PAGE分析组分（图B)。
[0049] 图7显示a2M-地al复合物的定量。显示当添加过量a2M时，血浆激肤释放酶活性下 降至稳定水平（图A)。构建使用10倍过量的a2M相对地al作为标准曲线，由其可根据复合物 中地al的浓度测定我们纯化的a2M-pKal复合物的摩尔浓度。
[0050] 图8显示人血浆中a2M-地al检测的夹屯、化ISA标准曲线。将抗a2M铺平板并且将小 鼠抗地al (克隆13G11)用于检测。
[00川图9显示人血浆中a2M-地al检测的夹屯、ELISA标准曲线。将抗地al (克隆13G11)铺 平板并且将抗02M用于检测。
[0化2] 图10显示用硫酸葡聚糖活化之后正常人血浆中ClINH-地a巧日a2M-地al复合物的 检测。
[0053] 图11显示发作期间获得的患者样品中完整的激肤原（即，1-链）的检测。将患者血 浆样品收集在包含抗蛋白酶混合物的巧樣酸盐化的血浆管中。
[0054] 图12是基于微板的地al活性试验的示意图，伴随实验显示DX-2930对治疗的猴子 中地al活性的抑制活性。
[0055] 图13显示来自安慰剂/媒介处理的猴子的血浆中W及渗入至该相同血浆的DX-2930 对照的实验。
[0化6] 图14显示来自HAE患者的血浆样品中的HMWK(CM、DG、BB和GR)。将样品收集在抗蛋 白酶抑制剂混合物中。丽:标记;C: 1链(6.4化g/mU巧链（1.5化g/mL); 1: CM基础;2: CM发作； 3: DG基础;4: DG发作；5: BB基础;6: BB发作；7: GR基础;8: GR发作；和9:储存的正常血浆。 [0057] 图15显示如通过蛋白质印迹试验测定来自HAE患者的样品中1链HMWK的水平。
[005引图16显示食蟹猴中DX-2930对地al活化的抑制活性。在第4天的APTT血浆样品的食 蟹猴激肤原蛋白质印迹分析中使用多剂量DX-2930(有或没有通过高岭±或151^/1111^硫酸葡 聚糖的血浆活化）。
[0化9] 图17图解示例性HMWK离体活化试验，用于使用Protein SimpleWestern分析和传 统的蛋白质印迹分析检查示例性地al抑制剂Dx-2930的抑制活性。本文所述的HMWK离体活 化试验显示DX-2930抑制地al活化的最小水平，其超过正常人血浆中的单独内源性Cl抑制 剂。
[0060] 图18描绘了 HMK离体活化试验，其显示了用DX2930滴定的因子XIIa活化的血浆的 Protein Simple原始数据。
[0061] 图19显示了如通过蛋白质印迹分析测定的30分钟活化之后血浆中人HMW激肤原的 检测。
[0062] 图20显示了Protein SimpleWestern试验和传统的蛋白质印迹试验在检测血浆活 化中的比较。
[0063] 图21显示了Protein SimpleWestern试验和传统的蛋白质印迹试验在检测血浆活 化中的比较。
[0064] 图22显示了在清洁血浆样品B畑745047中30分钟FXIIa活化之后1链HMWK降低的百 分数。
[0065] 图23显示了在清洁血浆样品B畑745048中30分钟FXIIa活化之后1链HMWK降低的百 分数。
[0066] 图24显示了在清洁血浆样品B畑745064中30分钟FXIIa活化之后1链HMWK降低的百 分数。
[0067] 图25显示了在清洁血浆样品B畑745062中30分钟FXIIa活化之后1链HMWK降低的百 分数。
[0068] 图26显示了在清洁血浆样品服H745049、B畑745062和服H745063中30分钟FXIIa活 化之后1链HMWK降低的百分数。
[0069] 图27是显示用不同浓度的FXIIa降低血浆中的I链HMWK的图。
[0070] 图28显示了如通过本文所述的内源性切割的激肤原试验测定的正常的、基础的和 HAE发作患者中2链HMWK的水平。
[0071 ] 图29是显示如通过Protein Simple蛋白质印迹和传统的蛋白质印迹测定的HAE样 品中内源性切割的激肤原的图。
[0072] 图30显示了来自HAE患者的样品中内源性切割的激肤原的水平。泳道1:纯化的1链 和2链HMWK。泳道2:用巧樣酸盐收集的正常人血浆样品。
[0073] 图31是显示来自用DX-2930处理的猴子的血浆样品中地al活性的抑制百分数和体 外渗杂DX-88(艾卡拉肤KCl-INH或DX-2930的血浆样品中地al活性的抑制。使用示例性离 体地al活化试验测量抑制百分数。误差棒表示平均数标准误差。
[0074] 图32是显示来自用不同剂量的DX-2930处理的人和猴子的血浆中地al活性的离体 抑制百分数的图。使用示例性离体PKal活化试验测量抑制百分数。虚线显示用SOnM DX-2930 观察的抑制百分数， SOnM 是匹配治疗有效水平的艾卡拉肤的 Cmax 的浓度。
[0075] 图33是显示来自DX-2930 1期研究的血浆样品中"pKal活性抑制％"的一系列图， 其相较于媒介对照组中的对应样品，比较了每天给药后对于每个给药组的平均抑制。误差 棒是标准误差。
[0076] 图34是显示来自FXIIa治疗之后DX-2930 Ia期受试者的蛋白质印迹数据的图。使 用受试者之间的标准偏差计算误差棒。组1受试者W〇.lmg/Kg给药，组2受试者W〇.3mg/Kg 给药，组3受试者W Img/Kg给药，和组4受试者W 3mg/Kg给药。
[0077] 图35显示在没有FXIIa治疗的情况下来自DX-2930 Ia期受试者的蛋白质印迹数 据。使用受试者之间的标准偏差计算误差棒。组1受试者WO. Img/Kg给药，组2受试者W 0.3mg/Kg给药，组3受试者W Img/Kg给药，和组4受试者W 3mg/Kg给药。
[007引发明详述
[0079] 本文描述了用于测量来自受试者的样品中与血浆激肤释放酶(pKal)系统相关的 生物标记，比如完整的高分子量激肤原化MWK)、切割的HMWK和/或地al活性的水平的试验。 在一些实施方式中，试验包括解育获得自受试者的样品与地al系统的活化剂和测量完整的 高分子量激肤原化MWK )，切割的HMWK，和/或地a 1活性的水平。运样的试验用于，例如，评估 受试者是否患有与地al相关的疾病或处在与地al相关的疾病的风险中，评估与地al相关的 疾病的治疗，和鉴定药物候选物物，例如，PKal调节剂比如地al抑制剂。运样的试验也用于， 例如，选择用于治疗，比如与地al相关的疾病的治疗的受试者。
[0080] 室义
[0081] ^方便，在进一步描述本公开之前，在运里定义在说明书、实施例和所附的权利 要求中采用的某些术语。其他术语当在说明书中出现时定义。
[0082] 单数形式"一个(a)"、" 一个(an)"和"所述"包括复数提及物，除非上下文明确相反 指出。
[0083] 如本文所使用，"获取(acquirer或"获取(acquiring)"指通过"直接获取"或"间 接获取"物理实体或值，而获得物理实体或值，例如，数值。"直接获取"意思是实施一种方法 (例如，如本文对该术语定义的对于样品或"分析样品"进行试验或测试），W获得物理实体 或值。"间接获取"指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第=方实验室)接收 物理实体或值。直接获取物理实体包括实施一种方法，例如，分析样品，包括物理物质例如， 开始材料的物理变化。示例性变化包括由两种或更多种开始材料制备物理实体，剪切或分 割物质，分离或纯化物质，将两种或更多种分开的实体组合成为混合物，进行包括断裂或形 成共价或非共价键的化学反应。直接获取值包括进行一种方法，其包括样品或另一物质的 物理变化，例如，进行包括物质，例如，样品、分析物或试剂的物理变化的分析方法(本文有 时称为"物理分析"），进行分析方法，例如，包括下述一种或多种的方法:分离或纯化物质， 例如，来自另一物质的分析物或其片段或其他衍生物;组合分析物，或其片段或其他衍生物 与另一物质，例如，缓冲液、溶剂或反应物;或改变分析物，或其片段或其他衍生物的结构， 例如，通过断裂或形成分析物的第一和第二原子之间的共价或非共价键;或通过改变试剂， 或其片段或其他衍生物的结构，例如，通过断裂或形成试剂的第一和第二原子之间的共价 或非共价键。
[0084] 如本文所使用，"分析"样品包括进行设及样品或另一物质，例如，开始材料的物理 变化的方法。示例性改变包括由两种或更多种开始材料制备物理实体，剪切或分割物质，分 离或纯化物质，将两个或更多个分开的实体组合成为混合物，进行包括断裂或形成共价或 非共价键的化学反应。分析样品可包括进行分析包括物质，例如，样品、分析物或试剂的物 理变化的方法(本文有时称为"物理分析"），进行分析方法，例如，包括下述的一种或多种的 方法:分离或纯化物质，例如，来自另一物质的分析物，或其片段或其他衍生物;组合分析 物，或其片段或其他衍生物与另一物质，例如，缓冲液、溶剂，或反应物;或改变分析物，或其 片段或其他衍生物的结构，例如，通过断裂或形成分析物的第一和第二原子之间的共价或 非共价键;或通过改变试剂，或其片段或其他衍生物的结构，例如，通过断裂或形成试剂的 第一和第二原子之间的共价或非共价键。
[0085] 如本文所使用的术语"激动剂"意思是指模拟或上调(例如，促进或补充)蛋白质的 生物活性的试剂。激动剂可W是野生型蛋白质或其具有野生型蛋白质的至少一种生物活性 的衍生物。激动剂也可W是提高蛋白质的至少一种生物活性的化合物。激动剂也可W是增 加多肤与另一分子，例如，祀肤或核酸之间相互作用的化合物。
[0086] 如本文使用的术语"括抗物"意思是指下调(例如，压制或抑制)蛋白质的至少一种 生物活性的试剂。括抗物可W是抑制或降低蛋白质和另一分子，例如，祀肤或酶底物之间相 互作用的化合物。括抗物也可W是降低或抑制存在的表达的蛋白质量的化合物。典型地，抑 制蛋白质或基因指降低蛋白质或基因的表达或相关活性至少10%或更多，例如，20%、 30%、40%、或50%、60%、70%、80%、90%或更多，或降低表达或相关活性是大于1倍、2倍、 3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多，如通过本文所述的或本领域知道的一种或多种方 法测量。
[0087] 如本文所使用，"结合亲和力"指表观缔合常数或KanKa是解离常数化d)的倒数。对 于具体的祀分子，结合蛋白的结合亲和力可W是，例如至少l〇 5、l〇6、l〇7、l〇8、l〇9、l〇w和 相对于第二祀标，结合蛋白对第一祀标的较高的亲和力结合可由比结合第二祀标 的Ka(或数值Kd)较高的结合第一祀标的Ka(或较小数值Kd)指示。在运样的情况下，相对于第 二祀标(例如，处于第二构象的相同蛋白质或其模拟物;或第二蛋白质），结合蛋白对于第一 祀标(例如，处于第一构象的蛋白质或其模拟物)具有特异性。结合亲和力（例如，对于特异 性或其他比较）的差异可 W是至少1.5、2、3、4、5、10、15、20、37.5、50、70、80、91、100、500、 1000 或 I 〇5 倍。
[0088] 结合亲和力可通过各种方法测定，包括平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表 面等离子共振或光谱学（例如，使用巧光试验）。用于评估结合亲和力的示例性条件是在 了尺15-缓冲液（5〇111]\111?15，15〇111]\1化(：1，5111]\1化(：12，抑7.5)中。运些技术可用于测量作为结 合蛋白（或祀标)浓度的函数的结合的和游离的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度 ([结合的])与游离的结合蛋白的浓度（[游离的])和祀标上的结合蛋白的结合位点的浓度 相关，其中，根据下述方程，（N)是每个祀标分子的结合位点的数量：
[0089] [结合的]=N ?[游离的]/((1/Ka) +[游离的])。
[0090] 但是，不必总是精确测量Ka,因为有时足W获得对亲和力的定量测量，例如使用比 如化ISA或FACS分析测定的，其与Ka成比例，因此可用于比较，比如确定较高的亲和力是否 是例如2倍高，W获得亲和力的定性测量，或获得对亲和力的推导，例如通过功能试验例如 体外或体内试验中的活性。
[0091] 术语"结合蛋白"指可与祀标分子相互作用的蛋白质。该术语与"配体"可互换使 用。"血浆激肤释放酶结合蛋白"指可与血浆激肤释放酶相互作用(例如，结合)的蛋白质，其 尤其包括优选或特异性与血浆激肤释放酶相互作用和/或抑制血浆激肤释放酶的蛋白质。 相比在相同条件且没有蛋白质的情况下血浆激肤释放酶的活性，如果蛋白质导致血浆激肤 释放酶的活性降低，则蛋白质抑制血浆激肤释放酶。在一些实施方式中，血浆激肤释放酶结 合蛋白是抗体。
[0092] 术语"捕获试剂"指特异性结合其配体的部分。
[0093] 如本文所使用，术语"复合物"或"复合物形成"指彼此具有特异性亲和力的成员之 间的复合物。
