重组专性厌氧革兰氏阳性菌的制作方法

重组专性厌氧革兰氏阳性菌的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于通过抗TRAIL?R1抗体和抗TRAIL?R2抗体有效地诱导癌细胞死亡，同时减轻对正常细胞的毒性。一种重组专性厌氧革兰氏阳性菌，以可表达状态含有编码融合蛋白质的核酸，该融合蛋白质含有3个以上的抗TRAIL?R1单链抗体和/或3个以上的抗TRAIL?R2单链抗体。
【专利说明】
重组专性厌氧革兰氏阳性菌
技术领域
[0001] 本发明涉及将重组专性厌氧革兰氏阳性菌作为有效成分的抗肿瘤剂和肿瘤检测 用标记物。
【背景技术】
[0002] TRAIL(TNF_related apoptosis-inducing ligand)属于TNF超家族，是对各种癌 细胞诱导细胞死亡(apoptosis细胞凋亡）的蛋白质。TRAIL在生物体内形成三聚体，在细胞 内与具有死亡结构域的TRAIL受体(TRAIL-RUTRAIL-R2)结合。已知TRAIL结合时TRAIL受体 聚集形成三聚体，由此将细胞死亡信号传导到细胞内。已知TRAIL的受体除了上述TRAIL-尺1、了1^11^-1?2以外，还有了1^11^-1?31^11^-1?4和属于可溶性受体的骨保护素（图1) (^1^11^-R3、TRAIL-R4和骨保护素完全或部分地缺失死亡结构域，这些受体即使结合TRAIL也不诱导 细胞死亡，因此称为诱饵受体。
[0003] TRAIL由于在正常细胞中不易引起细胞死亡，因此作为抗肿瘤药正在进行开发。然 而，为了利用TRAIL对癌细胞有效地诱导细胞死亡，需要开发不与上述诱饵受体结合，有效 地与TRAIL-R1和TRAIL-R2结合，向细胞内传导细胞死亡信号的系统。对TRAIL-R1和TRAIL-R2的激动性(agon i s t)抗体由于不与上述诱t耳受体结合，所以能够比TRAIL更有效地诱导细 胞死亡，且血中的半衰期长，因此能够延长给药间隔。因此，这些抗体现在处于临床阶段(非 专利文献 1)。然而，HGS-ETR1 (抗 hTRAIL(人 TRAIL)-R1 激动性抗体)和 HGS-ETR2(抗 hTRAIL-R2激动性抗体)是二价的，因此在没有具有Fc受体的NK细胞、巨噬细胞所致的抗体的交联的 情况下，无法诱导TRAIL受体形成三聚体（图2a)。因此，存在这些抗体在临床试验中没有体 现显著的治疗效果的问题(非专利文献2)。
[0004] 作为在NK细胞、巨噬细胞不参与的情况下能够直接使癌细胞膜上的hTRAIL-R2分 子凝聚来传导细胞死亡信号的强效激动性抗体，已知有HGS-TR2J(KMTR2)(非专利文献3) (图2b)。另外，也已知针对hTRAIL-R2的美洲驼单链VHH抗体的3~5聚体在NK细胞、巨噬细胞 不参与的情况下对表达hTRAIL-R2的癌细胞非常强效地诱导细胞死亡（专利文献1)(图3)。 另一方面，认为hTRAIL-Rl和hTRAIL-R2不仅在癌细胞中表达，也在各种人正常组织中表达， 特别是人正常肝细胞对hTRAIL、抗hTRAIL-R激动性抗体是敏感性的（非专利文献4和非专利 文献5)，因此hTRAIL-R激动性抗体作为副作用引起肝损伤。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献 1:PCT W0/2011/098520
[0008] 非专利文献
[0009] 非专利文献l:Ghobrial等，2005，CA Cancer J Clin. ,55(3)，ρρ· 178-194
[0010] 非专利文献2:Micheau等，2013，Br J Pharmacol. ,169(8)，ρρ· 1723-1744
