人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种人miR?183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用，其序列如SEQ ID NO：1所示。由于多种肿瘤细胞中存在miR?183基因簇的异常表达，且该家族参与细胞增殖、凋亡、迁移相关基因通路的调控，通过设计基因簇敲减元件，可以有效调控基因簇在膀胱癌细胞中的表达，不仅便于科学研究，也有利于控制肿瘤恶性表型和生物学行为。
【专利说明】
人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用
技术领域
[0001] 本申请涉及一种人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] MicroRNA(miRNA)是内源性非编码RNA，长度为约22个核苷酸。miRNA通常与其靶 基因 mRNA的3'非翻译区（3' untranslated region, 3' UTR)结合负向调控其表达。miRNAs 可以调控细胞增殖、分化和凋亡。所以，miRNA的发现为肿瘤发病机制的研究提供了新的思 路，为肿瘤诊断和治疗提供了新的策略。
[0003] miR-183基因簇（miR-183家族）是一个高度保守的基因簇，包括定位于7号染色 体的miR-183、miR-182和miR-96。研究表明，多种肿瘤细胞中存在miR-183基因簇的异常 表达，且该家族参与细胞增殖、凋亡、迁移相关基因通路的调控。因此，开发一种有效调控 miR-183/96/182在肿瘤细胞中的表达活性的生物元件，将可以更好地控制肿瘤恶性表型和 生物学行为。
[0004] 虽然传统观点认为miRNA可以下调靶基因的表达，但最新研究提示，靶基因也可 以反过来抑制miRNA的表达/活性。例如，在果蝇和人类细胞中，拥有与miRNA广泛互补位 点的非编码RNA可以有效促发miRNA从3'到5'端的水解反应。这提示，含有与miRNA广 泛互补序列的非编码RNA都可能具有特异降解miRNA表达的能力。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种新的人miR-183基因簇生物敲减元件、构建方法及应用。
[0006] 本发明提供一种人miR-183基因簇生物敲减元件，其序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0007] -种人miR-183基因簇生物敲减元件的构建方法，所述生物敲减元件的序列如 SEQ ID N0 :1所示，包括如下步骤：
[0008] a)体外化学合成经设计的人miR-183、96、182的反义序列各两个拷贝；
[0009] b)在所述反义序列之间加入连接序列，形成六个拷贝的串联序列；
[0010] c)在所述串联序列的上下游分别引入酶切位点Xhol和Notl。
[0011] 与各反义序列的第9~12位对应的碱基突变，所述连接序列是CTTC。
[0012] -种所述的生物敲减元件在治疗膀胱癌药物中的应用。
[0013] -种所述的生物敲减元件在膀胱癌细胞中调控mir-183基因簇表达的应用。
[0014] 生物敲减元件的调控包括：降低膀胱癌细胞中mir-183基因簇的表达活性、抑制 膀胱癌细胞的增殖、促进膀胱癌细胞的凋亡和抑制膀胱癌细胞的迁移。
[0015] 所述膀胱癌细胞是T24和UM-UC-3。
[0016] -种所述的生物敲减元件在膀胱癌细胞中检测mir-183基因簇表达的应用。
[0017] 检测时，可以将生物敲减元件表达载体转染入膀胱癌细胞T24和UM-UC-3。
[0018] 本发明的有益效果是：由于多种肿瘤细胞中存在miR-183基因簇的异常表达，且 该家族参与细胞增殖、凋亡、迁移相关基因通路的调控，通过设计基因簇敲减元件，可以有 效调控基因簇在膀胱癌细胞中的表达，不仅便于科学研究，也有利于控制肿瘤恶性表型和 生物学行为。
【附图说明】
[0019] 图1是本实施方式人miR-183基因簇生物敲减元件的构建示意图；
[0020] 图2是携带miR-183基因簇生物敲减元件的荧光素酶载体对细胞系T24和 UM-UC-3内miR-183基因簇的应答图，其中，林表示与对照组相比，p值小于0. 01，白色长条 指对照组，黑色长条指敲减元件；
[0021] 图3是显示miR-183基因簇生物敲减元件有效抑制膀胱癌细胞增殖的检测结果 图，其中，**表示与对照组相比，P值小于0. 01 ;*表示与对照组相比，P值小于0. 05,实线 指对照组，虚线指敲减元件；
[0022] 图4是显示miR-183基因簇敲减元件有效诱导膀胱癌细胞凋亡的检测结果图；
[0023] 图5是显示miR-183基因簇生物敲减元件对膀胱癌细胞迁移运动能力的抑制的检 测结果图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0025] 技术与方法：