[0094] "保守氨基酸取代"是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的氨基 酸取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。运些家族包括具有下述的 氨基酸:碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不 带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酷胺、谷氨酷胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸）、 非极性侧链(例如，丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸），e-支链侧链(例如，苏氨酸、鄉氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色 氨酸、组氨酸）。
[00%]用于生物多聚体的基序序列可包括可W是不同氨基酸的位置。例如，符号"X"在运 样的上下文中一般指任何氨基酸(例如，二十种天然氨基酸的任何一种），除非另外指出，例 如，指任何非半脫氨酸氨基酸。其他允许的氨基酸也可例如，使用括号和斜线表示。例如， "(A/W/F/N/Q)"意思是丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酷胺和谷氨酷胺被允许在该特定位 置。
[0096] 如本文所使用，"检测试剂"指结合待检测部分的部分。通常其产生信号，例如，巧 光，或产生可测量的化合物。
[0097] "表位(邱itope)"指被结合蛋白（例如，抗体，比如Fab或全长抗体)结合的祀标化 合物上的位点。在祀标化合物是蛋白质的情况下，位点可全部由氨基酸组分组成、全部由蛋 白质的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)组成、或由其组合组成。重叠表位包括至少一个 共同的氨基酸残基、糖基基团、憐酸基团、硫酸基团或其他分子特征。
[0098] 如果第一结合蛋白结合第二结合蛋白结合的祀标化合物上的相同位点，或结合与 第二结合蛋白结合的位点重叠(例如，50 %、60 %、70 %、80 %、90 %，或100 %重叠，例如，就 氨基酸序列或其他分子特征(例如，糖基基团、憐酸基团或硫酸基团）而言）的位点，则第一 结合蛋白（例如，抗体)与第二结合蛋白（例如，抗体）"结合相同的表位"。
[0099] 如果第一结合蛋白与其表位的结合减少(例如，减少10 %、20%、30 %、40%、50 %、 60%、70%、80%、90%、100%或更多）结合其表位的第二结合蛋白的量，则第一结合蛋白 (例如，抗体)与第二结合蛋白（例如，抗体）"竞争结合"。竞争可W是直接的（例如，第一结合 蛋白结合与第二结合蛋白结合的表位相同或重叠的表位），或是间接的（例如，第一结合蛋 白与其表位的结合造成祀标化合物的空间改变，其降低了第二结合蛋白结合其表位的能 力）。
[0100] 如本文所使用，"功能的"生物学分子是W其中其特征在于展示性能和/或活性的 生物学分子。
[0101 ] 如下进行两个序列之间"同源性（homo Iogy )"或"序列同一性（sequence identity)"(术语在本文中可互换使用）的计算。为了最佳比较目的，比对序列（例如，缺口 可引入第一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中，W进行最佳比对，并且为了比较目的 可忽略非同源的序列）。使用具有Blossum 62评分矩阵的GCG软件包中的GAP程序确定最佳 比对为最佳分数，缺口罚分为12、缺口延伸罚分为4，和移码缺口罚分为5。然后，比较在相应 氨基酸位置或核巧酸位置处的氨基酸残基或核巧酸。当第一序列中的位置被与第二序列中 相应位置的氨基酸残基或核巧酸相同氨基酸残基或核巧酸占据时，则分子在该位置是相同 的（如本文使用的氨基酸或核酸"同一性"相当于氨基酸或核酸"同源性"）。两条序列之间的 同一性百分数是序列共有的相同位置的数量的函数。
[0102] 在优选的实施方式中，用于比较目的被比对的参考序列的长度是参考序列长度的 至少30 %，优选地至少40%，更优选地至少50%，甚至更优选地至少60%，和甚至更优选地 至少70%、80%、90%、92%、95%、97%、98%或100%。例如，参考序列可W是免疫球蛋白可 变结构域序列的长度。
[0103] 如本文所使用，术语"在低严格、中等严格、高度严格或非常高的严格条件下杂交" 描述杂交和洗涂的条件。进行杂交反应的指南可见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N. Y. (1989)，6.3.1-6.3.6。水性和非水性方法描述在该参考文 献中，并且都可被使用。本文提及的具体杂交条件如下：（1)低严格杂交条件，在6X氯化钢/ 巧樣酸钢(SSC)中，在约45°C，随后在0.2X SSC，0.1 %SDS中，至少50°C，两次洗涂(对于低严 格条件，洗涂的溫度可提高至55°C); (2)中等严格杂交条件，在6X SSC中，在约45°C，随后在 0.2X SSC，0.1%SDS中，在60°C，一次或多次洗涂；（3)高度严格杂交条件，在6X SSC中，在约 45°C，随后在0.2X SSC，0.1 % SDS中，在65°C，一次或多次洗涂;和(4)非常高的严格杂交条 件是0.5M憐酸钢，7 % SDS，在65 °C，随后在0.2X SSC，1 % SDS中，在65 °C，一次或多次洗涂。非 常高的严格条件(4)是优选的条件并且是应当使用的条件，除非另外指出。本公开包括W 低、中、高或非常高的严格性与本文所述的核酸或其补体，例如，编码本文所述的结合蛋白 的核酸，杂交的核酸。核酸可与参考核酸的长度相同或在参考核酸长度的30 %、20 %或10 % 内。核酸可对应编码本文所述的免疫球蛋白可变结构域序列的区域。
[0104] "分离的组合物"指从可获得分离的组合物的天然样品的至少一种组分的至少 90 %去除的组合物。如果感兴趣的种类或种类的群体按重量-重量计，是至少5 %、10 %、 25%、50%、75%、80%、90%、92%、95%、98%或99%纯的，则人工或天然产生的组合物可 W是"具有至少一定程度的纯度的组合物"。
[0105] 如本文所使用，术语"体外"指在人工环境中，例如，在试管或反应容器、细胞培养 物等中，而不是在多细胞生物体中发生的事件。
[0106] 如本文所使用，术语"体内"指在多细胞生物体比如人或非人动物中发生的事件。
[0107] "分离的组合物"指从可获得分离的组合物的天然样品的至少一种组分的至少 90 %去除的组合物。如果感兴趣的种类或种类的群体按重量-重量计，是至少5 %、10 %、 25%、50%、75%、80%、90%、92%、95%、98%或99%纯的，则人工或天然产生的组合物可 W是"具有至少一定程度的纯度的组合物"。
[0108] "分离的"蛋白质指从可获得分离的蛋白质的天然样品的至少一种组分的至少 90%的去除的蛋白质。如果感兴趣的种类或种类的群体按重量-重量计，是至少5%、10%、 25%、50%、75%、80%、90%、92%、95%、98%或99%纯的，则蛋白质可W是"具有至少"一 定程度的纯度。
[0109] 术语"激肤释放酶"（例如，血浆激肤释放酶)指肤酶(切割蛋白质中肤键的酶），丝 氨酸蛋白酶家族的亚组。血浆激肤释放酶切割的激肤原产生激肤，其是有力的促炎肤。
[0110] 术语"激肤释放酶抑制剂"指抑制激肤释放酶的任何试剂或分子。例如，DX-88(本 文也称为叩EP-r)血浆激肤释放酶的有效化KlnM)且特异性的抑制剂(NP_000883)。（也见 例如，WO 95/21601 或WO 2003/10:3475)。
[0111] 如本文使用的术语"DX-2922"与术语^ioi-Aor可交替使用。下面描述了该抗体 的其他变体。 rnii9i
[0113] 如本文使用的术语"DX-2930"与术语^124-G〇r可互换使用。下面描述了该抗体 的其他变体。
[0114]
[0115] 术语"调节剂"指可能够引起调节的多肤、核酸、大分子、复合物、分子、小分子、化 合物、物质等(天然存在的或非天然存在的），或由生物学材料比如细菌、植物、真菌或动物 细胞或组织制备的提取物。可通过包括在试验中评估调节剂作为功能性质、生物学活性或 过程，或其组合的抑制剂或活化剂谊接或间接)的潜在的活性(例如，激动剂、局部括抗物、 局部激动剂、反向激动剂、括抗物、抗微生物剂、微生物感染或增殖的抑制剂等）。在运样的 试验中，可同时筛选许多调节剂。调节剂的活性可W是已知的、未知的或部分已知的。
[0116] "非必需"氨基酸残基是可与结合试剂，例如，抗体的野生型序列不同而不消除或 更优选地基本上不改变生物活性的残基，而改变"必需"氨基酸残基导致活性的大量丢失。
[0117] 通过主体方法治疗的"患者"、"受试者"或"宿主"（运些术语交换使用）可意思是人 或非人动物。在一些实施方式中，受试者处在激肤释放酶介导的疾病的风险中或遭受激肤 释放酶介导的疾病，例如，缓激肤介导的疾病，例如，遗传性血管性水肿化AE)。在一些实施 方式中，受试者处在下述风险中或遭受下述:非组胺依赖性特发性血管性水肿、类风湿性关 节炎、克罗恩氏病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、脈毒性休克、烧伤、脑缺血性/再灌注损伤、脑 水肿、糖尿病视网膜病变、糖尿病型肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉或静脉血栓形成、与屯、 室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素诱导的血小板减少、血栓栓塞病、 和具有不稳定的屯、绞痛的冠屯、病、水肿、眼部疾病、痛风、肠道肠疾病、口腔黏膜炎、神经性 疼痛、炎症疼痛、椎管狭窄-退行性脊椎病、术后肠梗阻、大动脉动脉瘤、骨关节炎、遗传性血 管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或周围肿瘤脑水肿、脈毒、急性中脑动脉(MCA)缺血性事 件（中风）、再狭窄（例如，血管成形术之后）、系统性红斑狼疮肾炎、自身免疫性疾病、炎性疾 病、屯、血管疾病、神经疾病、蛋白质错折叠相关的疾病、血管生成相关的疾病、高血压肾病和 糖尿病型肾病、过敏和呼吸疾病(例如过敏、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病、急性呼吸窘迫综合 症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤）。
[0118] 术语"前激肤释放酶"和"血浆前激肤释放酶"在本文替换使用并且指活性血浆激 肤释放酶的酶原形式，其也称为前激肤释放酶。
[0119]术语"预防(preventing)"或"预防(prevent r受试者中的疾病指使受试者进行药 物治疗，例如，施用药物，使得预防疾病的至少一种症状，即，在有害病况(例如，宿主动物的 疾病或其他有害状况)的临床表现之前施用，从而预防宿主发展有害的病况。"预防"疾病也 可称为"预防"或"预防性治疗"。
[0120] 如本文所使用，术语"基本上同一的（substantially identical)"(或"基本上同 源的（substantially homologous)")在本文用于指第一氨基酸或核酸序列包含足够数量 的、与第二氨基酸或核酸序列相同或等同的（例如，具有类似的侧链，例如，保守的氨基酸取 代)氨基酸残基或核巧酸，W便第一和第二氨基酸或核酸序列具有(或编码的蛋白具有)类 似的活性，例如，结合活性，结合偏好或生物学活性。在抗体的情况下，第二抗体具有相同的 特异性，并且相对于相同的抗原具有至少50%，至少25%，或至少10%的亲和力。
[0121] 与本文公开的序列类似或同源的（例如，至少约85%序列同一性)的序列也是本申 请的一部分。在一些实施方式中，序列同一性可W是约85%、90%、91 %、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更高。
[0122] 另外，当核酸区段在选择性杂交条件(例如，高度严格杂交条件）下与链的补体杂 交时，存在实质上的同一性。核酸可存在于全细胞中、细胞裂解物中或W部分纯化或基本上 纯的形式。
[0123] 用于生物聚合物的基序序列可包括可W是不同氨基酸的位置。例如，符号"X"在运 样的上下文中一般指任何氨基酸(例如，二十种天然氨基酸的任何一种），除非另外指出，例 如，指任何非半脫氨酸氨基酸。其他允许的氨基酸可也例如，使用括号和斜线指示。例如， "(A/W/F/N/Q)"意思是允许丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、天冬酷胺和谷氨酷胺在该特定位置。
[0124] 统计学显著性可通过任何现有技术已知的方法确定。示例性统计学检验包括:学 生T检验、Mann Whitney U非参数检验，和Wilcoxon非参数统计学检验。一些统计学上显著 的关系的P值小于0.05或0.02。指示两种状态之间可区分的定性或定量的差异的术语，例如 "诱导"、"抑制"、"促泌V开高"、"增加"、"减少'等，可指两种状态之间的差异例如，统计学 上显著的差异。
[012引如本文所使用，"样品"，指包括来自受试者的组织，例如，血液、血浆或蛋白质的组 合物。样品包括取自受试者的初始未处理的样品W及随后处理的，例如，部分纯化或保藏的 形式。示例性样品包括血液、血浆、泪液或粘液。
