一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用
【专利摘要】本发明涉及一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用，属于基因工程技术领域。苦豆子水通道蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2，编码苦豆子水通道蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述苦豆子水通道蛋白在提高植物耐盐性中的应用。本发明能提高转基因植物的耐盐性，对丰富抗性基因资源及培育耐盐大豆品种具有重要意义。
【专利说明】
一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及苦豆子水通道蛋白基因⑶S序列的应用。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题，全球约有20%的耕地受到盐 害威胁，43%的耕地为干旱、半干旱地区。盐害严重影响植物的生长发育，造成作物减产，并 使生态环境日益恶化。在自然条件下，由于环境胁迫而严重影响了作物生长发育，其遗传潜 力难以发挥，盐渍不仅影响了作物的产量，而且限制了植物的广泛分布，因此，提高作物的 耐盐能力已成为抗逆育种急需解决的关键问题之一。随着分子生物学的发展和转基因技术 的成熟，利用转基因技术提高植物的耐盐碱性，已在盐碱土壤改良方面得到广泛的应用。同 时，以旱生、耐盐碱植物为研究材料，从中分离克隆得到耐盐碱性显著的基因，是获得抗性 基因资源的有效方法。
[0003] 苦豆子(Sophora alopecuroides.L)为豆科槐属植物，别名、苦豆草、欧苦参等，为 多年生草本、根茎地下芽旱生耐盐植物。其耐旱、耐盐性显著，是一个抗性基因丰富的基因 资源库。因此，从苦豆子中筛选克隆盐胁迫相关基因，分析其耐盐性，阐明其相关功能，有助 于对抗盐基因的进一步利用。
[0004] 水通道蛋白（aqUap〇rinS，AQPs)是一类能够高效特异转运水分子的膜结合蛋白， 在多种非生物胁迫下，如干旱、盐碱、低温等，植物都会出现细胞水分失衡。胞内缺水是胁迫 中常见的生理反应，AQPs对水分高效的跨膜转运，能够起到维持细胞渗透平衡，保持细胞水 分的作用。
[0005] 1988年由Agre等分离到了第一个AQP蛋白，而后在爪蟾卵母细胞表达系统中证明 了其介导水分运输的功能。AQPs在不同的物种中的结构都比较保守。
[0006] 水通道蛋白中水孔的开闭是通过特异位点上氨基酸的磷酸化和质子化来调控的。 而AQPs水孔的开闭受多种胞外信号的调控，包括Ca 2+信号、PH、细胞渗透压等。同时，AQPs还 可通过在细胞内膜系统上的重新定位来调控其导水率。对拟南芥的研究发现，AtPIP2;l在 外界盐胁迫下可从细胞膜内化转移到内质网膜上，使得根部的导水率下降，减少水分流失。
[0007] 盐胁迫初期，植物首先出现的损害是渗透胁迫，此时植物吸水能力下降，体内水分 缺失，此时AQP基因通过降低表达量、AQP蛋白通过磷酸化关闭水孔以及质膜上的AQPs蛋白 内化来降低质膜的通透性，减少渗透失衡下水分的流失。
[0008] 在盐害胁迫后期，由于细胞内的Na+和cr的积累，造成离子毒害。在对盐生植物冰 花的研究发现，在盐胁迫下，冰花叶肉细胞中会产生一种小液泡，其作用是区隔化Na+，液泡 膜上存在大量的AQPs，表明AQPs参与到Na+区隔化过程，进而维持细胞的离子平衡。
[0009] 盐胁迫条件下，AQPs基因的表达受到ΑΒΑ的调控。对番茄喷施ΑΒΑ进行处理24h，其 根的导水率显著升高，同时番茄根部的多个AQPs基因表达量显著上升。
【发明内容】
[0010]本发明提供一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用，能提高植物耐盐性。 [0011]本发明苦豆子水通道蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2。
[0012] 本发明编码苦豆子水通道蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No. 1。
[0013] 本发明所述苦豆子水通道蛋白在提高植物耐盐性中的应用。
[0014] 我们利用苦豆子cDNA酵母表达文库对苦豆子抗盐相关基因进行筛选，得到了一盐 胁迫相关基因，水通道蛋白基因，命名为SaAQP。
[0015] 在苦豆子中，到目前为止，关于SaAQP的作用还未见报道。