[0011] 非专利文献3:Motoki等，2005，Clin Cancer Res. ,11(8)，ρρ·3126-3135
[0012] 非专利文献4:加等，2000，恥七]^(1.，6(5)4口.564-567
[0013] 非专利文献5:Mori等，2004，Cell Death Differ. ,11(2)，ρρ·203-207

【发明内容】

[0014] 本发明的目的在于通过抗TRAIL-R1抗体和抗TRAIL-R2抗体有效地诱导癌细胞死 亡，同时减少对正常细胞的毒性。
[0015] 本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果首次发现制作双歧杆菌，通过 该重组双歧杆菌的静脉给药能够诱导肿瘤局部的癌细胞死亡，所述双歧杆菌表达、分泌具 有强效激动剂活性的抗hTRAIL-R2VHH抗体。另外，本发明人取得了能够识别癌细胞膜上的 hTRAIL-Rl分子的新型抗hTRAIL-RIVHH抗体。根据本发明，通过肿瘤部位局部给予具有强效 激动剂活性的抗hTRAIL-Rl和抗hTRAIL-R2抗体，能够减少对正常细胞的毒性，并且有效地 诱导癌细胞死亡。
[0016] 本发明基于该研究结果而完成，具体提供以下发明。
[0017] (1) -种重组专性厌氧革兰氏阳性菌，以可表达状态含有编码融合蛋白质的核酸， 该融合蛋白质含有信号肽以及3个以上的抗TRAIL-R1单链抗体和/或3个以上的抗TRAIL-R2 单链抗体。
[0018] (2)根据（1)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，专性厌氧革兰氏阳性菌为 双歧杆菌属(Bifidobacterium) 〇
[0019] (3)根据(1)或(2)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，对于抗TRAIL-R1单链 抗体，
[0020] ⑶R1含有由序列号22表示的氨基酸序列，
[0021 ] ⑶R2含有由序列号23表示的氨基酸序列，和
[0022]⑶R3含有由序列号24表示的氨基酸序列。
[0023] (4)根据（1)~（3)中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，对于抗 TRAIL-R2单链抗体，
[0024]⑶R1含有由序列号15表示的氨基酸序列，
[0025] ⑶R2含有由序列号16表示的氨基酸序列，和
[0026] ⑶R3含有由序列号17表示的氨基酸序列。
[0027] (5)根据（1)~(4)中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，上述融合蛋 白质进一步含有功能性肽。
[0028] (6)根据(5)所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，功能性肽为标记蛋白质。
[0029] (7)-种抗肿瘤剂，将（1)~(6)中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌作为 有效成分。
[0030] (8)-种抗 TRAIL-R1 抗体，其中，
[0031]⑶R1含有由序列号22表示的氨基酸序列，
[0032] ⑶R2含有由序列号23表示的氨基酸序列，和
[0033]⑶R3含有由序列号24表示的氨基酸序列。
[0034]本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请2014-003441号的说明 书和/或附图中记载的内容。
[0035]根据本发明，通过肿瘤部位局部给予具有强效激动剂活性的抗hTRAIL-Rl抗体和 抗hTRAIL-R2抗体，能够减少对正常细胞的毒性，并且有效地诱导癌细胞死亡。