[0026] 1.细胞培养
[0027] 膀胱癌细胞系 T24 和 UM-UC-3 购自 American Type Culture Col lection (ATCC, Manassas, USA)，细胞培养液由 90 % 的 DMEM (Invitrogen, CA)，10 % 的胎 牛血清（Invitrogen)，1% -2%的谷氨酰胺和0· 5% -1%的双抗配成。
[0028] 2. miR-183/96/182基因簇生物敲减元件的构建
[0029] 体外化学合成经设计的人miR_183、96、182的反义序列各两个；并在这些反义序 列之间加入连接序列，最终构成六个拷贝的敲减元件。引入酶切位点Xhol和Notl于该元件 的上下游，同时用Xhol和Notl酶切psiCHECKTM-2双荧光素酶表达载体。经T4DNA连接酶 将二者连接6小时，连接产物转化入感受态细胞，摇菌、涂板、挑选阳性克隆，并提纯质粒。
[0030] 3.细胞转染
[0031] 转染前一天，4-5 X 104个细胞接种在24孔板上，加入0. 5ml培养基，放在37°C、5 % C〇2培养箱内。生长24小时后，细胞汇合度达到70%，在50ul的无血清培养基内加入lug 重组质粒，柔和混匀。在50ul无血清培养基内加入lul Lipofectamin2000 (Invitrogen, CA) 试剂，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的质粒和Lipo2000轻柔混匀，室温放置20分钟， 以便形成质粒/lipofectamin复合物。将质粒/lipofectamin混合物加入24孔板内，轻柔 摇晃24孔板。放入培养箱内，4-6小时后更换培养基，48小时后收集细胞，准备下一步实验。
[0032] 4.总 RNA 提取
[0033] 使用美国nvitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA。使用紫外分光光度计和2% 琼脂糖凝胶检测提取的总RNA质量。定量后于-80°C储存备用。
[0034] 5.实时定量PCR
[0035] 实时定量PCR检测选用U6(snRNA U6)作为内源对照基因。使用All-in-〇neTM miRNA qRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, MD, USA)进行实时逆转录合成 cDNA 和 定量PCR验证。先进行miRNA逆转录合成cDNA。逆转录反应体系为总RNAlyl，2. 5U/ μ 1 Poly A Polymerasel μ 1, RTase Mixl μ 1, 5x Reaction buffer5 μ 1, dd H20(RNase-/ DNase free)17yl。瞬时离心，37°C孵育60min，然后，85°C酶灭活5min。实时定量PCR总 反应体系为 20 μ 1，包括 10 μ 12xAll-in-〇neTM qPCR Mix, 2 μ 1 Universal Adaptor PCR Primer (2 μ M), 2 μ 1 All-in-〇neTM qPCR Primer (2 μ M), 2 μ 1 First-Strand cDNA (diluted ini: 5)，50x ROX Reference DyeO. 4 μ 1 和 3. 6 μ 1 双蒸水。使用 ABI PRISM7000Fluorescent Quantitative PCR System (Applied Biosystems, CA, USA)进行 qPCR 反应和分析。PCR 反应均设3个重复。PCR反应参数如下：（1) 95 °C预变性15min ;⑵40个循环，每 包括 95 °C xl5s，55 °C x20s，70 °C x30s。All-in-〇ne?miRNA qPCRPrimer 货号为： miR-96，HmiRQP0852 ;miR-182，HmiRQP0239 ;miR-183，HmiRQP0244 ;snRNA U6，HmiRQP9001。 取3个重复的中值计算相对miRNA表达量（Λ Ct = Ck edianmiRNA _ CtmediansnRNAU6) 〇 表达倍数用 2 "ct 法。
[0036] 6.荧光素酶活性检测
