一种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法
【专利摘要】一种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法，它是利用最大可能数双重PCR（MPN?duplex PCR）方法对水质粪便污染指示菌总大肠菌群和大肠埃希氏菌进行检测。本发明方法简单快速、只需4步实验，检出率比国标多管发酵法更高；特异性强，重复性好，能同时联合定量监测水中活的总大肠菌群和大肠埃希氏菌2种指示菌。本发明为水质粪便污染指示菌总大肠菌群和大肠埃希氏菌快速联合监测提供了一种新的方法。
【专利说明】
一种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细菌的检测方法，尤其涉及一种快速联合监测水质粪便污染指示菌总 大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法。
【背景技术】
[0002] 水质遭受粪便污染后易造成水源性传染病的爆发。由于水中可能存在上百种水源 性病原、病原浓度通常较低、检测方法相对繁琐、耗时、需专业人员、设备和生物安全实验室 等原因，日常监测病原体在绝大数国家，特别是发展中国家很难实际推广应用，主要还是监 测粪便污染指示菌来间接评估水质病原体的污染风险。实际上，每天全球成千上万的水质 评价主要基于测量粪便污染指示菌。大肠菌群和大肠埃希氏菌是最常用于水质粪便污染监 测的指示菌，目前是全世界各个国家水质监测和微生物安全评价的主要监测指标。因此，一 种快速敏感测定水质粪便污染指示菌的方法是监控饮水、娱乐用水和食品生产用水安全的 关键。目前用于检测水质总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法包括缺存试验、多管发酵法、滤 膜法、酶底物法、孔定量盘法、聚合酶链反应(PCR)等多种方法，其中多管发酵法、滤膜法、酶 底物法作为国标法广泛用于水质总大肠菌群和大肠埃希氏菌的日常水质微生物监测。但是 多管发酵法和滤膜法等传统培养方法步骤多、繁琐、耗时(至少3天）、不能同时联合监测2种 及以上指示菌。而PCR方法虽然具有敏感快速检测细菌的特点，但不能定量检测水中多种活 的细菌。因此，PCR方法目前没有用于日常水质粪便污染指示菌总大肠菌群和大肠埃希氏菌 的监测。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于建立一种简单、敏感、特异，且快速同时联合监测水质粪便污染 指示菌活的总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法。
[0004] 本发明目的通过如下技术方案实现：
[0005] -种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法，其特征在于：它是利用最 大可能数双重PCR(MPN-duple X PCR)方法对水质粪便污染指示菌活的总大肠菌群和大肠埃 希氏菌进行检测。
[0006] 优选地说，本发明方法是首先对总大肠菌群和大肠埃希氏菌引物的特异性检测， 再进行水样的多管预培养、细菌DNA的提取、PCR同时扩增总大肠菌群和大肠埃希氏菌特异 性基因等步骤;所述对总大肠菌群和大肠埃希氏菌引物的特异性选择中采用的引物是总大 肠菌群的上游引物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAA CGAGACGTCA3'，扩增的基因长度为264bp;大肠埃希氏菌的上游引物F5' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3'，下游引物R5'ACGCGTGGTTACAGT CTTGCG3'，扩增的基因长度为 147bp〇
[0007] 具体地说，一种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法，具体流程见附 图1，按如下步骤：