[0016] 利用任何一种能够引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SaAQP 编码基因导入植物细胞，可获得耐盐性提高的转基因细胞系及转基因植株。使用本发明的 基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启 动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如 加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉 素、卡那霉素等）。携带有本发明SaAQP的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将 转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本 发明的基因对提高植物耐盐性，提别是培育耐盐大豆品种具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 图1是SD/-Ura(含NaCl 0.68mol/l)筛选培养基菌落图；
[0018] 图2是酵母阳性克隆？0?检测图，]\1:200(^口1]^冰61'，1-6:酵母扩增结果；
[0019]图3是SaAQP基因在苦豆子不同组织中的表达结果图；
[0020]图4是SaAQP基因在NaCl胁迫下的表达结果图；
[0021] 图5是SaAQP基因的农杆菌菌液PCR结果图，]\1:200(^口1^11?^，1-5 :5340?基因；
[0022] 图6A是大豆发状根的诱导及⑶S检测阴性对照图；
[0023]图6B是转基因大豆发状根的诱导及GUS检测图；
[0024]图7是转基因大豆发状根中SaAQP基因的qRP-PCR检测图，1，2，3为3次重复，PCHF-1301为阴性对照；
[0025]图8是带子叶转基因大豆发状根耐盐表型图；
[0026]图9是带子叶转基因大豆发状根在不同浓度NaCl胁迫下发状根的干重比较图，*表 示达到0.05概率显著水平；
[0027]图10是离体转基因大豆发状根耐盐表型图，左边:对照（空载），右边:转基因发状 根；
[0028]图11是离体转基因大豆发状根在不同浓度NaCl胁迫下的湿重比较图，*表示达到 〇. 05概率显著水平**表示达到0.01概率极显著水平；
[0029]图12是离体转基因大豆发状根在不同浓度NaCl胁迫下的存活数比较图，*表示达 到0.05概率显著水平；
[0030]图13是转SalAQP基因大豆发状根复合体植株的耐盐表型图；
[0031]图14是转SaAQP基因大豆发状根复合体植株在不同浓度NaCl胁迫下发状根的湿重 比较，*表示达到0.05概率显著水平。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1苦豆子SaAQP基因的筛选与克隆
[0033] 选取籽粒饱满的苦豆子种子10g，加入5ml浓度98%的浓硫酸浸泡处理20min。洗净 种子后播种于花土中盆栽。培养条件为：16h光照，温度26°C，湿度65%，光强30000勒克斯。 萌发四周后，分别将幼苗转移至NaCl浓度为200mmol、Na2C03浓度为140mmol和PEG6000浓度 为8 %的hoagland营养液中分别处理3h，12h，24h，72h。取各处理下的苦豆子根部，分别提取 不同处理条件下苦豆子根的totalRNA。取上述提取的4个处理的苦豆子根部RNA，等质量混 合各组样品用于cDNA文库构建。提取构建完成的cDNA文库质粒，将文库质粒大规模转化酿 酒酵母INVSC1感受态细胞构建苦豆子苗期酵母表达cDNA文库。利用酵母植物抗逆基因筛选 体系筛选苦豆子抗盐相关基因，筛选方法如下：
[0034]取适量文库菌液（使克隆总数达文库滴度的5-10倍），涂布SD/_Ura(含NaCl 0.68mol/l)筛选平板，30°C倒置培养2-4天至菌落出现，如图1所示;保存筛选到的酵母菌 株，根据酵母表达载体序列设计引物，引物为：
[0035]
[0036] 按照表1反应和表2程序进行PCR检测：
[0037] 表1PCR反应体系
[0038]
[00洲」 表2PCK捏序
[0040]
[0041] 如图2所示;参照Sangon酵母质粒提取试剂盒的方法分别提取上述酵母菌液的质 粒，选取大于700的片段提取质粒，转化Ecoli DH5a，保存菌液并进行测序，将测序后的序列 去除载体序列，淘汰小于50(^?的序列，利用1^81数据库81&^(11^? :// blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi?PR0GRAM = b las tn&PAGE_TYPE = Blast Search & LINK_LOC = blasthome)进行序列比对分析，得到苦豆子水通道蛋白（SaAQP)基因。由753个 碱基对组成，读码框自5'端第1位到第753位碱基，编码一个由250个氨基酸残基组成的蛋白 质SaAQP蛋白具有膜内在蛋白（MIP)家族结构域，MIPs属于水通道蛋白的一类蛋白，其N端之 后带有六条跨膜螺旋，在质膜上具有选择性输水的作用。说明SaAQP也属于MIP家族，与MIP 有相似的功能。
