用于砧用南瓜“黄诚根2号”杂交种子纯度鉴定的ssr引物及方法
【专利摘要】本发明公开了用于砧用南瓜“黄诚根2号”杂交种子纯度鉴定的SSR引物及方法。所用SSR引物为：正向引物：5’?GGCATTTCTGAGAACAGCTT?3’和反向引物：5’?ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC?3’。鉴定方法如下：1)砧用南瓜幼苗基因组DNA的提取；2)以砧用南瓜基因组DNA为模板，使用SSR引物进行PCR扩增；3)对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；4)对电泳结果进行分析，同时具有父本、母本特异性条带的单株为真杂交种，只有母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种。本发明的引物和方法可对“黄诚根2号”杂交种子和其母本、父本种子进行有效、快速区分，准确检测出杂交种子纯度。本方法具有快速、准确、低成本、操作简单等优点。
【专利说明】
用于砧用南瓜"黄诚根2号"杂交种子纯度鉴定的SSR引物及 方法
技术领域：
[0001] 本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于砧用南瓜杂交种"黄诚根2号"种子 纯度鉴定的引物及方法。
【背景技术】：
[0002] 种子质量的高低关系到农业生产安全，而衡量种子质量的重要指标之一就是纯 度，因此对种子进行纯度检测在农业生产及质量监管过程中尤为重要。以形态学标记鉴定 品种的纯度和真伪，耗时长、受季节限制、多态性差。随着DNA分子标记技术的广泛应用，使 得从基因组水平上鉴定纯度已成为种子纯度鉴定的重要方向。目前常用的分子标记技术包 括AFLP(Amplified fragment length polymorphism)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)、ISSR(Inter simple sequence repeat)、DAF(DNA amplified fingerprint)、SSR(Simple sequence repeat)等。SSR分子标记技术以其标记数量丰富、多态性高、呈共显性遗传、重复性好、易于 操作、结果可靠等诸多优点成为快速、稳定、准确的纯度鉴定方法，可以将呈父母本互补带 型的杂交种与其双亲、甚至也可以将一些异源花粉造成的杂交种区分开。基于上述特点， SSR标记逐步成为蔬菜作物品种鉴定的理想分子标记之一。
[0003] 南瓜是萌芦科南瓜属蔬菜作物，属于雌雄同株异花植物。在制种过程中的串粉及 收获后的机械混杂导致优良品种混杂，此外母本去雄不彻底形成的自交种，是导致种子遗 传纯度下降的主要原因。同时，随着南瓜选育品种数目的增多及育种材料遗传基础的日益 狭窄，使得品种间的遗传差异越来越小，导致品种真实性和纯度鉴定的难度不断加大，因此 建立一套准确、快速、稳定、不受环境因素影响的杂交种纯度鉴定技术体系是保障良种及时 销售和安全使用、规范种子市场和促进我国种子产业参与国际竞争的迫切需要。
[0004] 砧用南瓜"黄诚根2号"是以S4236为母本，XR为父本育成的砧用南瓜一代杂交种。 "黄诚根2号"具有与黄瓜亲和力强，高抗枯萎病，嫁接黄瓜增加瓜条亮度的特点，已经在设 施黄瓜生产中大面积应用。为了保证优良杂交品种的推广和产生最大的经济效益，筛选出 对砧用南瓜"黄诚根2号"杂交种子纯度进行准确鉴定的SSR引物及方法，以解决"黄诚根2 号"在制种过程中导致制种纯度不高的问题，为种子生产经营企业提供了一个准确、稳定、 快速、实用的"黄诚根2号"杂交种子纯度鉴定的方法。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的在于提供用于砧用南瓜一代杂种"黄诚根2号"种子纯度鉴定的SSR 弓丨物NG32和一种快速、准确鉴定"黄诚根2号"种子纯度的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种用于砧用南瓜杂交种"黄诚根2号"种子纯度鉴定的SSR引物NG32,序列如下所 示：
[0008] NG32-正向引物：5'-GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3'（SEQ ID N0:1),
[0009] NG32-反向引物：5'-ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3'（SEQ ID N0:2)。
[0010] -种用于砧用南瓜"黄诚根2号"杂交种子纯度鉴定的方法，具体步骤如下：
[0011] 1)分别提取"黄诚根2号"及其父本、母本幼苗基因组DNA;
[0012 ] 2)以上述提取的基因组DNA为模板，使用SSR引物对NG32进行PCR扩增；