【附图说明】
[0036]图1是TRAIL及其受体的结构和诱导细胞死亡的信号传导的简图。
[0037]图2是表示对TRAIL-R的通常抗体a和具有激动剂活性的抗体b的细胞死亡信号的 细胞内传导的差异的简图（通常抗体的情况下，介由TRAIL的细胞凋亡需要NK细胞、巨噬细 胞c所致的交联。KMTR2抗体的情况下，介由TRAIL的细胞凋亡不需要NK细胞、巨噬细胞所致 的交联）。
[0038]图3是表示单链VHH抗体的3~5聚体(该图中为VHH4)在没有NK细胞、巨噬细胞所致 的交联的情况下对表达hTRAIL-R的癌细胞诱导细胞凋亡的简图。
[0039] 图 4 表示纯化 hTRAIL-Rl:Fc(a)、hTRAIL-R2:Fc(b(l)WPmTRAILQJntTRAIL)-R2: Fc (b (2))的SDS-PAGE (SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）图像。
[0040] 图5表示纯化后的4E6单体的SDS-PAGE图像。箭头表示4E6单体。
[0041 ] 图6表示由ELISA得到的4E6单体对hTRAIL-R2: Fc抗原的结合活性的测定结果。 [0042] 图7表示由Biacore X-100得到的4E6单体与hTRAIL-R2:Fc抗原的解离常数的测定 结果。
[0043]图8表示纯化后的4P6单体的SDS-PAGE图像。
[0044]图9表示由ELISA得到的4P6单体和4E6单体的结合特异性的解析结果。
[0045] 图10表示由Biacore X-100得到的4P6单体与hTRAIL-Rl :Fc抗原的解离常数的测 定结果。
[0046] 图11表示4P6单体和4E6单体的拮抗活性。
[0047] 图12是在大肠杆菌中表达的4E6二聚体Toxin(a)、4E6二聚体EGFP(b)和4E6四聚体 (c)的基因结构的示意图。
[0048] 图13表示纯化的大肠杆菌表达重组蛋白质(a: 4E6二聚体Toxin、b: 4E6二聚体EGFP 和c: 4E6四聚体）的SDS-PAGE图像。
[0049] 图14表示重组蛋白质（a: 4E6二聚体Toxin和4E6二聚体EGFP以及b: 4E6单体和4E6 四聚体)对人大肠癌细胞C〇1〇205细胞的细胞死亡诱导活性。
[0050] 图15表示利用4E6二聚体EGFP的癌细胞(a:Colo205细胞和b:BxPC-3细胞）的荧光 染色。纵轴表示细胞数，横轴表示4E6二聚体EGFP的荧光强度。
[0051 ] 图16表示在大肠杆菌中表达的抗hTRAIL-R2VHH抗体四聚体(4E6四聚体)对人大肠 癌细胞C〇1〇205细胞(a)和胰腺癌细胞BxPC-3细胞(b)的细胞死亡诱导作用。
[0052] 图17表示由双歧杆菌培养上清液lmL纯化而得的4E6四聚体和4E6二聚体EGFP的 SDS-PAGE图像。4E6四聚体显示3克隆的结果，4E6二聚体EGFP显示2克隆的结果。
[0053] 图18表示由双歧杆菌培养上清液纯化而得的4E6四聚体(4E6四聚体)对C〇1〇205细 胞的癌细胞死亡诱导活性。
[0054]图19表示移植了C〇1〇205细胞的裸小鼠中的分泌4E6四聚体的双歧杆菌的抗肿瘤 效果。肿瘤体积以mm3计，由平均值+标准误差(η = 6)表示。
[0055]图20表示在移植了C〇1〇205细胞的裸小鼠中给予分泌4Ε6四聚体的双歧杆菌时的 体重变化。体重由平均值+标准偏差(η = 6)表示。
[0056]图21表示移植了 BxPC-3细胞的裸小鼠中的分泌4E6四聚体的双歧杆菌的抗肿瘤效 果。肿瘤体积以mm3计，由平均值+标准误差(η = 6)表示。
[0057]图22表示在移植了BxPC-3细胞的裸小鼠中给予分泌4Ε6四聚体的双歧杆菌时的体 重变化。体重由平均值+标准偏差(η = 6)表示。