[0126] 相对于未治疗的受试者，"治疗有效的剂量"优选地调整可测量的参数，例如，血浆 激肤释放酶活性，统计学上显著的程度或至少约20%，更优选地至少约40%，甚至更优选地 至少约60%，和仍更优选地至少约80%。化合物调整可测量的参数，例如，疾病相关的参数 的能力可在预测人疾病或病况效力的动物模型系统中评估。可选地，组合物的该性质可通 过检查化合物在体外调整参数的能力评估。
[0127] 在受试者中"治疗"疾病(或病况)或"治疗"患疾病的受试者指使受试者进行药物 治疗，例如，施用药物，使得疾病的至少一种症状治愈、缓解或减轻。
[0128] 术语"预防"受试者中的疾病指使受试者进行药物治疗，例如，施用药物，使得预防 疾病的至少一种症状，即，在有害病况(例如，宿主动物的疾病或其他有害状况)的临床表现 之前施用，从而预防宿主发展有害的病况。"预防"疾病也可称为"预防"或"预防性治疗"。
[0129] "预防性有效量"指W必要的剂量和时间段内有效实现期望的预防性结果的量。典 型地，因为在疾病之前或在早期阶段预防性剂量用于受试者，预防性有效量小于治疗有效 量。
[0130] 标题，包括字母或数值标题仅仅为了理解和阅读的方便，并且在没有明确相反表 示的情况下，不强调临时顺序或偏好的层次。
[01引]接触系统生物标记
[0132] 血浆激肤释放酶作为被称为前激肤释放酶的活性酶原循环，所述前激肤释放酶通 常结合其底物，高分子量激肤原化MWK)。响应刺激，FXII被活化成FXIIa JXIIa切割前激肤 释放酶而形成活性血浆激肤释放酶（图1)。约75-90%的循环的前激肤释放酶通过与HMK的 结构域6的非活性位点相互作用结合HMWK。游离的和结合HMWK的活性地al产生切割的HMWK 和缓激肤。血浆激肤释放酶活化的生物标记显示在表2中。生物标记的适用性可根据其在有 或没有HAE的急性发作的情况下的水平来表明。运些生物标记的水平也可在缓激肤介导的 水肿或地al活性介导的其他疾病发作期间改变。
[0133] 下面表2提供了可通过表2中和本文其他地方描述的方法评估的标记，W评估地al 或缓激肤介导的疾病的受试者。表2表示与地al或缓激肤介导的疾病相关的标记的水平改 变的方向。
[0。4] 用于生物标记的试验
[0135] 可使用本文所述的试验和/或本领域已知的试验评估本文公开的生物标记的水平 (例如，量），或本文公开的生物标记的水平的改变。可用于评估生物标记的水平的试验包 括，例如，免疫试验，例如，蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验化LISA)(例如，夹屯、ELISA)、放射 免疫分析、基于电化学发光的检测试验和相关的技术。也可使用基于质谱的方法。也可采用 依赖于显色底物的试验。
[0136] 在一些实施方式中，使用电化学发光检测试验或依赖于电化学发光和图案化阵列 技术（patterned array technology)组合的试验（例如，来自Meso Scale DiscoveiT(MSD) 的ECL或多阵列技术试验）。
[0137] (i)前激肤释放酶
[0138] 可使用用于前激肤释放酶的现有试验，例如，免疫试验，例如，前激肤释放酶 ELISA，评估前激肤释放酶水平。例如，前激肤释放酶ELIS试剂盒是商业上可获得自 ant化odiesonline.com(货号:ABIN858073)。结合前激肤释放酶的抗体是本领域已知的并 且可用于例如免疫试验用于检测前激肤释放酶。例如，已经产生了鼠单克隆抗人前激肤释 放酶抗体。见，例如，Veloso，D.等Blood，1987，70(4): 1053-62。羊抗人前激肤释放酶抗体商 业上可获得自GenWay Biotech,Inc. (GenWay ID:GWB-58AC79)。
[0139] 在实施方式中，测定样品的等分试样中地al的水平。然后，将样品的等分试样中的 所有的前激肤释放酶转化成地al并且测量地al的水平。从第二个水平减去第一个水平得到 前激肤释放酶的量。可通过酶活性确定水平。
[0140] (ii)活性血浆激肤释放酶
[0141] 可例如使用免疫试验检测活性血浆激肤释放酶(活性地al)。免疫试验可使用仅仅 结合活性血浆激肤释放酶的抗体，比如，例如，DX-2930或DX-2922。在实施方式中，试验依赖 于活性pKal结合捕获试剂，例如，激肤释放酶抑制剂，例如，序列与DX-88类似的多肤，例如， 与DX-88的差别不多于1、2或5个氨基酸残基的多肤，例如，EP IKAk2。
[0142] 在一个实施方式中，捕获试剂提供在底物上，接触样品，并且例如用抗地al抗体测 定结合捕获试剂的量。在实施方式中，样品的样品处理，例如，从一个容器转移至另一个容 器最小化，W便降低接触活化的水平。在实施方式中，捕获试剂放置在相同的设备中，例如， 收集容器中，例如血液收集管中，用于从受试者收集样品，例如，血液。
[0143] 也在本公开内的是用确定地al活性的离体活化试验（例如，基于微板的地al活性 试验），其可包括（i)提供来自受试者的血浆样品；（ii)在存在地al底物的情况下用地al系 统活化剂解育血浆样品，其中底物连接至能够在被地al切割之后释放可检测信号的标签； 和（iii)基于可检测信号的程度测量地al的活性。在一些实施例中，活化剂是因子FXIIa。在 一些实施例中，血浆样品与活化剂、PKal底物，和地a 1抑制剂候选物一起解育。方法可进一 步包括评估地al抑制剂候选物的活性，其中相对于在没有地al抑制剂候选物的情况下地al 活性的水平，在存在地al抑制剂候选物的情况下降低水平的地al活性表示抑制剂候选物是 有效的。
[0145]
[0146] 方法也可进一步包括评估受试者是否患有与地al相关的疾病或处在与地al相关 的疾病的风险中；其中与预定的值(例如，来自健康的受试者或健康的受试者群体的样品 (一个活多个）中地al活性的水平)相比升高水平的地al活性表示受试者患有该疾病或处在 该疾病的风险中。
[0147] 方法也可进一步包括评估治疗的效力，比如与PKal相关的疾病的治疗效力。多种 生物样品（例如，血浆样品）可获得自运样的患者:其患有地al相关的疾病比如HAE并且通过 治疗剂比如地a 1抑制剂在治疗之前、治疗过程期间，和/或在治疗之后被治疗。可使用本文 公开的任何试验方法测量那些生物样品中的地al活性或表示地al活性的生物标记的水平。 与治疗之前相比，下降水平的地al活性或下降水平的表示地al活性的一个或多个生物标记 或治疗期间下降水平的地al活性/生物标记，表示治疗是有效的。
[014 引（iii)a2M-pKal 复合物
[0149] 可例如使用免疫试验检测血浆激肤释放酶a2巨球蛋白复合物(a2M-地al复合物）。 例如，已经开发了夹屯、型的化ISA试验，如在实施例2中描述的。在Kaufman，N.等Blood, 1991,77( 12) :2660-2667和Wachtfogel，Y.T.等，1989,Blood,73:468-471 中也报道了定量 的夹屯屯LISA。化巧el，P.C.等，J Biol Chem, 1985,260(7) :4257-63)报道了固定酶试验。也 可使用显色底物试验，例如，使用chromogenicsubstrates. com可得到的显色底物S-2302并 且方案提供在 chromo 邑 enicsubstr 曰 tes. com/methods/chromo 邑 enic-substr 曰 tes_methods_ kallikrein-like.htm 中。
[0150] (iv)ClINH-pKal 复合物
[0151] 可例如使用免疫试验，例如化IS方法，例如实施例3中描述的方法，检测Cl INH-地al复合物。例如，可使用其中抗地al抗体(例如，小鼠HiAb 13G11)是捕获抗体和抗Cl INH的 抗体用作检测抗体的夹屯、化ISA，或其中抗ClINH的抗体用作捕获抗体和抗地al抗体(例如， 小鼠mAb 13G11)是检测抗体的夹屯屯LISA。抗ClINH的抗体是本领域已知的。例如，抗人Cl抑 制剂的鼠单克隆抗体可获得自ABBI0TEC(货号250122)。抗人Cl抑制剂的另一鼠单克隆抗体 (4612)可获得自91日1^日-日]11:化〇(11日3.(3〇111(产品化。-]^0136)。山羊抗人〔1抑制剂抗体可获 得自9111(161(货号4300)。用于检测(：11顯-91(曰1复合物的另一61^154夹屯、试验用在 Wachtfogel，Y. T.等，1989 ,Blood，73:468-471 中。
[0152] (V)完整的 HMWK
[0153] 完整的高分子量激肤原(HMWK)可例如使用凝血剂或免疫学方法，例如，放射免疫 分析测定（见，例如，Kerbiriou-Nabias,D.M.，化 J Haematol, 1984,56(2):2734-86)。针对 人HMWK轻链的单克隆抗体是已知的。见，例如，Reddigari，S.R.Maplan,A.P. ,Blood, 1999， 74: 695-702。也可使用用于依赖显色底物的HMWK的试验。见，例如，Scott，C.F.等化romb Res,1987,48(6):685-700;Gallimore，M.J.等!'虹omb Res，2004，114(2):91-96。
[0154] 编码HMWK的人基因是激肤原UKNGl)。转录KNGl并且可选地剪接形成编码HMWK或 低分子量激肤原(LMWK)的mRNA。下面提供了HMWK的示例性蛋白质序列：
[01 巧]〉gi|l56231037|ref I NP_001095886 . 1 I 激肤原-1 同种型 1 前体[智人] MKLmL化CSR化LSLT犯SQ沈EIDCND邸LFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYR口EATKTVGSDTFYSFKYE I 邸 GDCPVQSGKTWQDCEYKDMKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPWTAQYDCLGCVHPISTQSP DLEPIL畑GIQYFNNNT地SSLFML肥VKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCS邸NFL化TPDCKSLWNGDTGECTD NAYIDIQLRIASFSQNCDIYPGKDFVQPPTKICVGCP畑IPTNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKAR VQVVAGKKYFIDFVARETTCS 邸 S肥 ELTESCET 邸 LGQSLDCNAEVYVVP肥邸 IYPTVNCQPLGMISLMKRPPGF SPFRSSRIGE 化邸 TTVSPPHTSMAPAQD 邸畑 SGKEQGHTR 畑 DWG 肥 KQ 服 HNLG 服 HK 肥畑 QG 服册 RG 服 LG 服肥 QQ 服 LG 服 HKFKL 孤 DLE 册 GGHVLD 服 HKHK 服服服 K 服 NKGKKNGKHNGWKTEHLASSS 邸 STTPSAQTQ 邸TEGPTPIP化AKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPAPIQS孤DWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPG RPWKSVSEINPTTQMKESYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:5)
[0156] (Vi)切割的 HMWK
[0157] 本文也称为"切割的激肤原"的切割的高分子量激肤原(HMWK)可使用例如实施例1 中描述的方法，例如蛋白质印迹，来评估。可使用结合切割的HMWK的抗体，比如，例如，鼠mAb 克隆11H05。另外，可使用质谱评估切割的HMWK。评估切割的HMWK水平的免疫印迹技术是本 领域已知的。见，例如，Buhler R.等Blood Coagul Fib;rinolysis，1995,6(3):223-232。
[0158] 下面提供了切割的激肤原的重链和轻链的示例性序列。
[0159] 〉切割的激肤原-1重链
[0160] 犯SQ沈EIDCND邸LFKAVDAALKKYNSQNQSNNQFVLYRITEATKTVGSDT巧SFKYEI邸GDCPVQSGKTW孤CE YKDAAKAATGECTATVGKRSSTKFSVATQTCQITPAEGPVVTAQYDCLGCVHPISTQSPDLEPILRHGIQYFNNNTQ 服 SLFML 肥 VKRAQRQVVAGLNFRITYSIVQTNCS 邸 N 化化 TPDCKSLWNGDTGECTDNAYIDI 化 RIASFSQNCD IYPGKDFVQPPTKICVGCP畑"TNSPELEETLTHTITKLNAENNATFYFKIDNVKKARVQVVAGKKYFIDFVARET TCSKESW^TESCETKKLGQSLDCNAEVYVVPWEKKIYPTVNCQPLGMISLMK(SEQIDN0:6)
[0161] 〉切割的激肤原-1轻链