[0013] 3)对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0014] 4)对凝胶电泳结果进行分析，只有同时具有父本、母本特异性条带的单株为真正 的杂交种，只有母本特征条带而无父本特征条带的后代为假杂种或自交种，计算种子纯度。
[0015] PCR 扩增的 25μ1 反应体系为：基因组 DNA 1.0yl，25mmol.L-WgCh 2·5μ1， 2.0mmol · L-ΜΝΤΡ 2μ1，NG32 引物 lOymol · L-1 各为 0 · 5μ1，Taq 酶0 · 2U 0 · ΙμL，10 X PCR buffer 2 ·5μ1，(ΜΗ2〇补足至25μ1。
[0016] PCR扩增的程序为:94°C预变性5min后，94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s， 35个循环后，72°C保持lOmin，然后置于4°C保存。
[0017] 所述凝胶电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染检测。
[0018] 本发明的方法可将"黄诚根2号"杂交种子与其母本、父本种子区分开来，快速检测 出杂交种子的纯度。本方法具有快速、准确、低成本，操作简单等优点，能够替代传统杂交种 子纯度鉴定的方法，具有较高的商业应用价值。
【附图说明】
[0019] 图为南瓜"黄诚根2号"种子纯度鉴定PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（M: pBR322DNA/MspI分子量标准；1，2,3,4,5,6:杂交种"黄诚根2号"；，7，8:父本"XR" ；9，10:母 本"S4236" ；
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但并不局限于此。
[0021] 实施例1
[0022] 砧用南瓜"黄诚根2号"杂交种子纯度检测方法的建立。
[0023] 1、筛选纯度鉴定的SSR引物。
[0024]从所公布的南瓜SSR引物在亲本(母本"S4236"，父本"XR"）间、进行筛选，选出共显 性差异标记条带的引物NG32，序列如下所示：
[0025] NG32-正向引物：5'-GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3'（SEQ ID N0:1)
[0026] NG32-反向引物：5'-ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3'（SEQ ID N0:2)
[0027] 该标记带型清晰、重复性好。引物NG32能产生123bp的父本特异性标记NG32 123和 89bp的母本特异性标记NG32 89。
[0028] 2、利用SSR引物NG32对"黄诚根2号"杂交种子进行纯度鉴定。
[0029] (1)南瓜基因组DNA的提取
[0030]实验材料为砧用南瓜"黄诚根2号"及其父本(XR)、母本(S4236)子叶DNA。
[0031 ] 步骤如下：
[0032]①液氮在2ml的离心管内用研杵研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入2%CTAB提取缓 冲液700μ1，混勾后置于65°C水浴中温浴60min(每隔5min摇动一次）。
[0033] ②静置至室温后在4°C下12000rpm离心10min，将上清转移到新的2ml离心管。
[0034]③加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24:1 )，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4°C下 12000rpm离心10min，将上清液转入新的1.5ml离心管中。
[0035]④加2/3体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，置于一 20 °C下放置30min。
[0036] ⑤在4°C下12000rpm离心10min，弃上清，加入200~300μ1预冷的70 %乙醇洗涤DNA 沉淀(两次），微干。
[0037] ⑥加入30μ1无菌水溶解。
[0038] (2)PCR扩增:采用25μ1的PCR扩增体系 基因组DNA模板 1. 0 μ 1 10XPCH buffer (含 25 2. 5 μ 1
[0039] 飄0:[ · Ρ 鳴) 2, 0 nunol · L：1 dNTP 2. 0 μ： 1 NG32 正向引物 10 :μ mol · L--1 0. 5 μ 1 NG32 反向引物 10: μ 興1 · L-1 0. 5 μ 1 Taq 酶:Q. 2? 0. 1 μ 1