[0058]图23表示纯化的大肠杆菌表达重组蛋白质(4Ρ6三聚体)的SDS-PAGE图像。
[0059] 图24表示在大肠杆菌中表达的抗hTRAIL-RIVHH抗体三聚体(4Ρ6三聚体)对人大肠 癌细胞C〇1〇205细胞的细胞死亡诱导作用。
[0060]图25表示由双歧杆菌培养上清液纯化而得的4P6三聚体的SDS-PAGE图像。
[00611图26表示由双歧杆菌培养上清液纯化而得的抗hTRAIL-RIVHH抗体三聚体(4P6三 聚体)对人大肠癌细胞C010205细胞(a)和胰腺癌细胞BxPC-3细胞(b)的细胞死亡诱导作用。 [0062] 图27表示移植了 BxPC-3-Luc#2细胞的裸小鼠中的分泌4P6三聚体的双歧杆菌的抗 肿瘤效果。肿瘤体积以mm3计，由平均值+标准误差(n = 5)表示。
[0063] 图28表示在移植了 BxPC-3-Luc#2细胞的裸小鼠中给予分泌4P6三聚体的双歧杆菌 时的体重变化。体重由平均值+标准误差(η = 5)表示。
【具体实施方式】
[0064]以下对本发明进行具体说明。
[0065] 1.重组专性厌氧革兰氏阳性菌
[0066] 1-1.概要和定义
[0067] 本发明的第1方式为重组专性厌氧革兰氏阳性菌（以下，通常简称为"重组细菌"）。 本发明的重组细菌是以可表达状态含有编码融合蛋白质的核酸的药剂递送载体。
[0068] "专性厌氧革兰氏阳性菌"是指被分类为革兰氏阳性菌的专性厌氧菌。在此，"专性 厌氧菌"也被称为严格厌氧菌，是具有在高氧存在下不能增殖而灭绝的性质的细菌。因此， 在哺乳动物的体内，可以在低氧下在厌氧状态的消化器官内、主要在肠内增殖，但在存在溶 解氧的血液等体液中、通常的组织内无法增殖。"革兰氏阳性菌"是指通过革兰氏染色被染 成紫色或藏青色的细菌的通称。革兰氏阳性菌已知有杆菌、球菌、螺旋菌，但在本说明书中 没有特别限定。由于革兰氏阳性菌不含有内毒素(Endotoxin)，因此死后也不释放出内毒 素。因此，从安全性方面考虑，优选作为本发明的药剂递送载体。作为本发明的重组细菌，例 如双歧杆菌属(Bifidobacterium)(本说明书中，以下将双歧杆菌属总称为"双歧杆菌"）、梭 菌属（(：1〇^4(111 1111)可以符合。优选为双歧杆菌。这是由于双歧杆菌不分泌外毒素 (Exotoxin)，且日常被用作乳酸菌，对人体等的安全性得到确认。双歧杆菌可以是任意的种 类，但优选生活在人的肠道内的种类，具体而言为双叉双歧杆菌(B.bifidum)、长双歧杆菌 (B . Ion gum)、短双歧杆菌（B.brave)、婴儿双歧杆菌（B.inf antis)和青春双歧杆菌 (B.adolescentis)〇
[0069] 1-2.构成
[0070] 本发明的专性厌氧革兰氏阳性菌以可表达状态含有编码融合蛋白质的核酸（以 下，通常称为"融合基因"）。以下，对表征本发明的重组细菌的融合基因和使其为可表达状 态的表达盒的构成进行具体说明。
[0071] 1-2-1.融合基因的构成
[0072] 在本说明书中"编码融合蛋白质的核酸(融合基因)"是指利用基因重组技术融合 多个基因等构建的、编码融合蛋白质的外源性核酸。融合基因以被插入到后述的表达盒内 的状态被导入到本发明的重组细菌内。
[0073] 本说明书中"融合蛋白质"是指含有信号肽、3个以上的单链抗体和任意的功能性 肽并将它们连接而成的细胞外分泌性蛋白质。信号肽、单链抗体和功能性肽可以直接连接， 也可以介由连接肽间接地连接。连接肽的长度和氨基酸序列只要不阻碍单链抗体和功能性 肽各自的功能，就没有特别限定。例如，优选20个氨基酸以下或15个氨基酸以下不自折叠的 氨基酸序列等。作为本发明中使用的连接肽，例如可举出IE G RM D连接肽（序列号2 7)和 (GGSGG)2连接肽(序列号28)。以下，对构成融合蛋白质的信号肽、单链抗体和功能性肽进行 具体说明。