[0162] SSRIGEI 邸 ETTVSPPHTSMAPAQD 邸畑 SGKEQGHTR 畑 DWG 肥 KQ 服 HNL 細細 K 肥畑 QG 服册 RG 服 LG 服肥 QQ 服 LG 服 HKFKL 孤 DLE 册 GGHVLD 服 HK 服服服服 KHKNKGKKNGKHNGWKTEHLASS 沈 DSTTPSAQT 犯 KTE GPTPIPSLAKPGVTVTFSDFQDSDLIATMMPPISPAPIQS孤DWIPDIQIDPNGLSFNPISDFPDTTSPKCPGRPWK SVSEINPTTQMKESYYFDLTDGLS(SEQ ID NO:7)
[0163] 在一些实施方式中，本公开提供了离体活化方法。运样的方法可包括(i)解育获得 自受试者的血浆样品与血浆激肤释放酶(pKal)系统的活化剂(例如，因子FXIIa) ;(ii)测量 解育之前和之后血浆样品中完整的高分子量激肤原(HMWK)、切割的HMWK或二者的水平;和 (iii)确定活化之后样品中完整的HMWK的下降。在一些实施例中，通过蛋白质印迹分析，例 如，Simple WesteiWroteinSimpie"，蛋白质印迹分析，测量完整的HMWK和切割的HMWK的 水平。Simple Western?试验是本领域已知的（见，例如，Rustandi等ElectrophoresiS.2012 Sep ;33(17):2790-7 KSimple WesternTM产品也是商业上可用的（见，例如， Pro化in親Diple⑥，San化 Clara，CA)。
[0164] 如本文所描述的离体活化方法可用于评估地al抑制剂候选物在抑制血浆活化中 的活性。更具体而言，血浆样品可在存在地al抑制剂候选物的情况下与活化剂一起解育。如 果活化水平在存在抑制剂候选物的情况下下降，表示候选物有效抑制血浆活化。
[0165] 在其他实施方式中，本公开提供了测量内源性切割的HMWK的方法。运样的方法可 包括(i)提供来自受试者的血浆样品；和(ii)测量血浆样品中切割的HMK的水平。在一些实 施例中，通过Protein Simple蛋白质印迹分析测量切割的HMWK的水平。
[0166] 内源性切割的丽WK试验可用于鉴定患有与pKa 1系统相关的疾病或怀疑患有与 地al系统相关的疾病的受试者，例如，本文所述的那些。在一些实施例中，血浆样品获得自 患有与pKal系统相关的疾病或怀疑患有与地al系统相关的疾病的受试者。与来自健康受试 者的相比，如果受试者中的内源性切割的HMWK升高，则表示受试者患有或怀疑患有该疾病。
[0167] 可选地或另外，内源性切割的HMWK试验可用于评估与地al系统相关的疾病的治疗 效力。在该情况下，血浆样品获得自患有疾病的受试者并且通过地al抑制剂处理。与治疗之 前相比，如果治疗之后观察到下降的切割的HMWK的水平，表示地al抑制剂是有效的。
[0168] 作为进一步可选的或另外的，试验也可用于评估受试者是否患有与地al相关的疾 病或处在与地al相关的疾病的风险中；其中与预定的值(例如，来自健康的受试者或健康的 受试者群体的样品（一个活多个）中的切割的HMWK的水平)相比，升高的切割的HMWK的水平 表示受试者患有该疾病或处在该疾病的风险中。
[0169] 方法也可进一步包括评估治疗效力，比如与PKal相关的疾病的治疗的效力。可在 治疗之前、治疗过程期间和/或治疗之后，从患有地al相关的疾病比如HAE并且通过治疗剂 比如地al抑制剂治疗的患者获得多种生物样品（例如，血浆样品）。可使用本文公开的任何 试验方法测量那些生物样品中的完整的HMWK和/或切割的HMWK的水平。与治疗之前下降的 切割的HMWK的水平或在治疗期间下降的切割的HMWK的水平表示治疗是有效的。
[0170] 抗体
[0171] 提供的方法中使用抗体和抗原结合片段。在一些实施方式中，捕获试剂是或 包括抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，检测试剂是或包括抗体或抗原结合片段。在 一些实施方式中，治疗地al介导的或缓激肤介导的疾病的治疗性组合物是或包括抗体或抗 原结合片段。
[0172] 如本文所使用，术语"抗体"指包括至少一种免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白 可变结构域序列的蛋白质。例如，抗体可包括重化)链可变区（本文简称为VH)，和轻化)链可 变区（本文简称为化）。在另一实施例中，抗体包括两个重化)链可变区和两个轻化)链可变 区。术语"抗体"包括抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab和SFab片段、F(ab'）2、Fd片 段、Fv片段、scFv和结构域抗体(dAb)片段(de Wildt等，611'111111111111〇1.1996;26(3):629-39.)) W及完整的抗体。抗体可具有IgA、IgG、I巧、I曲、IgM( W及其亚型）的结构特征。抗体 可来自任何来源，但是灵长类(人和非人灵长类)和灵长类源化的是优选的。
[0173] VH和化区可进一步细分为称为"互补决定区"rCDR")的超可变性的区域，其与称 为"框架区"（"FR")的更保守的区域间插。已经精确限定了框架区和CDR的范围（见，Kabat, E.A.,等（1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition, U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,和 化〇1]11日，〔.等（1987)]\]\1〇1.8;[01.196:901-917,也见冊￥.11旨1119.1111'。.日。.1110。本文使用 Kabat定义。每个VH和化通常包括从氨基端至簇基端W下述顺序布置的S个CDR和四个FR: FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0174] 抗体的VH或化链可进一步包括所有的或一部分重链或轻链恒定区，从而分别形成 重或轻免疫球蛋白链。在一个实施方式中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋 白链的四聚物，其中重和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键相互连接。在IgG中，重链恒定区 包括S个免疫球蛋白结构域CHl、CH2和CH3。轻链恒定区包括化结构域。重链和轻链的可变 区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子，包 括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Cl q)的结合。免疫球 蛋白的轻链可W是K或A型。在一个实施方式中，抗体被糖基化。抗体可用于依赖抗体的细胞 毒性和/或补体介导的细胞毒性。
[0175] 抗体的一个或多个区域可W是人的或实际上是人的。例如，一个或多个可变区可 W是人的或实际上是人的。例如，一个或多个CDR可W是人的，例如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDRULC CDR2和LC CDR3。每个轻链CDR可W是人的。HC CDR3可W是人的。一个或 多个框架区可W是人的，例如，肥或LC的FRl、FR2、FR3和FR4。例如，Fc区域可W是人的。在一 个实施方式中，所有的框架区都是人的，例如，具有由人体细胞产生的抗体框架的序列，例 如，产生免疫球蛋白的造血细胞或非造血细胞。在一个实施方式中，人序列是生殖细胞系序 列，例如，由生殖细胞系核酸编码。在一个实施方式中，选择的Fab的框架(FR)残基可转化成 最类似灵长类生殖细胞系基因，尤其人生殖细胞系基因中相应残基的氨基酸类型。一个或 多个恒定区可W是人的或实际上是人的。例如，至少70、75、80、85、90、92、95、98或100%的 免疫球蛋白可变区、恒定区、恒定结构域(邸1、邸2、邸3、化1)，或整个抗体可^是人的或实 际上是人的。
[0176] 所有的或一部分抗体可由免疫球蛋白基因或其区段编码。示例性人免疫球蛋白基 因包括K、A、a(IgAl和IgA2)、丫（IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、S、巧化恒定区基因，W及许多免疫 球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白"轻链"（约25邸a或约214个氨基酸）由在NH2端的可变 区基因（约110个氨基酸)和在COOH-端的K或入恒定区基因编码。全长免疫球蛋白"重锥'（约 50邸a或约446个氨基酸)类似地由可变区基因（约116个氨基酸)和一个其他上述的恒定区 基因，例如，丫（编码约330个氨基酸)编码。人肥的长度不同，主要因为肥CDR3从约3个氨基 酸残基至超过35个氨基酸残基的变化。
[0177] 术语全长抗体的"抗原结合片段"指保持特异性结合感兴趣的祀标能力的全长抗 体的一个或多个片段。术语全长抗体的"抗原结合片段"中包括的结合片段的例子包括（i) Fab片段，其是由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；（ii)F(ab'）2片段，其是包括通过 在较链区的二硫键连接的两个化b片段的二价片段；（iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段； (iv)由抗体单臂的化和VH结构域组成的Fv片段，（v)dAb片段(Ward等，（1989)化Uire 341: 544-546)，其由VH结构域组成;和(Vi)保持功能的分离的互补决定区（CDR)。此外，尽管Fv片 段的两个结构域，和VH，由各自基因编码，但是它们可使用重组方法通过使得它们能够作 为单蛋白质链被制备的合成接头被接合，在所述单蛋白质链中，VL和VH区配对形成称为单 链Fv(ScFv)的单价分子。见例如，美国专利5,260,203、4,946,778和4,881，175;81'(1等 (1988)Science 242:423-426;和Huston等（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883。
[0178] 可使用任何适当的技术，包括本领域技术人员已知的常规的技术，获得抗体片段。 术语"单特异性抗体"指对特定的祀标，例如表位，显示单一结合特异性和亲和性的抗体。该 术语包括"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"，如本文所使用的，其指具有单分子组分的 抗体或其片段的制备物，无论抗体是如何产生的。
[0179] 如本文所使用，"人源化的"免疫球蛋白可变区指被修饰W包括足够数量的人框架 氨基酸位置，使得免疫球蛋白可变区不在正常人中引起免疫原性反应的免疫球蛋白可变 区/'人源化的"免疫球蛋白的描述包括，例如，美国6，407，213和美国5，693，762。
[0180] 抑制常数化i)提供了对抑制剂效力的测量;其是使酶活性降低一半所需要的抑制 剂的浓度，并且不依赖于酶或底物浓度。通过测量不同浓度的抑制剂(例如，抑制性结合蛋 白）对反应程度的抑制作用(例如，酶活性)获得在不同底物浓度的表观Ki化1, app );将作为抑 制剂浓度函数的准一级速率常数的变化拟合至莫里森(Morrison)方程(方程1)，产生对表 观Ki值的评估。Ki获得自从Ki，app与底物浓度的图的线性回归分析推出的y-截距。
[0181]
[0182]方程 I
[01 8引其中V =巧慢速率;VO =在没有抑制剂的情况下的速率;Ki, app =表观抑制常数；I = 总抑制剂浓度;和E =总酶浓度。
[0184] 遗传性血管性水肿(HAE)
[0185] 在一些实施方式中，与血浆激肤释放酶活性相关的疾病或病况是遗传性血管性水 月中化AE)。遗传性血管性水肿化AE)也称为"Quincke水肿"、Cl醋酶抑制剂缺陷、Cl抑制剂缺 陷和遗传性血管神经性水肿化A肥）"HAE的特征在于严重肿胀的复发性发作(血管性水肿）， 其可影响，例如，四肢、面部、生殖器、胃肠道和气管。HAE的症状包括，例如，臂、腿、嘴唇、目艮 睛、舌头和/或喉魄的肿胀;可设及喉魄肿胀和突然嘶哑的气管阻塞；没有明显原因的腹部 绞痛的重复发作；和/或肠道的肿胀，其可能是严重的并且可导致腹部绞痛、呕吐、脱水、腹 泻、疼痛和/或休克。患有该HAE的约S分之一的个体在发作期间显示称为边缘性红斑的非 痒皮疹。
[0186] 气管的肿胀可能是威胁生命的并且造成一些患者的死亡。估计死亡率是15-33%。 HAE每年导致约15，000-30，000次急诊室访问量。
[0187] 创伤或紧张，例如，牙科手术、疾病(例如，病毒性疾病比如感冒和流感）、月经和外 科手术可触发血管性水肿的发作。为了防止HAE的急性发作，患者可尝试避免先前造成发作 的特定刺激。但是，在许多情况下，在没有已知触发的情况下发生发作。典型地，HAE症状第 一次出现在童年并且在青春期加重。平均而言，未治疗的个体每1至2周发作，并且大部分发 作持续约3至4天（旨虹.111111.]1化.旨0￥/。〇]1(1；[1：；[0]1/116的(1；[1日巧-日叫；[06(161]1日）。发作的频率和 持续时间在患有遗传性血管性水肿的人中间，甚至在相同家族的人中间非常不同。