[0042] 实施例2苦豆子SaAQP基因的组织特异性表达
[0043] 对苦豆子进行NaCl盐胁迫处理，处理方法同实施例1。处理时间分别为lh，2h，4h， 8h，12h，24h，48h。取各处理下苦豆子根部，同时取在hoagland营养液中培养的苦豆子的根、 茎、叶。参照sangon公司的柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒提取处理材料的总RNA，经1 %琼 脂糖电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M_MLV(RNase H-)的 说明书进行。利用实时荧光定量PCR对SaAQP基因在苦豆子不同组织及不同盐处理时间根中 的表达情况进行检测。实验操作按照sangong公司SGExcel FastSYBR Mixture(With R0X) 说明书在在实时荧光定量PCR仪ABI 7500中进行。以苦豆子Lectin为内参基因，引物如下：
[0044]
[0045] PCR反应体系及程序如表3:
[0046] 表3PCR反应体系和反应程序
[0047]
[0048]
[0049] 采用2_ΛΛετ法分析数据，确定基因的相对表达量。试验共设3次技术重复，3次生物 学重复。
[0050] 结果（图3)表明SaAQP基因在苦豆子的根、茎尖、叶片中均有表达，其中，根中的表 达量最高，其他组织表达量相对较低，SaAQP基因在茎尖中的表达量最低，绝大多数AQPs蛋 白都定位于植物根系的质膜上，故SaAQP基因在根中的表达量显著高于其他组织。同时 SaAQP基因的表达水平在盐处理lh就迅速上升，4h达到最大，之后迅速下降。（图4)。这是由 于SaAQP基因的表达受ΑΒΑ的调控，在盐胁迫条件下，植物根系能在很短的时间内产生大量 的ΑΒΑ，受ΑΒΑ调控的基因的表达量也随之变化。
[0051 ]实施例3SaAQP在大豆中的表达及对耐盐性的分析
[0052]构建植物表达载体pCHF-1301-SaAQP。采用发根农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化 将植物表达载体pCHF-1301-SaAQP(图5)转化大豆吉林35,并对转基因大豆发状根进行⑶S 表达检测，同时检测阳性植株中目的基因表达量，并对转基因大豆发状根的耐盐性进行分 析。具体方法及结果如下：
[0053] 3.1大豆发根的遗传转化及筛选 [0054] 1)植物材料的处理
[0055]选取饱满、无病害的大豆吉林35种子，平放于培养皿中，将培养皿置于密闭的干燥 器中，并在干燥器中放入一加有96mlNaC10和4ml浓HC1的烧杯，Cl2灭菌14-hl6h。
[0056] 2)大豆种子发芽
[0057]取上述灭菌的大豆吉林35种子，接种于发芽培养基上，于16h光照，温度26°C，湿度 65%，光强30000勒克斯的组培室发芽4-6天。
[0058] 3)侵染菌液的配制
[0059] i .从-80 °C冰箱中取出保存的发根农杆菌K599 (载体分别为pCHF-1301 -SaAQP和 pCHF-1301)，在YEP(含 1 OOμg/mlKan)固体平板上划线，28 °C 培养24h;
[0060] ii.挑取平板上的单菌落，接种于50ml YEP(含100μg/mlKan)液体培养基中， 250rpm，28 °C 振荡培养 8h-l Oh，使 0D6QQ = 0 · 8-1 · 0;
[0061 ] iii.取培养好的菌液5ml，加入到500ml YEP(含100μg/mlKan)液体培养基中， 250rpm，28 °C振荡培养4h-6h，使OD600 = 0.6-0.8，该菌液为侵染菌液。
[0062] 4)大豆的侵染及发状根的诱导
[0063] a大豆子叶节转化
[0064] i.选取上述发芽良好的大豆吉林35种子，轻轻剥去种皮，切掉部分胚根，留取3-5mm下胚轴；
[0065] ii.沿下胚轴竖直从中间将两片子叶切开，去掉子叶，用手术刀沿子叶节处平行划 伤10次，然后将外植体置于上述侵染菌液中浸泡侵染30min;
[0066] iii.将外植体从侵染菌液中取出，内面向下平放于垫有滤纸的共培养培养基中， 于16h光照，温度26°C，湿度65%，光强30000勒克斯的组培室共培养4-5天。
[0067] iv.将共培养后的外植体用根诱导液体培养基清洗3-4次，再浸泡30min，然后用滤 纸吸取外植体表面液体，用手术刀去除芽，使外植体内面向上，倾斜45°斜插入根诱导固体 培养基中，于16h光照，温度26°C，湿度65%，光强30000勒克斯的组培室培养15天。
[0068] b大豆复合体植株转化
[0069] i.选取上述发芽良好的大豆吉林35种子，轻轻剥去种皮，切掉部分胚根，留取3-5mm下胚轴；
[0070] ii.用手术刀在子叶下胚轴中间切十字2-3次，然后将外植体置于上述侵染菌液中 浸泡侵染30min;