[0074] (1)信号肽
[0075] 信号肽是细胞内生物合成的蛋白质向细胞外转移所必需的肽。通常，在N末端侧配 置Lys和Arg这样具有正电荷的氨基酸，与其连接地配置Ala、Leu、Val、lie、Val和Phe这样疏 水性高的氨基酸序列。另外，在信号肽的C末端侧，可以具有促进信号肽的切割和分泌的信 号序列后插入序列和/或包含从融合蛋白质中切割信号肽的信号肽酶识别部位的氨基酸序 列。信号肽担负将在本发明的细菌内表达的上述融合蛋白质介由存在于膜的转位因子等分 泌到细胞外的功能。信号肽的氨基酸序列没有特别限定。可以利用能够在专性厌氧革兰氏 阳性菌内发挥功能的公知的所有信号序列的氨基酸序列。另外，信号肽的氨基酸长度也没 有特别限定。通常在3个氨基酸~60个氨基酸的范围内即可。但是，为了防止融合蛋白质的 分子量过大，优选氨基酸长度短的信号肽。
[0076] 信号肽配置于融合蛋白质的N末端侧。
[0077] (2)单链抗体
[0078] 上述融合蛋白质包含3个以上的单链抗体。本说明书中"单链抗体"是指由单链多 肽构成、且能够单独识别靶物质并结合的抗体。这是因为由两条链以上构成的抗体由于分 子量过大，因此在专性厌氧革兰氏阳性菌内不表达的可能性、构建不出具有抗体功能的适 当的立体结构的可能性高。因此，本发明的单链抗体优选为每1个的分子量为35kDa以下的 低分子抗体。天然抗体和人工抗体不限。
[0079] 本发明的单链抗体典型的是由互补性决定区（CDR)和框架区(FR)所组成的可变区 而构成。互补性决定区是显示可变性、对抗体赋予结合特异性的区域。另一方面，框架区是 可变区的相对保守的部分。完整的可变结构域包括由3个CDR连接的4个FR。3个CDR从其N末 端依次被称为CDR1、CDR2和CDR3，4个FR从其N末端依次被称为FR1、FR2、FR3和FR4。因此，在 可变区内，上述CDR和FR从氨基酸末端到羧基末端方向按照FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 和FR4的顺序排列。
[0080] 本说明书中"天然抗体"是指具有与任意一种脊椎动物产生的抗体相同的氨基酸 序列的抗体。作为天然抗体的单链抗体的具体例，例如可举出骆驼科的动物产生的单链抗 体(Hamers-Casterman C.，et al.，1993，Nature 363:446-448)(以下，本说明书中称为"胳 驼科单链抗体"）。骆驼科单链抗体是没有L链而仅由Η链构成的抗体，能仅以Η链的V H区域与 抗原结合，因此分子量约为14kDa，仅为通常的抗体的十分之一左右。另外，一般具有抗原亲 和性高，对热、酸和碱的耐性高的性质（Deffar，K.，et al.，2009，African Journal of Biotechnology 8(12):2645-2652)。因此，作为本发明中的单链抗体非常适合。骆驼科的动 物物种只要能够产生骆驼科单链抗体，则其种类不限。例如，也可以利用来自美洲驼、羊驼、 骆驼等任一动物物种的抗体。
[0081] 本说明书中"人工抗体"是指人工构建的抗体。例如除在上述天然抗体的氨基酸序 列中导入适当变异的单链抗体以外，还可举出自然界中原则上不存在的进行了结构上的改 变的单链抗体。作为这样的人工抗体的具体例，可举出嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv (scFv:single chain Fragment of variable region)(Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995，Pierce Chemical C。·，Rockford, IL)、双链抗体（diabody)、三链抗体 (tr iabody)或四链抗体(tetrabody)等。