[018引有S种类型的HAE，称为I、II和III型。据评估，HAE影响1/50,000的人，I型占约 85%的病例，n型占约15%的病例，和III型非常稀少。III型是最近描述的形式并且最初认 为仅仅出现在女人中，但是已经鉴定出了受影响的男性的家族。
[0189] HAE是W常染色体显性模式遗传，使得受影响的人可从一个受影响的亲代继承突 变。也可出现基因的新突变，并且因此HAE也可出现在他们家族中没有该疾病历史的人中。 据评估，20-25 %的病例来自新的自发突变。
[0190] SERPING1基因的突变造成I型和II型遗传性血管性水肿。沈RPINGl基因提供了制 备对于控制炎症重要的Cl抑制剂蛋白质的指导。Cl抑制剂阻碍了促进炎症的某些蛋白质的 活性。引起遗传性血管性水肿I型的突变导致了血液中下降水平的Cl抑制剂。相反，引起II 型的突变使得产生功能异常的Cl抑制剂。在没有适当水平的功能Cl抑制剂的情况下，产生 过量的缓激肤。通过增加经过血管壁进入身体组织的流体的渗漏，缓激肤促进炎症。流体在 身体组织中的过多积聚引起患有I型和II型遗传性血管性水肿的个体中见到的肿胀的发 作。
[0191] F12基因中的突变与一些III型遗传性血管性水肿病例相关。F12基因提供了制备 凝固因子XII的指导。除了在血液凝结(凝聚）中起到关键作用，因子XII也是重要的炎症的 刺激剂并且参与缓激肤的产生。F12基因中的某些突变使得产生具有增加活性的因子XII。 结果，产生更多的缓激肤并且血管壁变得更加渗漏，其引起肿胀的发作。III型遗传性血管 性水肿的其他病例的原因仍是未知的。一个或多个仍未鉴定的基因的突变可造成运些病例 中的疾病。
[0192] HAE可与源自变态反应或其他医学病况的其他形式的血管性水肿类似地存在，但 是明显的不同是病因和治疗。当遗传性血管性水肿误诊为过敏时，其最通常用一般对HAE无 效的抗组胺剂、类固醇类和/或肾上腺素治疗，但是肾上腺素可用于威胁生命的反应。误诊 也已经导致患腹部肿胀的患者不必要的试探性外科手术，并且在一些HAE患者中腹部疼痛 已经被错误地诊断为身屯、失调。
[0193] Cl抑制剂疗法，W及用于HAE的其他疗法描述在Kaplan,A.P.，J Allergy Clin Immunol ,2010,126(5) :918-925中。
[0194] 提供HAE发作的应急治疗，W尽可能快速停止水肿的发展。来自供体血液静脉内施 用的Cl抑制剂浓缩物是一种应急治疗;但是，该治疗是在许多国家中不可用。在Cl抑制剂浓 缩物不可用的紧急情况下，新鲜冷冻的血浆(FFP)可用作替代物，因为其也包含Cl抑制剂。 [01M]自从1979年源自人血液的纯化的Cl抑制剂已经在欧洲使用。数个Cl抑制剂治疗现 可在美国使用并且两个Cl抑制剂产品现可在加拿大使用。己氏消毒的Berinert P(C化 Behring)于2009年被F.D.A.批准用于急性发作。纳米过滤的Cinryze(ViroI^arma)于2008 年被F.D.A.批准用于预防。加UCin(Pharming)是处在开发阶段的重组Cl抑制剂，其不具有 由于人血液传播的病原体的传染病传染的风险。
[0196] 急性HAE发作的治疗也可包括用于疼痛缓解的药物和/或IV流体。
[0197] 其他治疗形式可刺激Cl抑制剂的合成，或降低Cl抑制剂消耗。雄激素药物，比如达 那挫(danazol)，可通过刺激Cl抑制剂的产生而降低发作的频率和严重程度。
[0198] 幽口螺旋杆菌可触发腹部发作。治疗幽口螺杆菌的抗生素将减少腹部发作。
[0199] 更新的治疗攻击接触级联。艾卡拉肤化cal Iantide)(KALBITO民饭，DX-SS， Dyax)抑制血浆激肤释放酶并且已经在美国被批准。艾替班特（IcatibantKFIRAZYR?，： 化ire)抑制缓激肤B2受体，并且已经在欧洲和美国被批准。
[0200] HAE的诊断可依赖于，例如，家族历史和/或血液测试。与I、II和III型HAE相关的实 验室发现描述在，例如，Kaplan,A.P. J Allergy Clin Immunol,2010,126(5):918-925中。 在I型HAE中，如C4的水平，Cl抑制剂的水平下降，而Clq水平是正常的。在II型HAE中，Cl抑制 剂的水平是正常的或增加；但是，Cl抑制剂功能异常。C4水平下降和Clq水平是正常的。在 III型中，Cl抑制剂、C4和Clq的水平都可是正常的。
[0201] 可例如使用问卷，例如，通常由患者、临床医生或家庭成员完成的问卷，评估HAE的 症状。运样的问卷是本领域已知的并且包括，例如，视觉上模拟评分。见，例如，McMi 1 Ian， C. V.等化 teint. 2012; 5(2): 113-26。
[020。其他地al介导的或缓激肤介导的疾病
[0203]与血浆激肤释放酶活性相关的其他示例性疾病或病况包括非组胺依赖性特发性 血管性水肿、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、狼疮、阿尔茨海默氏疾病、脈毒性休克、烧伤、脑 缺血性/再灌注损伤、脑水肿、糖尿病视网膜病变、糖尿病型肾病、黄斑性水肿、血管炎、动脉 或静脉血栓形成、与屯、室辅助设备或支架相关的血栓形成、具有血栓形成的肝素诱导的血 小板减少、血栓栓塞病、和具有不稳定的屯、绞痛的冠屯、病、水肿、眼部疾病、痛风、肠道肠疾 病、口腔黏膜炎、神经性疼痛、炎症疼痛、椎管狭窄-退行性脊椎病、术后肠梗阻、大动脉动脉 瘤、骨关节炎、遗传性血管性水肿、肺栓塞、中风、头部创伤或周围肿瘤脑水肿、脈毒、急性中 脑动脉(MCA)缺血性事件（中风）、再狭窄（例如，血管成形术之后）、系统性红斑狼疮肾炎、自 身免疫性疾病、炎性疾病、屯、血管疾病、神经疾病、蛋白质错折叠相关的疾病、血管生成相关 的疾病、高血压肾病和糖尿病型肾病、过敏和呼吸疾病(例如过敏、哮喘、慢性阻塞性肺部疾 病、急性呼吸窘迫综合症、囊性纤维化、持续性鼻炎)和组织损伤(例如烧伤或化学损伤）。
[0204] 治疗
[0205] iipKal介导的或缓激肤介导的疾病的风险中或患有PKal介导的或缓激肤介导 的疾病的受试者，如使用比如本文所述的那些试验方法鉴定的受试者可用任何适当的治疗 剂治疗。在一些实施方式中，提供的方法包括基于提供的试验，例如，生物标记检测的结果 选择治疗受试者。
[0206] 在一些实施方式中，方法包括基于试验，例如，生物标记检测的结果选择或施用治 疗剂，例如，如本文所描述的激肤释放酶结合试剂，例如，如本文所描述的缓激肤B2受体括 抗物，例如，如本文所描述的Cl-INH替换试剂，用于施用至受试者之一或二者。
[0207] 在一些实施方式中，将血浆激肤释放酶结合蛋白或多肤施用至受试者。在一些实 施方式中，激肤释放酶结合试剂是激肤释放酶抑制剂，例如，肤、小分子抑制剂、激肤释放酶 抗体或其片段。在一些实施方式中，将缓激肤B2受体的括抗物施用至受试者。在一些实施方 式中，将Cl-INH替换治疗剂施用至受试者。
[0208] 治疗剂，例如，激肤释放酶抑制剂，例如，缓激肤B2受体括抗物，例如，Cl-INH替换 试剂，可与作为治疗与血浆激肤释放酶和/或缓激肤活性相关的疾病或病况的组合疗法的 一部分的另一疗法一起施用。可W多种不同的方式提供，例如，与一种或多种激肤释放酶抑 制剂、缓激肤B2受体括抗物或Cl-INH替换试剂，例如，与一种或多种激肤释放酶抑制剂、缓 激肤B2受体括抗物或Cl-INH替换试剂和另一疗法的组合疗法。第一试剂可在施用另一疗法 之前或之后施用。在一些情况下，同时或时间上非常接近(例如，注射之间的短时间间隔，比 如相同治疗周期之间）施用第一试剂和另一疗法(例如，治疗剂）。也可W W更大的时间间隔 施用第一试剂和其他疗法。
[0209] 血浆激肤释放酶结合试剂
[0210] 血浆激肤释放酶结合试剂(例如结合蛋白，例如多肤，例如抑制多肤，例如抗体，例 如抑制抗体，或其他结合试剂例如，小分子)是各种疾病和病况的有用治疗剂，例如，与血浆 激肤释放酶活性相关的疾病和病况的有用治疗剂。例如，在一些实施方式中，与血浆激肤释 放酶活性相关的疾病或病况是遗传性血管性水肿化AE)。在一些实施方式中，将血浆激肤释 放酶结合蛋白或多肤施用至处在地曰1介导的或缓激肤介导的疾病的风险中或遭受地曰1介 导的或缓激肤介导的疾病的受试者。
[0211] 许多有用的蛋白质激肤释放酶的抑制剂，组织和/或血浆激肤释放酶，包括Kunitz 结构域。如本文所使用，"Kunitz结构域"是具有至少51个氨基酸和包含至少两个，优选地= 个，二硫键的多肤结构域。折叠结构域使得第一和第六半脫氨酸，第二和第四，W及第=和 第五半脫氨酸形成二硫键(例如，在具有58个氨基酸的Kunitz结构域中，半脫氨酸可存在于 对应于氨基酸5、14、30、38、51和55的位置(根据下面提供的8?1'1同源序列的编号)处，并且 二硫键可在5和55、14和38W及30和51位之间形成），或者，如果存在两个二硫键，则它们可 在其相应半脫氨酸的亚组之间形成。根据下面提供的BPTI序列的编号，各个半脫氨酸之间 的间隔可在对应于5至55、14至38和30至51位置之间的下述间隔的7、5、4、3、2、1或0个氨基 酸内。BPTI序列可用作指示任何一般Kunitz结构域中特定位置的参考。感兴趣的Kunitz结 构域与BPTI的比较可通过鉴定其中比对的半脫氨酸数目最大化的最佳拟合比对进行。
[0212] BPTI的Kunitz结构域的3D结构（W高分辨率)是已知的。一种X射线结构W "6P1T' 保藏在化ooWiaven Protein Data Bank(&rooldiaven蛋白质数据）中。一些BPTI同系物的3D 结构化igenbrot等，（1990) Prote in Engineering ,3(7):591-598; Hynes等，（1990) BiochemistiT, 29:10018-10022)是已知的。至少81个Kunitz结构域序列是已知的。已知的 人同系物包括也称为组织因子通路抑制剂（TFPI)的LACI的S个Kun i tZ结构域(Wun等， (1988)J.Biol.Chem.263(13):6001-6004;Girard等，（1989)化Uire,338:518-20;Novotny 等，（1989) J.Biol.化 em. ,264(31 ):18832-18837)、Inter-a-膜蛋白酶抑制剂 APP-I 的两个 Kunitz结构域化ido等，（1988)J.Biol.畑em. ,263(:34): 18104-18107)、来自胶原蛋白的 Kunitz结构域、TFPI-2的S个Kunitz结构域（Sprecher等，（1994)PNAS USA,91:3353-3357)、1型肝细胞生长因子活性抑制剂的Kunitz结构域、2型肝细胞生长因子活性抑制剂的 Kunitz结构域、美国专利公开号2004-0152633中描述的Kunitz结构域。LACI是人血清憐糖 蛋白，分子量是39kDa(表1中的氨基酸序列），包含=个Kunitz结构域。
[0213] 表1:示例性天然Kunitz结构域
[0214]
[(
[0216] 上述Kunitz结构域称为LACI-Kl (残基50至 107)、LACI-K2(残基 121 至 178)和LACI-K3(213 至 270) oLACI 的 cDNA序列报道在 Wun 等（J. Biol.化 em. ,1988,263(13):6001-6004) 中。Girard等(化Uire ,1989,338:518-20)报道了突变研究，其中改变了S个Kunitz结构域 中每一个的Pl残基。当F. Vila与组织因子复合时LACI-Kl抑制因子VIIa(F. Vila),并且 LACI-K2抑制因子Xa。