[0037] 用 Promega 公司的 Dual-Luciferase Reporter Assay System 检测样品 Luciferase活性。按上述转染方法转染细胞。转染48h后，吸去旧培养基，用PBS清洗两次， 每孔细胞加入100 μ 1的Passive Lysis Buffer (PLB)，室温轻微振摇15min。收集细胞裂解 液于 1. 5ml Eppendorf 管中；向 Eppendorf 管中加入 100 μ 1 的 Luciferase Assay Reagent II (LAR II);将细胞裂解液12, 000g离心lmin，取上清50 μ 1加入1. 5ml Eppendorf管中并 吹打均匀：用阅读仪测量可见光强度l〇s (此时所读光为psiCHECK-2载体上转录翻译产生 的萤火虫Luciferase所发出的）；取出Eppendorf管，加入100 μ 1 Stop&Glo Reagent,吹打 均匀；用阅读仪测量可见光强度l〇s(此时所读光为psiCHECK-2载体上转录翻译出的海肾 Luciferase所发出的）将所得到的数据，标准化后进行分析。
[0038] 7.细胞增殖检测
[0039] 使用 3_ [4, 5-dimethy 1 thiazo l-2-y 1 ] _2，5-dipheny 1 _tetrazo 1 ium bromide(MTT)，即3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐检测细胞增殖。用含 10 %胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个细胞接种到96孔板，每孔体积 200μ1。分别于转染后24, 48和72h，取相应的孔做检测。每个样本设3个复孔。每孔加 MTT溶液（5mg/ml) 10 μ 1。孵育4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液。每孔加100 μ 1 DMS0， 振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，用酶标仪（Bio-Rad，美国）测定各孔吸 光值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
[0040] 8.细胞凋亡检测
[0041] 贴壁细胞经轻吹打收集到l〇ml的离心管中，没脱壁的细胞用0. 02%的EDTA消化 使之脱壁，每样本细胞数为（1~5) X 106, 500~1000r/min离心5min弃去培养液。用孵 育缓冲液洗1次，500~1000r/min离心5min。用100 μ 1的标记溶液重悬细胞，室温下避 光孵育10~15min。500~1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。加入荧光 溶液4°C下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪（EPICS，XL-4, Beckman，CA，USA)分析 细胞凋亡率。
[0042] 9.细胞迁移检测
[0043] 细胞迁移运动能力由细胞划痕实验检测。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比 着，均匀得划横线，大约每隔0.5~lcm-道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在孔中加 入约5X10 5个细胞，长满后用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕。用PBS洗细胞3 次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5% C02培养箱，培养。按0, 24小时取 样，拍照。
[0044] 10.统计学分析
[0045] 数据分析使用SPSS17. 0统计软件，正态分布的数据采用x±s表示。两组间比较， 采用独立样本t检验。检验水准以P〈0. 05表示差别具有统计学意义。
[0046] 实验结果：
[0047] 1. miR-183/96/182簇生物敲减元件的构建
[0048] 针对11^1?-183、96、182，首先设计它们的反义序列各2拷贝；其中，将与每个1^1^^ 第9~12位对应的碱基突变以增强二者的结合稳定性，再在这些反义序列之间加入连接 序列，最终构成6个拷贝的敲减元件。序列以接头相连。另外设置对照组：6个拷贝长度为 22bp的重复序列，此序列不与任何已知的人miRNA配对。在敲减元件两端分别加入Xhol 和Notl酶切位点，定向亚克隆到psiCHECK?-2质粒hRluc基因下游，如图1所示。相关序 列请见表1。
[0049] 表1敲减元件和阴性对照序列表
[0052] 表1中，斜体字部分为限制性酶切位点，横线部分为连接序列，粗体字部分为突变 序列。
[0053] 2. psicheck-2载体荧光素酶相对表达活性在膀胱癌细胞中明显降低
[0054] 将构建好的miR-183/96/182簇敲减生物元件表达载体及其阴性对照载体分别转 染入膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3,48小时后检测荧光素酶相对表达活性：相比于阴性对照 组，miR-183/96/182簇敲减元件转染组的荧光素酶表达受到了明显的限制，如图2所示，说 明该荧光素酶报告系统对细胞内源性的miR-183/96/182簇产生了有效的应答。