[0071] iii.将外植体从侵染菌液中取出，内面向下平放于垫有滤纸的共培养培养基中， 于16h光照，温度26°C，湿度65%，光强30000勒克斯的组培室共培养4-5天。
[0072] iv.将共培养后的外植体用根诱导液体培养基清洗3-4次，再浸泡30min，然后用滤 纸吸取外植体表面液体，将外植体胚根向下，竖直插入到根诱导固体培养基中，于16h光照， 温度26°C，湿度65%，光强30000勒克斯的组培室培养15天。
[0073] 3.2转基因大豆发状根GUS表达检测
[0074] 随机选取部分发状根，用X-Gluc染色，37 °C黑暗染色12-14h，用70 %的乙醇脱色数 次，检测GUS基因的表达。图6A，图6B为装SaAQP基因的大豆发状根的⑶S染色鉴定结果。结果 表明，SaAQP基因已在大豆发状根中表达。
[0075] 3.3转基因大豆发状根的目的基因的表达检测
[0076]选取上述GUS检测为阳性的转SaAQP基因外植体发状根和转化pCHF-1301的发状 根，提取RNA，反转录为cDNA，通过qRT-PCR检测目的基因的表达量，内参为大豆β-actin，方 法参照实施例2。结果如图7所示，与转化pCHF-1301的对照相比，SaAQP在转基因发状根中表 达量均有显著提高，说明SaAQP已成功转入大豆中。
[0077] 3.4转SaAQP基因大豆发状根的耐盐性分析
[0078] 1)带子叶转SaAQP基因大豆发状根耐盐性分析
[0079]发根农杆菌侵染后的大豆外植体于根诱导培养基上培养5-7天，将有发根迹象的 子带叶外植体和对照转移至含有不同浓度NaCl的固体MS (含16mg/L潮霉素)培养基中，培养 15天后进行统计。结果显示，随着NaCl浓度的增加，转基因大豆发状根的生长情况要优于对 照组，并且发状根的干重也显著高于对照；而当NaCl浓度达到达到200mmol/L时，转SaAQP基 因的发状根的生长受到抑制，难易诱导产生正常的发状根，且外植体失绿变黄。见图8和图 9〇
[0080] 2)离体转SaAQP基因大豆发状根耐盐性分析
[0081]将检测为阳性的转基因大豆发状根培养于不同浓度NaCl的固体MS(含16mg/L潮霉 素)培养基中，处理15天后进行观察统计。结果发现，在较低浓度(浓度在50mmol/L以下）的 NaCl处理时，转SaAQP基因的发状根的生长状况于对照相比并无显著差异，随着NaCl浓度的 升高，转基因发状根的生长及湿重均明显高于对照，见图10;转SaAQP基因的发状根的湿重 增长最为显著，湿重增量是对照的3倍，见图11。而当NaCl浓度达到200mmol/L时，转基因发 状根与对照的生长均受到抑制，但转基因发状根的存活率均显著高于对照，转SaAQP基因的 发状根存活率为38.4%，对照组的存活率为15.6%，见图12。
[0082] 3)转SaAQP基因大豆发状根复合体植株的耐盐性分析
[0083]将发根农杆菌侵染的整个大豆双子叶外植体培养于不同浓度NaCl的固体MS(含 16mg/L潮霉素)培养基中，处理30天后进行观察统计。当NaCl浓度为50、100、150mmol/L时， 转SaAQP基因的发状根植物复合体的长势均好于对照，见图13;在NaCl浓度为100、150mmo 1 / L胁迫条件下，SaAQP基因的发状根植物复合体的湿重均显著高于对照。见图14。
[0084]我们对转SaAQP基因的大豆发状根进行盐胁迫处理，分析其对大豆根系耐盐的影 响，结果表明，SaAQP基因在发状根中的过表达均使得转基因大豆发状根表现出了一定的耐 盐性。对转基因发状根在不同浓度盐胁迫条件下发状根的生长状态、存活率、增重等进行了 统计，结果显示，在NaCl浓度为100、150mmol/L时，其生长状态良好，耐盐效果显著;在NaCl 浓度为200mmol/L时，虽然其生长受到抑制，但存活率显著高于对照。说明SaAQP和基因的过 表达均能不同程度的提高转基因植物的耐盐性。 序列表 <110，吉林大学 <120〉一种苦豆子水通道蛋白及其编码基因及应用 <13Q> j1uwangqy-2016D1 <160> 2 <170> Patentln version 3：. 3 <21:〇> 1 <2U> 7.53 <212> DNA <213〉苦豆子永通道蛋白.基因 CDS. <400) 1 atgccgatca gaaacatcgc aatcggaagg cccgaagagg caattcaccc agacacgttg 60 aaggcaggtc tagctgagtt Gatttecacc c^teatctttg tcttcgctgg ctcaggctCG 120