[0217] 包含示例性Kunitz结构域的蛋白质包括下述，其中括弧中是SWISS-PR0T登录号： A4_HUMAN(P05067)、A4_MACFA(P53601)、A4_MACMU(P29216)、A4_M0USE(P12023)、A4_RAT (P08592)、A4_SAISC(Q95241)、AMBP_PLE化（P36992)、APP2J1UMAN(Q06481)、APP2_RAT (P15943)、AXP1_ANTAF(P81547)、AXP2_ANTAF(P81548)、BPT1_B0VIN(P00974)、BPT2_B0VIN (P04815)、CA17_HUMAN(Q02388)、CA36_CHICK(P15989)、CA36_HUMAN(P12111)、CRPT_B00MI (P81162)、ELAC_MACEU(062845)、ELAC_TRIVU(Q29143)、EPPI_HUMAN(095925)、EPPI_M抓沈 (Q9DA01)、HTIB_MANSE(P26227)、IBP_CARCR(P00993)、IBPC_B0VIN(P00976)、IBPI_TACTR (P16044)、IBPS_B0VIN(P00975)、ICS3_B0MM0(P07481)、IMAP_DR0FU(P11424)、IP52_ANESU (P10280)、ISC1_B0MM0(P10831)、ISC2_B0MM0(P10832)、ISH1_ST0肥（P31713)、I甜2-STO皿 (P81129)、ISIKJ1ELP0(P00994)、ISP2_GALME(P81906)、IVB1_BUNFA(P25660)、IVB1_WNMU (P00987)、IVB1_VIPAA(P00991)、IVB2_BUNMU(P00989)、IVB2-DA服U(P00990)、IVB2-HEMHA (P00985)、IVB2-NAJNI(P00986)、IVB3_VIPAA(P00992)、IVBB_DENP0(P00983)、IVBC-NAJNA 。19859)、1￥8(：_0?皿4。82966)、1￥邸_06肥0。00984)、1￥81_06酷則？00980)、1￥81_06肥0 (P00979)、IVBK_DENAN(P00982)、IVBK_DENP0(P00981)、IVBT_ERIMA(P24541)、IVBT-NAJNA (P20229)、MCPI_MKXP(P82968)、SBPI_SARBU(P26228)、SPT3_HUMAN(P49223)、T邸I-BOVIN (Q28201)、TKD1_細邸P(Q29428)、TXCA_DENAN(P81658)、UPTI_PIG(Q29100)、AMBP_B0VIN (P00978)、AMBP_HUMAN(P02760)、AMBP_ME抓N(Q62577)、AMBP_MESAU(Q60559)、AMBP_M抓沈 (Q07456)、AMBP_PIG(P04366)、AMBP_RAT(Q64240)、IATR_H0RSE(P04365)、IATR_ 細趾 P (P13371)、SPT1_HUMAN(043278)、SPT1_M 抓沈（Q9R097)、SPT2_HUMAN(043291)、SPT2_M 抓沈 (Q9mj〇3)、TFP2_HUMAN(P48307)、TFP2_M0USE(035536)、TFPI_HUMAN(P10646)、TFPI_MACMU (Q28864)、TFPI_M0USE(054819)、TFPI_RABIT(P19761)、TFPI_RAT(Q02445)、YN81_CA邸L (Q03610)
[0218] 各种方法可用于从序列数据库种鉴定Kunitz结构域。例如，Kunitz结构域的已知 的氨基酸序列、共有序列或基序（例如，ProSite基序）可从GenBank序列数据库（National Center for Biotechnology Information,National Institutes of Health(国立卫生石开 究院国家生物技术信息中屯、），Bethesda MD)，例如使用BLAST捜索;从HMM的Pfam数据库(隐 马尔可夫模型化idden Markov Models))(例如，使用Pfam捜索的默认参数)捜索；从SMART 数据库捜索；或从ProDom数据库捜索。例如，Pf am版本9的Pf am登录号PF00014提供了许多 Kunitz结构域和用于鉴定Kunitz结构域的HMM。关于Pf am数据库的描述可见于Sonhammer等 (1997)Proteins 28(3) :405-420和关于HMM的详细描述可见于，例如Gribskov等（1990) Meth.Enzymol.183:146-159;Gribskov等（1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4355-4358; Kro 曲等（1994)J. Mol. Biol. 235:1501-1531;和 Stultz 等（1993)Protein Sci ,2:305-314 中。HMM的SMART数据库（Simple Modular Architecture Research Tool(简单的模块构造 研究工具），EMBL，Heide化erg，DE)描述在Schultz等（1998)，Proc.化tl.Acad.Sci.USA 95: 5857和Schultz等（2000)Nucl.Acids Res 28:231 中。SMART数据库包含通过用HMMer2捜索 程序的隐马尔可夫模型分析(prof i ling)而鉴定的结构域(R. Durbin等（1998 )Biological sequence analysis !probabilistic models of proteins and nucleic acids .Cambridge University Press)。数据库也被注释和监测。ProDom蛋白质结构域数据 库由同源结构域的自动编译(automatic compilation)构成(Co巧et等（1999) ,Nucl .Acids Res. 27 : 263-267)。当前版本的ProDom使用SWISS-PROT 38和TREMBL蛋白质数据库的递归 PSI-BLAST 捜索（Altschul 等（1997 )Nucl. Acids Res. 25 :3389-:3402; Gouzy 等（1999) Computers and化emistry 23:333-340.)构建。数据库自动产生每个结构域的共有序列。 Prosite列举了作为基序的Kunitz结构域并且鉴定了包括Kunitz结构域的蛋白质。见，例 如，Piquet等Nucl .Acids Res. 30:235-238(2002)。
[0219] Kunitz结构域主要使用两个环区域（"结合环"）中的氨基酸与祀蛋白酶相互作用。 第一环区域在大约对应于BPTI的氨基酸13-20的残基之间。第二环区域在大约对应于BPTI 的氨基酸31-39的残基之间。Kunitz结构域的示例性文库在第一和/或第二环区域的一个或 多个氨基酸位置不同。当筛选与激肤释放酶相互作用的Kunitz结构域或当选择改善的亲和 性变体时，尤其有用的待改变的位置包括:相对于BPTI序列的13、15、16、17、18、19、31、32、 34和39位。预期至少运些位置中的一些紧密接触祀蛋白酶。改变其他位置也是有用的，所述 位置例如在=维结构中邻近上述位置的位置。
[0220] Kunitz结构域的"框架区"定义为是Kunitz结构域的一部分，但是尤其排除第一和 第二结合环区域中的残基的那些残基，即，大约对应于BPTI的氨基酸13-20和BPTI的氨基酸 31-39的残基。相反地，不在结合环中的残基可耐受较宽范围的氨基酸取代(例如，保守和/ 或非保守取代）。
[0221] 在一个实施方式中，运些Kunitz结构域是具有成环结构的变体形式，包括缔合人 脂蛋白的凝聚抑制剂(LACI)蛋白的Kunitz结构域ULACI包含S个界定清楚的内部肤环结 构，其是典型的Kunitz结构域(Girard,T.等，1989.化1:ure,338:518-520)。已经筛选、分离 了本文所述的LACI的Kunitz结构域1的变体，其W增强的亲和性和特异性结合激肤释放酶 (见，例如，美国专利号5,795,865和6,057,287)。运些方法可也用于其他Kunitz结构域框 架，W获得与激肤释放酶，例如，血浆激肤释放酶相互作用的其他Kunitz结构域。激肤释放 酶功能的有用调谐剂通常结合和/或抑制激肤释放酶，如使用激肤释放酶结合和抑制试验 测定的。
[0222] 在一些方面中，激肤释放酶结合试剂(例如结合蛋白，例如多肤，例如抑制多肤，例 如抗体，例如抑制抗体，或其他结合试剂，例如，小分子)结合活性形式的血浆激肤释放酶。 在一些实施方式中，激肤释放酶结合试剂，结合和抑制血浆激肤释放酶，例如，人血浆激肤 释放酶和/或鼠激肤释放酶。
[0223] 血浆激肤释放酶结合蛋白可W是全长(例如，IgG(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、 IgMJgA(例如，IgAl、IgA2)、I曲和IgE)或可仅仅包括抗原结合片段(例如，Fab、F(ab/ )2或 SCFv片段）。结合蛋白可包括两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白，或可W是单链抗 体。血浆激肤释放酶结合蛋白可W是重组蛋白质比如人源化的、CDR移植的、嵌合的、去免疫 化的或体外产生的抗体，并且可任选地包括源自人生殖细胞系免疫球蛋白序列的恒定区。 在一个实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白是单克隆抗体。
[0224] 在一些实施方式中，激肤释放酶结合蛋白结合和抑制血浆激肤释放酶，例如，人血 浆激肤释放酶和/或鼠激肤释放酶。示例性血浆激肤释放酶结合蛋白公开在美国公开号 20120201756中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，激肤释放酶结合蛋白 是具有选自下述抗体的轻和/或重链的抗体（例如，人抗体）：1162-404、1160-612、1142-册8、X63-G06、X101-A01 (本文也称为0乂-2922)^81-801^67-003^67-604^81-801、乂67-D03、X67-G04、X115-B07、X115-D05、X115-E09、X115-W6、X115-A03、X115-D01、X115-F02、 X124-G01 (本文也称为 0乂-2930)^115-604、]?29-009、]\1145-011、]\?)6-009和]\〇5-604。在一些 实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白竞争或结合与下述相同的表位:1162-404、1160-612、]?142-册8^63-606^101-401(本文也称为0乂-2922)^81-801^67-003^67-604^81-B01、X67-D03、X67-G04、X115-B07、X115-D05、X115-E09、X115-H06、X115-A03、X115-D01、 乂115斗02^124-601(本文也称为0乂-2930)^115-604、]?29-009、]\1145-011、]\106-009和]\〇5-G04。在一些实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白是DX-2930。见US 20110200611和US 20120201756,其通过引用并入本文。
[0225] 在一些方面中，激肤释放酶结合多肤(例如，抑制多肤)结合活性形式的血浆激肤 释放酶。示例性多肤血浆激肤释放酶试剂公开在美国专利号5,795,865、美国专利号5,994， 125、美国专利号6,057,287、美国专利号6,333,402、美国专利号7,628,983和美国专利号8， 283,321、美国专利号7,064,107、美国专利号7,276,480、美国专利号7,851，442、美国专利 号8,124,586、美国专利号7,811，991和美国公开号20110086801中，其每一篇的全部内容通 过引用并入本文。在一些实施方式中，激肤释放酶结合多肤是DX-88(非天然存在的激肤释 放酶抑制剂，也称为KALBITO民K (艾卡拉肤），SEQ ID N0:3)。在一些实施方式中，激肤释 放酶抑制剂包括SEQ ID N0:3的氨基酸3-60的约58个氨基酸序列或由SEQ ID N0:3的氨基 酸3-60的约58个氨基酸序列组成或具有SEQ ID NO:3的60个氨基酸序列的DX-88多肤。 [02%] Glu Ala Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Arg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Hir Arg Asp(沈Q ID NO:3)
[0227] 在一些实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白是EPIKAk2(SEQ ID NO:4)，其是非 天然存在的激肤释放酶抑制剂，具有58个残基氨基酸序列(对应SEQ ID N0:3的3-60残基） 并且在残基34具有116至56'的氨基酸取代和在残基396111至617的氨基酸取代。6?11(41^-2的 序列显示在下方：
[02巧]化化al2:Met His Ser Phe 切S Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro 切S A;rg Ala Ala His Pro Arg Trp Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys T虹 Arg Asp(SEQ ID NO:4)
[0229]在一些实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白可具有与本文所述的结合蛋白约 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。在一 些实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白可具有与本文所述的结合蛋白在HC和/或LC框架 区（例如，HC和/或LC FR 1、2、3和/或4)约85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97 %、98%、99%或更高的序列同一性。在一些实施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白可具 有与本文所述的结合蛋白在HC和/或LC CDR(例如，HC和/或LC CDR1、2、和/或3)约85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的序列同一性。在一些实 施方式中，血浆激肤释放酶结合蛋白可具有与本文所述的结合蛋白在恒定区（例如，CH1、 CH2、CH 巧 P/或 CL1)约 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更 高的序列同一性。