[0008] (1)总大肠菌群和大肠埃希氏菌引物的特异性选择:所述引物是总大肠菌群的上 游引物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA3 '，扩 增的基因长度为264bp;大肠埃希氏菌的上游引物F5 ' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3 '，下游引物 R5 ' ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG3 '，扩增的基因长度为 147bp。
[0009] (2)水样的多管预培养:将采集的水样按十倍法稀释，从10°到10-4五个稀释倍数中 取1 Ο*3，1 0-1，1 0-2或1 0-1，1 0-2，1 〇_3三个浓度梯度，每个浓度梯度取lmL水样接种到五支装有预 培养基的试管中，在37°C的恒温培养箱中培养8-18小时，培养液用于提取细菌DNA。
[0010] (3)细菌DNA的提取:细菌DNA的提取采取煮沸法，取1.5mL的多管预培养菌液于离 心管中，在常温下6000r/min离心4min，细菌沉淀物用无菌去离子水洗涤2次，然后将细菌沉 淀物重新悬浮于〇.5mL无菌去离水中。细菌悬液煮沸冻融2次后常温12000r/min离心10min， 上清液用于PCR扩增模板。
[0011] (4)PCR同时扩增总大肠菌群和大肠埃希氏菌特异性基因：将总大肠菌群和大肠埃 希氏菌特异性引物和煮沸法提取的细菌DNA模板4yL到30yL含有1倍缓冲液、0.2mM的四种脱 氧核苷酸、1.5mM的Mg 2+、0.4mM的引物、1.5单位的DNA聚合酶、0.8mg/mL的牛血清白蛋白的 PCR扩增体系中，在PCR扩增仪中按照"94°C变性3分钟，94°C变性30秒、50°C退火30秒、72°C 延伸10秒，共35个循环"的扩增程序对总大肠菌群的特异性lacZ基因和大肠埃希氏菌特异 性uidA结构基因进行同时扩增，10yL扩增产物用1.5%琼脂糖、80V电压电泳检测。总大肠菌 群lacZ基因的特异性已在文献【Bej，A.K.，DiCesare，J.L.Haff，L.and Atlas， R.M. . 1990. Detect ion of col iform bacteria in water by polymerase chain reaction and gene probes.Appl.Environ.Microbiol.56:307_314·】中得到了证明，大肠 埃希氏菌uidA结构基因的特异性已在文献【Bej，A.K.，DiCesare，J.L.Haff，L.and Atlas， R.M..1991.Detection of Escherichia coli and Shigella spp. in water by using the polymerase chain reaction and gene probes for uid.Appl .Environ.Microbiol · 57:1013-1017.】中得到了证明。
[0012] 为了减少两对引物在一个PCR扩增体系互相影响、导致错配、准确率不高、扩增效 率不高的技术问题，对水样稀释浓度、预培养时间、DNA模板提取的细菌培养液用量，PCR扩 增时模板用量、Mg 2+浓度、引物选择和使用浓度、DNA聚合酶浓度、模板变性、退火和延伸时间 等进行一系列试验优化，避免了两对引物间和其它非特异性模板的干扰，并进行了特异性 实验。
[0013] (5)数据处理：分别记录三个浓度梯度预培养试管对应的总大肠菌群和大肠埃希 氏菌PCR阳性试管数，然后根据总大肠菌群和大肠埃希氏菌PCR阳性试管数用最大可能数法 分别查表即可获得水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最大可能活细菌数。
[0014] 本发明具有如下的有益效果：
[0015] 本发明方法简单快速、只需4步实验，检出率比国标多管发酵法更高;特异性强，在 实施例中没有其它干扰条带;重复性好，在实施例中本方法与国标多管发酵法具有显著的 相关性;能同时联合定量监测水中活的总大肠菌群和大肠埃希氏菌2种指示菌;本方法的实 证效果见附图2。本方法在2009年10月到2012年9月3年期间应用于三峡水库水质粪便污染 指示菌总大肠菌群和大肠埃希氏菌的现场监测，并与国标多管发酵法进行了比较研究。结 果发现，所建立的新方法与国标多管发酵法具有显著的相关性，说明本方法应用生产具有 可靠性，比国标多管发酵等方法更简单、敏感、快速，12小时内能同时获得总大肠菌群和大 肠埃希氏菌的监测数据，大大减少了水质粪便污染指示菌总大肠菌群和大肠埃希氏菌监测 时间，有利于对水质粪便污染采取及时有效防控措施。本发明为水质粪便污染指示菌活的 总大肠菌群和大肠埃希氏菌快速联合监测提供了一种新的方法。