[0055] 3. miR-183/96/182簇生物敲减元件可以有效降低膀胱癌细胞系miR-183/96/182 簇表达量
[0056] 将构建好的miR-183/96/182簇敲减生物元件表达载体及其阴性对照载体分别转 染入膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3,48小时后检测miR-183/96/182簇的相对表达量：相比 于阴性对照组，miR-183/96/182簇敲减元件转染组的miR-183/96/182簇表达受到了明显 的抑制，如表2所示，说明该元件可以有效敲减细胞内源性的miR-183/96/182簇。
[0057] 表2miR-183基因簇生物敲减元件对细胞内源性miR-183基因簇表达量的影响
[0058]
[0059] 表2中，a :与对照组相比，p值小于0. 01。
[0060] 4、miR-183/96/182簇生物敲减元件可以有效抑制膀胱癌细胞系的增殖
[0061] 将构建好的miR-183/96/182簇敲减生物元件表达载体及其阴性对照载体分别转 染入膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3, 24、48、72小时后检测细胞的增殖活力：相比于阴性对照 组，miR-183/96/182簇敲减元件转染组的细胞增殖受到了明显的抑制，如图3所示，说明该 元件可以通过降低致癌性miR-183/96/182簇分子来有效抑制癌细胞的生长。
[0062] 5、miR-183/96/182簇生物敲减元件可以有效促进膀胱癌细胞的凋亡
[0063] 为了进一步证实miR-183/96/182簇生物敲减元件抑制膀胱细胞生长是通过促进 细胞凋亡实现的，将构建好的miR-183/96/182簇敲减生物元件表达载体及其阴性对照载 体分别转染入膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3,48小时后检测细胞的凋亡率：相比于阴性对照 组,miR-183/96/182簇敲减元件转染组的细胞凋亡率明显增加，如图4所示,说明该元件可 以通过降低致癌性miR-183/96/182簇分子来有效诱导癌细胞的凋亡。
[0064] 6、miR-183/96/182簇生物敲减元件可以有效抑制膀胱癌细胞的迁移
[0065] 将构建好的miR-183/96/182簇敲减生物元件表达载体及其阴性对照载体分别转 染入膀胱癌细胞系T24和UM-UC-3,24小时后检测细胞的迁移距离：相比于阴性对照组， miR-183/96/182簇敲减元件转染组的细胞迁移过程明显受到抑制，如图5所示，说明该元 件可以通过降低致癌性miR-183/96/182簇分子来有效抑制癌细胞的迁移运动能力。
[0066] 一种人miR-183基因簇（miR-183/96/182)生物敲减元件，其序列如SEQ ID N0 :1 所示。该生物敲减元件能够应用在治疗膀胱癌药物中。该生物敲减元件能够在膀胱癌细胞 中调控mir-183基因簇表达。该生物敲减元件能够在膀胱癌细胞中检测mir-183基因簇表 达。
[0067] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种人miR-183基因簇生物敲减元件，其特征在于，其序列如SEQ ID NO : 1所示。2. -种人miR-183基因簇生物敲减元件的构建方法，其特征在于，所述生物敲减元件 的序列如SEQ ID NO :1所示,包括如下步骤： a) 体外化学合成经设计的人miR-183、96、182的反义序列各两个拷贝； b) 在所述反义序列之间加入连接序列，形成六个拷贝的串联序列； c) 在所述串联序列的上下游分别引入酶切位点Xhol和Notl。3. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，与各反义序列的第9~12位对应的碱 基突变，所述连接序列是CTTC。4. 一种权利要求1所述的生物敲减元件在治疗膀胱癌药物中的应用。5. -种权利要求1所述的生物敲减元件在膀胱癌细胞中调控mir-183基因簇表达的应 用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述膀胱癌细胞是T24和UM-UC-3。7. -种权利要求1所述的生物敲减元件在膀胱癌细胞中检测mir-183基因簇表达的应 用。
【文档编号】C12N15/113GK105886504SQ201410208519
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年5月16日
【发明人】黄卫人, 刘宇辰, 韩永华, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院