[0230] 在一些方面中，小分子结合活性形式的血浆激肤释放酶。
[0231] 缓激肤B2受体括抗物
[0232] 在一些实施方式中，将缓激肤B2受体括抗物施用至受试者。示例性缓激肤B2受体 括抗物包括Incatibant(Firazyr饭），其是阻碍天然缓激肤与缓激肤B2受体结合、包含10个 氨基酸的拟肤药物。
[0233] Cl-INH替换试剂
[0234] 在一些实施方式中，将替换Cl-IN讯式剂施用至受试者。示例性Cl-INH替换试剂是 公众可得的并且包括，例如，BeHnert饭，其是纯化的人己氏消毒的纳米过滤的Cl-IN田农缩 物。 实施例
[0235] 实施例1:切割的激肤原
[0236] 基于接触系统的分析，切割的激肤原是用于测量接触系统活化的适当的生物标 记。切割的激肤原先前已经显示在HAE发作期间升高，在肝硬化中），并且因此在脈毒期间接 触系统活化。针对切割的激肤原结合完整的激肤原上的消耗，淘洗抗体隧菌体展示库。用切 割的激肤原和从杂交瘤细胞系获得的单克隆抗体免疫平行小鼠。两种努力提供了结合切割 的和完整的激肤原的许多不同的单克隆抗体，但是没有仅仅结合切割的激肤原的抗体。
[0237] 为了适合蛋白质印迹试验，筛选了许多抗体并且数个鉴定为有效，包括图2显示的 鼠mAb(克隆11册5)。显然，该试验能够检测人血浆样品中切割的激肤原。此外，图帥的数据 确认玻璃中的血浆收集足够预防接触活化和激肤原切割。
[0238] 基于质谱的方法也可用于检测患者血浆中的切割的激肤原。在该方法中，一种免 疫吸附来自患者样品的激肤原，蛋白水解消化洗脱的激肤原并且通过LC-MC分析肤片段。
[0239] 实施例2:用于(：11畑-地曰巧日日21可1(曰1的免疫试验
[0240] 已经开发了基于化ISA的免疫试验，用于检测运些复合物。夹屯、型化ISA试验与先 前描述的类似，见，例如，Kaufman等，Blood 77，2660-2667，和Wachtfogel ,Blood 73，468-471。
[0241] 实施例 3:ClINH-pKal 试验
[0242] 已经开发了用于检测ClINH-地al复合物的化ISA。该夹屯、试验使用抗地a巧日ClINH 的抗体作为捕获试剂或检测试剂。开发该试验的第一步是制备ClINH-地al复合物。通过解 育相对ClIN肥-4倍摩尔过量的地al制备该共价复合物。然后使用阳离子交换色谱(Capto S 树脂)纯化复合物，如图3中显示。使用在280nm下计算的摩尔消光系数（121，740M-icnri)量 化复合物。使用类似的试验测量ClINH-pKal的之前报道未报告消光系数。浓度的精确测定 对于确定指示药物给药的疾病期间多少地al被活化的试验是关键的。
[0243] 研究了通过ELISA检测Cl INH-地al的两个试验形式。第一形式使用抗地al抗体(小 鼠mAb 13G11)作为捕获试剂和抗Cl INH的抗体作为用HRP-标记的二抗产生信号之后的检测 抗体（图4)。该试验在个位数纳摩尔范围或之下具有定量的下限。也研究了另一试验形式， 其中抗ClINH是捕获抗体并且抗地al(13Gll)是检测抗体（图5)。该试验形式具有类似的定 量下限。两个试验形式为ClINH-pKa巧日a2M-pKal的多重试验提供了另外的选择。
[0244] 实施例4:a2M-pKal复合物试验
[0245] 为检测a2M-pKal复合物开发了化ISA。该夹屯、试验使用抗地al和a2M的抗体作为捕 获试剂或检测试剂。开发该试验的第一步是制备02M-地al复合物。通过解育相对于a2M 2-4 倍摩尔过量的地al制备该共价复合物。然后使用尺寸排阻色谱纯化复合物，如图6中显示。a 2M包括作为低聚物至四聚物分布存在的~180W)a亚单位。当与地al相互作用时，a2M的每个 单体倾向于经水解a2M中的硫醋键通过地al上赖氨酸胺，而形成共价酷胺键。从而，可预期 交联物质的分布，其使定量复杂化。衍生了一种方法，W通过测量复合物的活性并且使用标 准曲线转化成浓度来量化a2M-pKal复合物（图7)。该定量方法是可能的，因为在文献中熟知 a2M与祀蛋白酶的共价复合物不阻碍对小的合成肤底物的活性位点。
[0246] 就ClINH-pKal试验而言，通过化154研究了用于检测日21-91(日1的两个试验形式。第 一形式使用抗地al抗体(小鼠mAb 13G11)作为捕获试剂和用HRP-标记的二抗产生信号之后 抗的抗体作为检测抗体（图8)。该试验形式在个位数纳摩尔范围或之下具有定量的下 限。也研究了另一试验形式，其中抗02M是捕获抗体和抗地al(13Gll)是检测抗体（图9)。该 试验形式具有类似的定量下限。两个试验形式提供了我们观察ClINH-地al和a2M-地al的多 重试验的另外的选择。
[0247] 实施例5:检测活化的血浆中的a2M-pKa巧日ClINH-pKal。
[0248] ELISA用于检测W已知的诱导接触活化的试剂比如高岭±或硫酸葡聚糖处理的正 常人血浆中的地al活化。如图10中显示，试验可检测在用硫酸葡聚糖体外活化之后在血浆 中形成的复合物。
[0249] 实施例6:完整的和切割的激肤原
[0250] 蛋白质印迹用于显示来自患者在发作期间获得的血浆和在包含抗蛋白酶混合物 的巧樣酸盐化的血浆管中收集的血浆展示减少量的完整的激肤原（即，1-链）（图11)。观察 到切割的激肤原（即，2链)的增加(数据未显示）。
[0251 ]实施例7:示例性试验和试验数据
[0252] (i)HMWK 离体活化
[0253] HMWK离体活化试验可用于评估候选地al抑制剂对接触活化的抑制活性。简言之， FXIIa(例如，5nM)用于刺激正常人血浆中的接触系统活化或刺激HAE发作样品W降低1-链 HMWK的水平约10-50%，其可W通过Simple Western(SB皿)或蛋白质印迹(TGA)检测。在DX-2930处理的样品中观察到减少的接触活化。
[0254] 如图17中显示，在本文所述的HMWK离体活化试验中，使用Protein SimpleWestern 或传统的蛋白质印迹分析检测最小水平的DX-2930 (例如，9-27nM)的抑制活性。在该研究中 使用的试验条件可检测5%血浆中9-27nM DX-2930的活性。也见下面表2:
[0巧5] 表2:通过DX-2930血浆活化的减少
[0 巧 6]
[0257]用DX-2930滴定因子XIIa活化的血浆的原始数据提供在图18中。也见下面表3:
[025引表3:通过各种浓度的DX-2930的血浆活化减少
[0 巧9]
[0260] 在通过FXIIa活化30分钟之后，在各种人清洁血浆样品中检测1-链HMWK的减少。结 果显示在图22-26中。也见下面表4-8:
[0261] 表4:在清洁血浆样品BRH745047中，在30分钟作用之后，1-链HMWK的减少％ 「0%21
Luzoo」 巧0:化渭巧皿聚巧而BKHY仙U04中，化；JU分W化用之旧，i-粧HMWK的㈱少％ 「nOAAl 观圏27甲显不，巧于Xi ia巧化便得皿浆样扣甲I-强刑重依颗性万巧的臧 少。
[0272] (ii)内源性切割的激肤原
[0273] 在该试验中，通过Simple Western(SBHD)和蛋白质印迹(TGA)分析SCAT管血浆，W 确定血浆样品中切割的激肤原的水平。与正常人血浆相比，发现切割的HMWK在基础和发作 HAE样品中升高。预期切割的HMWK在DX-2930治疗的HAE患者中，W及DX-2930治疗的健康的 志愿者中将减少。
[0274] 如图28中显示，发现在基础HAE患者样品中2-链HMWK (切割的HMWK)的水平低于患 有HAE发作的患者中的。预期DX-2930治疗的患者中的切割的HMWK水平与正常患者的类似。 [0 2巧]图29显示基础和HAE发作患者中的切割的HMWK的水平，如通过Protein Simple蛋 白质印迹分析和传统的蛋白质印迹分析测定的。
[0276] 检测四个个体中的内源性切割的HMWK。结果显示在图30中。在用巧樣酸盐收集的 正常人血浆样品中出现少量的切割的HMWK。
[0277] (i i i)测量地al活性的离体试验
[0278] 开发该基于酶的试验，W评估正常人血浆或模拟的HAE发作样品中接触系统活化 (目的是1-链HMWK减少10-50% )，并且评估pKal抑制剂对接触系统活化的抑制活性。在DX-2930治疗的受试者中观察到减少的接触活化。该试验用于评估地al抑制剂比如DX-2930在 治疗的受试者(例如，猴子或人患者）中的生物活性。
[0279] 该试验的实施例阐释在图12中。简言之，将血浆样品放置在96孔微板中。将示例性 地al抑制剂Dx-2930,示例性接触系统活化剂FXIIa添加至血浆样品。将混合物在存在地al 标记的肤底物的情况下在冰上解育适当的时间段(例如，2分钟），并且将玉米膜蛋白酶抑制 剂(CTI)添加至混合物W停止活化反应。如果必要稀释混合物并且通过测量巧光肤底物的 水平测定蛋白水解的活性。
[0280] 如图12中显示，DX-2930治疗的猴子显示减少水平的接触活化(下降的地al活性）。
[0281] (iv)用于确定切割的HMWK的蛋白质印迹试验
[0282] 经可设及LiCor检测的蛋白质印迹试验测量切割的HMWK的水平。也见下面实施例 8。必要时，巧樣酸盐或抗蛋白酶混合物用作该试验中的抗凝血剂。与正常血浆相比，在HAE 样品中观察到升高的切割的HMWK。该试验用于评估地al抑制剂，比如DX-2930在治疗的受试 者(例如，猴子或人患者）中的生物活性。
[0283] 使用具有LiCor检测的蛋白质印迹试验检测在抗蛋白酶抑制剂混合物中从HAE患 者中收集的血浆样品并且结果显示在图14中。如图15中显示，如先前报道，完整的激肤原从 10% (具有LiCor检测的蛋白质印迹试验)下降至50% "DX-2930治疗的食蟹猴显示W剂量依 赖性方式下降水平的地al活化(通过高岭±或硫酸葡聚糖）。图16。也见下面表9:
[0284] 表9:通过DX-2930的切割的HMWK的减少 [02851
[0;
[0287] 通过本文所述的蛋白质印迹试验测定图19中显示的30-分钟活化之后各种血浆样 品中的人HMWK。将还原的样品煮沸5分钟，然后添加至凝胶。将样品稀释20倍并且在4-12% Bi S-化is凝胶上150v下运行90分钟。使用iBlot将凝胶上的蛋白质转移至膜7分钟。使用小 鼠抗人激肤原（1:1，〇〇〇稀释）。印迹暴露时间是5秒。
[0288] 检测血浆活化时，比较Protein SimpleWestern与传统的蛋白质印迹试验。如图20 和21中显示，前者(右图）比后者(左图）更灵敏。
[0289] 实施例8.作为生物标记的地al的离体活化
[0290] 前激肤释放酶的离体活化成血浆中的血浆激肤释放酶（pKal)可用作例如药效 (PD)生物标记，W提供地al的治疗性抑制剂，比如DX-2930的生物活性的证据，和用于检测 疾病样品中的活化的地曰1。
[0291] 在第一实验中，获得来自W单次SC注射DX-2930(5mg/kg)给药的食蟹猴的血浆并 且用IOnM FXIIa活化，W产生活性地al，其使用合成底物(Pro-Phe-Arg-AMC)监测。添加玉 米膜蛋白酶抑制剂，W停止FXIIa活化，然后添加底物。在来自给药的食蟹猴样品中血浆中 观察到的抑制百分数与渗杂摩尔当量的DX-2930或艾卡拉肤制备的血浆样品的相符（图 31)。显然，DX-2930的血浆浓度达到抑制约80%通过离体添加FXIIa产生的地al活性的药物 水平（~265nM)。图31也显示用等量浓度的艾卡拉肤观察到等量的地al抑制。相反，等量浓 度的Cl-INH添加至血浆不抑制通过FXIIa在该离体活化试验中活化的地al。
[0292] 在第二实验中，血浆获得自给药五周SC注射不同剂量DX-2930的食蟹猴并且巧樣 酸盐化的血浆获得自Ia期临床研究中W不同剂量接受单次SC注射的DX-2930的人(n = 6)。 用FXIIa活化血浆样品，并且使用合成底物(Pro-Phe-Arg-AMC)测量所得地al活性。添加玉 米膜蛋白酶抑制剂，W停止FXIIa活化，然后添加底物。使用来自每个个体的给药前血浆样 品中存在的地al活性作为基线测定抑制百分数。图32显示人和猴血浆样品中抑制百分数随 着DX-2930的剂量增加而增加。
[0293] 来自运些两个实验的结果显示离体活化试验作为PKal的治疗性抑制剂的生物活 性的PD生物标记是有用的。
[0巧4] 实施例9.DX-2930 IA期研究血浆样品中地al活性的离体抑制
[02M] 在该研究中，研究了在源于用DX-2930皮下施用的人受试者的血浆中的DX-2930的 离体抑制活性(生物活性）。
[0296] 材料
[0巧7] . DX-2930(106.7mg/ml = 732iiM)
[0巧引 ?人FXIIa-邸L HFXIIa 2790P(1.72mg/ml = 25.3iiM)