【附图说明】
[0016] 图1:本发明方法的流程图。
[0017] 图2:本方法实证效果图;M:DNA标准;泳道1-24为水中活的总大肠菌群和大肠埃希 氏菌2种指示菌;条带264bp为总大肠菌群;条带147bp为大肠埃希氏菌。
[0018] 图3:本方法与国标多管发酵法同时检测200个水样的相关性;横坐标为国际多管 发酵法;纵坐标为本方法。
【具体实施方式】
[0019] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可 以根据上述本
【发明内容】
对本发明做出一些非本质的改进和调整。
[0020] 实施例1
[0021] 2009年10月到2012年9月3年期间从三峡水库万州段5个监测点采集了200个水样。 5个监测点包括一个水厂取水点、城市上游、城市下游和两条支流回水区。2009年10月到 2012年9月间每月用采水器从监测点采集1-2次水样，水样用无菌塑料瓶置于4°C暗箱中立 即运回实验室用本方法和国标多管发酵法进行检测。将采集的水样按十倍法稀释，从10°到 1 0-4五个稀释倍数中取10*3，1 0-1，1 0-2或1 0-1，1 0-2，1 0-3三个浓度，每个浓度梯度取lmL水样接 种到五支装有预培养基的试管中，37°C在普通恒温培养箱中培养8-18小时。取1.5mL多管预 培养菌液于离心管中，常温下6000r/min离心4min，细菌沉淀物用无菌去离子水洗涤2次，然 后将细菌沉淀物重新悬浮于0.5mL无菌去离水中。细菌悬液煮沸冻融2次后常温12000r/min 离心10min，上清液作为DNA模板用于PCR扩增。将总大肠菌群和大肠埃希氏菌特异性引物和 DNA模板加入到OyL含有1倍缓冲液、0.2mM的四种脱氧核苷酸、1.5mM的Mg2+、0.4mM的引物、 1.5单位的DNA聚合酶、0.8mg/mL的牛血清白蛋白的PCR扩增体系，在Bio-rad PTC-200基因 扩增仪(美国伯乐公司）中按照"94 °C变性3分钟，94 °C变性30秒、50 °C退火30秒、72 °C延伸10 秒，共35个循环"的扩增程序进行PCR扩增。扩增产物根据10yL扩增产物用1.5%琼脂糖、80V 电压进行电泳检测，电泳槽和电泳仪为北京六一仪器厂。分别记录三个浓度梯度预培养试 管对应的总大肠菌群和大肠埃希氏菌PCR阳性试管数，然后根据总大肠菌群和大肠埃希氏 菌PCR阳性试管数用最大可能数法分别查表即可获得水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的 最大可能活细菌数。
[0022] 为了验证本方法的简便、快速、准确性定量检测待测水样中的总大肠菌群和大肠 埃希氏菌，用本方法检测的样品同时用生活饮用水标准检验方法微生物指标（GB/ T5750.12-2006)中的国标多管发酵法对水样中的总大肠菌群和大肠埃希氏菌进行平行检 测，所有试剂材料均按国标规定准备。本方法比国标多管发酵法更敏感，200份水样用本方 法和国标多管发酵法同时检测，结果94份水样总大肠菌群检测结果相同、45份水样国标多 管发酵法检测结果更高、59份水样本方法检测结果更高；77份水样大肠埃希氏菌检测结果 相同、38份水样国标多管发酵法检测结果更高、80份水样本方法检测结果更高，见表1。本方 法检测水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的平均浓度要比国标多管发酵法高，见表2。本方 法与国标多管发酵法在同时检测水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌时具有显著的强相关 性，其相关性系数分别为0.88和0.89,见图3。本方法比国标多管发酵法简单、敏感，12小时 能同时获得总大肠菌群和大肠埃希氏菌2种粪便污染指示菌的监测数据，而国标多管发酵 法需要3-4天才能完成总大肠菌群和大肠埃希氏菌的检测。现场验证研究显示本方法是一 种能用于地表水总大肠菌群和大肠埃希氏菌定量联合监测的快速、简单基因检测方法。