[0085] ggcatcgctt acaacaagct caccgacgat gcccccgcca gccctgcagg actcatctcc 180 gcctcgattg cccatgcatt cgccetcttc gtcgccgtct ccgtcggtgc caacatctcc 240 ggtggccacg tcnnccccgc cgtcaretto ggagccttcc tcggcgggaa, catcarcttc 300 cttcgtggca tcgtttacat catcgttcag ctccttggct ccatcgtcgc ctccttgctc 360 ctcgagttcg tcaccggact tggxgttcca gcattcgggc tttctgctgg agttggtgtt 420 gggaacgcgt tggtgctgga gatcgtgatg actttcggtt tggtttacac agtttacgcc 480 aGagccg'ttg atcccaagaa gggtagttt.g ggaactattg GG〇c€atGgG tattggtttc 540 atcgttggtg ctaacatctt ggtgggtggg gctttcagtg gagcatccat gaacccagcc 600 gtgtctttcg gacctgctct tgtgagctgg acctgggcca accactggat ctactgggtt 660 gggcctctcg ttggtggtgg gcttgctggg cttgtctacg atcttctctt tatcaacaat 720 accoatgaac agctcececa gactgattac tag ?53 <210> 2 <21i> 250 <212> PRT <213〉苦豆子水通道蛋白 <400) 2 Met Pro lie Arg Asn lie Ala lie Gly Arg Pro Olu Glu ila lie His 1 .5 1.0 15 Pro Asp Thr Leu Lys Ala G]y Leu Ala Glu P：he lie Ser Thr Leu lie 20 25 30 Phe ￥al Pbe Ala Gly Ser Gly Ser Gly lie Ala, Tyr Asn Lys： Leu Thr 35 40 45 Asp Asp Ala Pro Ala Ser Pro Ala Gly Leu lie Ser Ala Ser lie Ala 50 55 60 His： Ala Phe Ala Leu Phe ￥al Ala Val Ser Val Gly Ala Asn lie Ser 65 70 75 80 Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Leu Gly Gly 85 90 95
[0086] Asn. .il.e Thr Phe Leu Arg Gly 丄le Val Tyr 丄丄e 丄ie 'Val _(Urt Le'u Leu 100 105 110 Gly Ser lie Val Ala Ser L@u Leu Leu Glu Phe ￥al Thr Gly Leu Gly 115 120 125 Val Pro Ala Phe Gly Lau Ser Ala Gly Val Gly: Val Gly Asn Ala Leu 130 135 110 Val Leu Glu lie Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Yal Tyr Ala 145 150 155 16:0 Thr Ala Val Asp Pro Lys Lys Gly Ser Leu Gly Thr He Ala Pro lie 1：65 170 175 Ala lie Gly Phe Ho Yal Gly Ala Asn lie Lgu fal Gly Gly Ala Phe 180 185 190 Ser Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Leu Val 195 2：Q0 205 ：Se；r Trp Thr Trp Ala Asn His Trp He Tyr Trp Val G1K Pro Leu Val 210 215 2：2D Gly Gly Gly Leu Ala Gly Leu: ￥al Tyr: Asp Leu: Leu Phe: I:l.e Asn. Asn [0087] 225 230 235 240 Thr His Glu Gin Leu Pro Gin Thr Asp： Tyr 245 250
【主权项】
1. 一种苦豆子水通道蛋白，其特征在于:其氨基酸序列为SEQ ID No.2。2. -种编码苦豆子水通道蛋白的基因，其特征在于:其核苷酸序列为SEQ ID No.1。3. 如权利要求1所述的苦豆子水通道蛋白在提高植物耐盐性中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK105906695SQ201610388727
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】王庆钰, 郭文云, 刘雅婧, 王英, 李景文, 闫帆, 赵明珠, 尹智超, 王天亮, 申梓邑
【申请人】吉林大学