[0040] ddH20 18,. 4 μ 1
[0041 ] PCR扩增程序如下：
[0042] 94Γ 预变性 5min;
[0043] 94 °C 变性 30s，57 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s，35 个循环；
[0044] 72°C 延伸 7min;
[0045] 4°C 保存。
[0046] (3)凝胶电泳
[0047] 取5μ1 PCR产物加入ΙμL 6x loading buffer混匀，取ΙμL上样于8%的非变性聚丙 烯酰胺凝胶电泳，150V稳压2.5h，电泳结束后进行0.1%AgN03银染20min;银染后用2% NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2C03显色，显色后在灯箱上拍照分析。
[0048] (4)扩增结果
[0049]砧用南瓜"黄诚根2号"杂交种扩增出123bp和89bp两条带;父本扩增出123bp的条 带;母本扩增出89bp的条带(见图）。
[0050]回收特异条带，送上海生工公司测序。杂交种子中123bp条带的序列如SEQ ID N0: 3所示，89bp条带的序列如SEQ ID N0:4所示，与父本、母本扩增产物的序列相符。 <uo>青岛利技大学，青岛市农业科学研究院 <120>用于砧用南瓜"黄诚根2 ^杂交种/·纯度鉴定的SSR引物及方法 <130> <160> 4 <170> Patent in version 3.3 <210 1 <2li> 20 <2I2> ?)ΝΛ <2Π> 人工序列 <400> 1 (i(iCArTTCTGA<3AAC：AGCTT 20 Ol 2 25 ·2\2> ΟΝ Λ <2LV> 尺工序列' <400> 2
[0051 ] ΛΓ0-? ΙΛ?Π lAKiC'IAm !CilA(j(ir 25 <2\\> 123 <212> DNA <213> Ciwurhita moschata <4.〇0> 3' GGC'ATTTCTG AGAACAGCTT CCTAGTACTT TATTACCATT TCTTGAGAGA GAGAGAGAGA 60 CiAGAGAGAGA CiAGAGA(.iAGA C；ACiAOAOAC.iA UACiATTCTCiC* C'TAC ΛΛΛΛΤΛ GC ATAAC ΤΛΛ 120 CCiT 123 4 <211> 89 <212> DNA 13> Cucurbita mosekata <400> 4 G(.irATTTCn:w\(.iAACAGCTT CTT\GTACTT ΤΛΤΤΛα'ΛΤΤ TCTTGAGAG 60 TTCTGCCTAC AAAATAGCAT AACTAACGT 8：9
【主权项】
1. 用于鉴定砧用南瓜"黄诚根2号"杂交种子纯度的一对SSR引物NG32，其特征在于包括 正向引物：5 ' -GGCAITTCTGAGAACAGCTT-3 '，反向引物：5 ' -ACGTTAGTTATGCTAITTTGTAGGC-3 '。2. -种用于砧用南瓜杂交种"黄诚根2号"种子纯度鉴定的方法，包括如下步骤： 1) 提取南瓜幼苗基因组DNA; 2) 以南瓜基因组DNA为模板，使用权利要求1的SSR引物NG32进行PCR扩增； 3) 对扩增的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4) 对凝胶电泳结果进行分析，只有同时具有父本、母本特异性条带的单株为真正的杂 交种，只有母本特征带而无父本特征带的后代为假杂种或自交种，计算种子纯度。3. 根据权利要求2所述的基于SSR标记的砧用南瓜杂交后代纯度鉴定方法，其特征在 于：所述的PCR扩增的反应总体积为25yL:基因组DNA 1.0yl，25mmol · IZ1MgCl2 2.5μ1， 2.0mmol · L-ΜΝΤΡ 2μ1，NG32 引物 IOymol · L-1 各为 O · 5μ1，Taq 酶O · 2U O · ΙμL，10 X PCR buff er 2 · 5μ1，ddH20补足至25μ1; PCR扩增程序为：94°C预变性5min; 94°C变性30s，57 °C退 火 30s，72°C 延伸 3〇8,30个循环；72°(：延伸1〇1^11，4°(：保存。4. 根据权利要求2所述的基于SSR标记的砧用南瓜杂交种子的纯度鉴定方法，其特征在 于：SSR引物在父本产生123bp的父本特异标记NG32 123，在母本产生89bp的母本特异标记 NG32 89〇
【文档编号】C12Q1/68GK105907869SQ201610381694
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】李凤梅, 崔健, 祝倩倩, 刘素芹, 宋云云, 江志训
【申请人】青岛科技大学, 青岛市农业科学研究院