[0023] 表1用本方法与国标多管发酵法同时检测水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的比 较
[0024]
[0025] 林两种方法敏感性差异极显著(P<0 · 01)。
[0026] 表2国标多管发酵法与本方法同时监测地表水水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌 的平均浓度
[0027]
[0028] **肉柙万'/云走并显者u义尾恆验），Ρ<υ·(Π 。
【主权项】
1. 一种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法，其特征在于：它是利用最大 可能数双重PCR(MPN-duplex PCR)方法对水质粪便污染指示菌活的总大肠菌群和大肠埃希 氏菌进行同时检测。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:首先对总大肠菌群和大肠埃希氏菌引物的特 异性选择，再进行水样的多管预培养、细菌DNA的提取、PCR同时扩增总大肠菌群和大肠埃希 氏菌特异性基因等步骤;所述对总大肠菌群和大肠埃希氏菌引物的特异性选择中采用的引 物是总大肠菌群的上游引物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA3 '，扩增的基因长度为264bp;大肠埃希氏菌的上游引物F5 ' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3 '，下游引物R5 ' ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG3 '，扩增的基因长度为 147bp〇3. -种快速联合监测总大肠菌群和大肠埃希氏菌的方法，其特征在于，按如下步骤： (1) 总大肠菌群和大肠埃希氏菌引物的特异性选择:所述引物是总大肠菌群的上游引 物F5 ' ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC3 '，下游引物R5 ' GGTTTATGCAGCAACGAGACGTCA3 '，扩增的 基因长度为264bp;大肠埃希氏菌的上游引物F5 ' AAAACGGCAAGAAAAAGCAG3 '，下游引物R5 ' ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG3 '，扩增的基因长度为147bp; (2) 水样的多管预培养:将采集的水样按十倍法稀释，从IOt3到HT4五个稀释倍数中取 lO'HT1，KT2或ΚΓ^ΠΓ2, KT3三个浓度梯度，每个浓度梯度取ImL水样接种到五支装有预培 养基的试管中，在37°C的恒温培养箱中培养8-18小时，培养液用于提取细菌DNA; (3) 细菌DNA的提取:细菌DNA的提取采取煮沸法，取1.5mL的多管预培养菌液于离心管 中，在常温下6000r/min离心4min，细菌沉淀物用无菌去离子水洗涤2次，然后将细菌沉淀物 重新悬浮于〇.5mL无菌去离水中；细菌悬液煮沸冻融2次后常温12000r/min离心10min，上清 液用于PCR扩增模板； (4) PCR同时扩增总大肠菌群和大肠埃希氏菌特异性基因：将总大肠菌群和大肠埃希氏 菌特异性引物和煮沸法提取的细菌DNA模板4yL到30yL含有1倍缓冲液、0.2mM的四种脱氧核 苷酸、1.5mM的Mg 2+、0.4mM的引物、1.5单位的DNA聚合酶、0.8mg/mL的牛血清白蛋白的PCR扩 增体系中，在PCR扩增仪中按照"94°C变性3分钟，94°C变性30秒、50°C退火30秒、72°C延伸10 秒，共35个循环"的扩增程序对总大肠菌群的特异性IacZ基因和大肠埃希氏菌特异性UidA 结构基因进行同时扩增，IOyL扩增产物用1.5%琼脂糖、80V电压电泳检测； (5) 数据处理:分别记录三个浓度梯度预培养试管对应的总大肠菌群和大肠埃希氏菌 PCR阳性试管数，然后根据总大肠菌群和大肠埃希氏菌PCR阳性试管数用最大可能数法分别 查表即可获得水样中总大肠菌群和大肠埃希氏菌的最大可能活细菌数。
【文档编号】C12Q1/06GK105907874SQ201610408358
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】肖国生
【申请人】重庆三峡学院