[0巧9] ?玉米膜蛋白酶抑制剂(CTI)-邸L CTI 360(1.54mg/ml = 123iiM)
[0300] ?肤底物=PFR-AMC，Sigma Cat#99273，Lot 037K1207。
[0301] ?试验缓冲液= 20mM Tris pH 7.5,150mM NaCiamM EDTA，0.1 %Triton X-IOO， 0.1% PEG-8000
[0302] ? Corning 96孔白色聚苯乙締微板Cat#3789
[0303] ? Spectramax M2读板器
[0304] ?在DX-2930 IA期研究中收集的巧樣酸盐化的血浆
[0305] 遞
[0306] 在室溫下通过添加IOnM FXIIa活化1:40稀释的血浆2分钟。然后通过添加IOOnM CTI巧灭FXIIa,并且然后通过进一步1:10稀释样品血浆和添加IOiiM巧光肤底物PFR-AMC评 估血浆激肤释放酶(PKal)的蛋白水解的活性。各个血浆样品报道为地al活性的比例，其基 于对于每个个体的给药前对照转化成"抑制％"。
[0307] ^
[0308] 在DX-2930 Ia期研究中巧樣酸盐化的血浆样品获得自健康的受试者并且使用血 浆离体生物活性试验分析。在给药组3(1 .Omg/kg DX-2930)和4(3.Omg/kg DX-2930)中观察 到地al活性的显著抑制，分别实现地al活性约19%和36%最大抑制（图33)。在组3和4中实 现的抑制是持续的并且与约20天的表观半衰期一致。给药组1(0.1 mg/kg DX-2930)和2 (0.3mg/kg DX-2930)中的地al活性的抑制不显著。
[0309] 运些结果进一步表明离体活化试验用作地al的治疗性抑制剂的生物活性的PD生 物标记是有用的。
[0310] 实施例10.分析来自蛋白质印迹试验的Ia期研究样品中的DX-2930生物活性
[0311] 使用本文所述的蛋白质印迹试验研究DX-2930在用DX-2930治疗的人受试者的血 浆中的生物活性。
[0312] 使用在给药DX-2930或安慰剂之后第1天(在DX-2930或安慰剂给药之前）、第5天或 第28天获得自受试者的巧樣酸盐化的血浆样品进行蛋白质印迹试验。通过蛋白质印迹使用 检测高分子量激肤原化MWK)--其是被DX-2930抑制的祀酶的活性血浆激肤释放酶的底 物一一的抗体分析样品。血浆激肤释放酶作用于HMWK，W产生促炎肤缓激肤和2链，其被称 为被蛋白质印迹分析检测的切割形式的HMK。分析未处理的血浆样品和用活化的凝固因子 XIIa(FXIIa)处理的血浆样品。FXIIa将血浆中无活性的前激肤释放酶转化成活化的非血浆 激肤释放酶。
[0313]获得自该研究的结果显示与来自运些受试者的给药前样品相比，来自给药3mg/Kg DX-2930的受试者的FXIIa处理的样品（组4)在第5天(p = 0.0011)和在第28天(p = 0.0028) 展示统计学上更低的2-链HMWK(切割的HMWK)百分数。运是DX-2930针对其内源底物(HMWK) 的血浆激肤释放酶介导的蛋白水解的生物活性的证据（图34)。组4中观察到的2-链HMWK百 分数的减少倾向于比在其他给药组或安慰剂处理的组中观察到的更低。
[0314] 此外，来自给药0.3、1或3mg/Kg的DX-2930的未用FXIIa处理的受试者的样品显示 比在安慰剂或O.lmg/Kg剂量组中观察到的更低百分数的2-链HMWK(图35)。
[0315] 总之，运些结果进一步表明蛋白质印迹试验用作地al的治疗性抑制剂的生物活性 的PD生物标记是有用的。
[0316] 等同原则和范围
[0317] 仅仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到，或能够确认，本文所述的公开的具 体实施方式的许多等同方式。本公开的范围不旨在限于上面所描述的，而是如所附的权利 要求中阐释。
[0318] 在权利要求中，冠词比如"一个(a)"、" 一个(an)"和"所述(the)"可意为是一个或 多个，除非相反指出或从上下文其他是明显得出。如果一个、大于一个或所有的组成员出现 于、应用于或W其他方式与给定产物或方法相关，则认为权利要求或说明书满足在组的一 个或多个成员之间包括"或"，除非有相反指出或从上下文另外显而易见。本公开包括了运 样的实施方式:其中组的一个确定的成员出现于、应用于或W其他方式与给出产物或方法 相关。本公开包括运样的实施方式:其中大于一个或所有的组成员出现于、应用于或W其他 方式与给定产物或方法相关。
[0319] 此外，本公开包括所有运样的变型、组合和排列:其中来自一个或多个列举的权利 要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语被引入另一权利要求中。例如，从属于另 一权利要求的任何权利要求可被修饰，W包括在从属于相同基础权利要求的任何其他权利 要求中出现的一个或多个限制。在要素作为清单出现的情况下，例如，W马库什组形式，也 公开了要素的各个子组，并且可从组中去除任何要素(一种或多种）。一般而言，应理解，在 本公开或本公开的方面被指包括具体的要素和/或特征的情况下，本公开的某些实施方式 或本公开的方面由或基本上由运样的要素和/或特征组成。为了简化的目的，那些实施方式 未在本文中明确阐释。也注意到，术语"包括"和"包含"旨在是开放式的，并且允许囊括其他 要素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指出或另外从上下文显而易 见，本领域普通技术人员理解，表达为范围的值可认为为本公开的不同实施方式中该叙述 范围内的任何具体的值或子范围，至该范围下限的十分之一界限，除非上下文明确相反指 出。
[0320] 本申请引用各种公布的专利、公开的专利申请、期刊文献和其他出版物，其所有均 通过引用并入本文。如果在任何并入的参考文献和本说明之间存在冲突，W本说明书为准。 另外，落入现有技术内的本公开任何具体的实施方式可明确从权利要求的任何一项或多项 中排除。因为运样的实施方式视为是本领域普通技术人员已知的，他们可被排除，即使该排 除未在本文中明确阐释。本公开任何具体的实施方式可从任何权利要求中排除，出于任何 原因，无论时候与现有技术的存在相关。
[0321]仅仅使用常规实验，本领域技术人员认识到或能够确认本文所述的【具体实施方式】 的许多等同方式。本文所述的实施方式的范围不旨在限于上面的描述，而是如在所附的权 利要求中阐释。本领域技术人员认识到可对该描述做出各种改变和修饰，而不背离如下述 权利要求中限定的本公开的精神和范围。
【主权项】
1. 一种离体活化方法，其包括： 以血浆激肽释放酶(pKal)系统的活化剂孵育获得自受试者的血浆样品； 测量孵育之前和之后血浆样品中完整的高分子量激肽原(HMWK)、切割的HMWK或二者的 水平;和 确定所述活化之后所述样品中完整的HMWK的下降。2. 权利要求1所述的方法，其中通过蛋白质印迹分析测量完整的HMWK和切割的HMWK的 水平。3. 权利要求2所述的方法，其中蛋白质印迹分析是Protein Simple蛋白质印迹分析。4. 权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述活化剂是因子FXIIa。5. 权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在存在pKal调节剂候选物的情况下孵育所 述血浆样品和所述活化剂。6. 权利要求5所述的方法，进一步包括评估所述pKa 1抑制剂候选物对血楽:激肽释放酶 的活性。7. 权利要求5或权利要求6所述的方法，其中所述pKal调节剂候选物是pKa 1抑制剂候选 物。8. 权利要求1-4任一项所述的方法，其进一步包括评估所述受试者是否患有与pKal相 关的疾病或处在与pKal相关的疾病的风险中；其中与预定的值相比，升高水平的切割的 HMWK表示所述受试者患有所述疾病或处在所述疾病的风险中。9. 权利要求8所述的方法，其中所述疾病是HAE。10. 权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述受试者是患有与pKal相关的疾病并且经 受所述疾病治疗的人患者;并且其中在所述治疗之后或所述治疗过程期间获得所述血浆样 品。11. 权利要求10所述的方法，其进一步包括评估所述治疗的效力;其中与所述治疗之前 相比，下降水平的切割的HMWK或在所述治疗期间下降水平的切割的HMWK表示所述治疗是有 效的。12. 权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述患者患有HAE并且用pKa 1抑制剂治 疗。13. 权利要求12所述的方法，其中所述pKal抑制剂是DX2930。14. 一种评估受试者中血浆活化的方法，其包括： 提供来自受试者的血浆样品;和 测量所述血浆样品中切割的HMWK的水平。15. 权利要求14所述的方法，其中通过蛋白质印迹分析测量切割的HMWK的水平。16. 权利要求15所述的方法，其中所述蛋白质印迹分析是Protein Simple蛋白质印迹 分析。17. 权利要求14-16任一项所述的方法，其中所述受试者患有与血浆激肽释放酶(pKal) 系统相关的疾病或怀疑患有与血浆激肽释放酶(pKal)系统相关的疾病。18. 权利要求17所述的方法，其中用pKal抑制剂治疗所述受试者。19. 权利要求18所述的方法，其进一步包括评估pKal抑制剂的效力，其中与所述治疗之 前的切割的HMWK的水平相比，所述治疗之后下降水平的切割的HMWK表示所述pKal抑制剂是 有效的。20. 权利要求14-16任一项所述的方法，其进一步包括评估所述受试者是否患有与pKal 相关的疾病或处在与pKal相关的疾病的风险中；其中与预定的值相比，升高水平的切割的 HMWK表示所述受试者患有所述疾病或处在所述疾病的风险中。21. 权利要求20所述的方法，其中所述疾病是HAE。22. 权利要求14-16任一项所述的方法，其中所述受试者是患有与pKal相关的疾病并且 经受所述疾病治疗的人患者;和其中在所述治疗之后或所述治疗过程期间获得所述血浆样 品。23. 权利要求22所述的方法，其进一步包括评估所述治疗的效力;其中与所述治疗之前 相比，下降水平的切割的HMWK或在所述治疗期间下降水平的切割的HMWK表示所述治疗是有 效的。24. 权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述患者患有HAE并且用pKal抑制剂治 疗。25. 权利要求24所述的方法，其中所述pKal抑制剂是DX2930。26. -种用于确定样品中血浆激肽释放酶(pKal)活性的离体试验，包括： 在存在pKal底物的情况下以pKal系统活化剂孵育所述样品，和 基于底物的切割速率测量所述pKal的活性。27. 权利要求26所述的试验，其中所述样品是来自受试者的血浆样品。28. 权利要求26或权利要求27所述的试验，其中所述底物连接至标签，所述标签能够在 被pKal切割之后释放可检测的信号，并且所述底物的切割速率基于所述可检测的信号的强 度被测定。29. 权利要求26-28任一项所述的试验，其中所述活化剂是因子Xlla。30. 权利要求26-29任一项所述的试验，其中以活化剂、pKal底物和pKal调节剂候选物 孵育所述血浆样品。31. 权利要求30所述的试验，其中所述pKal调节剂候选物是pKal抑制剂候选物。32. 权利要求31所述的试验，其进一步包括评估pKal抑制剂候选物对pKal的抑制活性， 其中相对于在没有所述pKal抑制剂候选物的情况下pKal活性的水平，在存在所述pKal抑制 剂候选物的情况下下降水平的pKal活性表示所述抑制剂候选物是有效的。33. 权利要求30或31所述的试验，其中所述pKal抑制剂是结合pKal的抗体。34. 权利要求33所述的试验，其中所述抗体是DX-2930。35. 权利要求26-29任一项所述的试验，其进一步包括评估所述受试者是否患有与pKal 相关的疾病或处在与pKal相关的疾病的风险中；其中与预定的值相比，升高水平的pKal活 性表示所述受试者患有所述疾病或处在所述疾病的风险中。36. 权利要求35所述的试验，其中所述疾病是HAE。37. 权利要求26-29任一项所述的试验，其中所述受试者是患有与pKal相关的疾病并且 经受所述疾病治疗的人患者;并且其中所述样品在治疗之后活在所述治疗过程期间获得。38. 权利要求37所述的试验，其进一步包括评估所述治疗的效力；其中与治疗之前相 比，下降水平的pKal活性或在治疗过程期间下降水平的pKal活性表示所述治疗是有效的。39. 权利要求37或权利要求38所述的试验，其中所述患者患有HAE并且用pKal抑制剂治 疗。40. 权利要求39所述的试验，其中所述pKal抑制剂是DX2930。41. 权利要求26-40任一项所述的试验，其中所述试验在微板中进行。
【文档编号】C07K16/40GK105873951SQ201480070281
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年10月17日
【发明人】D·J·塞克斯顿, R·福塞特, J·A·肯尼斯顿, G·P·康利, A·尼克森, C·汤乎尔, B·阿德尔曼
【申请人】戴埃克斯有限公司