[0082] "嵌合抗体"是指抗体分子的可变区和恒定区分别来自不同种类的动物的抗体。嵌 合抗体的制作可以使用公知的方法进行，例如可以如下得到，即通过将编码抗体V区域的核 酸和编码人抗体C区域的核酸连接，将其整合到表达载体并导入宿主而产生。
[0083] "人源化抗体"是指也被称为重构(reshaped)人抗体的修饰抗体。人源化抗体通过 将来自免疫动物的抗体的CDR移植到人抗体的互补性决定区而构建。还已知其一般的基因 重组技术。
[0084]单链Fv是具有在免疫球蛋白分子中将位于L链和Η链的可变区（即，分别为I和Vh) 通过足够长的柔软性接头连接而包含于1跟多肽链的结构的、分子量约35kDa以下的合成抗 体。单链Fv内的两个可变区可以相互自集合而形成一个功能性抗原结合部位。
[0085]上述融合蛋白质中，单链抗体为了使TRAIL聚集形成三聚体而必须含有3个以上。 但是，抗体数变多时，融合蛋白质的分子量变大，因此通常优选数个，例如3~6个、3~5个或 3~4个。各个单链抗体优选由适当的连接肽连接。连接肽的长度、氨基酸序列只要不阻碍各 个单链抗体的抗原结合活性，就没有特别限定。
[0086] 上述融合蛋白质含有3个以上识别相同抗原的单链抗体。例如，将hTRAIL-R1作为 抗原时，上述融合蛋白质均含有3个以上识别相同的hTRAIL-Rl的单链抗体。
[0087] 本发明中，抗体的"价"是指1分子抗体所具有的抗原结合部位的个数。例如，IgG是 1分子中具有2个抗原结合部位的2价的抗体。上述单链抗体是每1分子具有1个抗原结合部 位的1价的抗体。本发明的融合蛋白质由于含有3个以上的单链抗体，因此整体为3价以上。
[0088] 单链抗体只要在融合蛋白质中是信号肽的C末端侧，则与后述的功能性肽的顺序 就没有特别限制，但优选配置于功能性肽的N末端侧。
[0089]本发明中的单链抗体的靶物质为TRAIL-R1或TRAIL-R2。如上所述本发明的重组细 菌仅能在厌氧环境下增殖，因此在生物体内成为厌氧环境下的细胞适合作为靶细胞。具体 而言，作为适合的靶细胞，可举出肿瘤细胞或肠道上皮细胞。以下，对抗TRAIL-R1抗体和抗 TRAIL-R2抗体进行具体说明。
[0090] (i)抗TRAIL-R1 抗体
[0091] 本发明中，"抗TRAIL-R1 单链抗体"是指针对TRAIL-R1 (TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1，TRAIL 受体 1) 的单链抗体。本发明中使用的抗 TRAIL-R1 单链 抗体只要与TRAIL-R1特异性结合，就没有特别限定。作为可在本发明中使用的抗TRAIL-R1 单链抗体，例如可举出在本说明书的实施例中取得并使用的4P6。4P6是来自羊驼的单链VHH 抗体，CDR1含有由序列号22表示的氨基酸序列，CDR2含有由序列号23表示的氨基酸序列，以 及CDR3含有由序列号24表示的氨基酸序列。本发明中使用的抗TRAIL-R1单链抗体的框架区 的序列没有特别限定，但例如可以使用Maass D.R.，et al·，2007, J Immunol Methods. 324:13-25中记载的羊§它单链抗体(例如，上述文献中记载的Clone A02)的框架区 的序列。因此，抗TRAIL-R1单链抗体没有限定，但例如FR1可以含有由序列号18表示的氨基 酸序列，FR2可以含有由序列号19表示的氨基酸序列，FR3可以含有由序列号20表示的氨基 酸序列和FR4可以含有由序列号21表示的氨基酸序列。
[0092]本发明中使用的融合蛋白质特别优选具有与TRAIL-R1结合而诱导细胞凋亡的激 动剂活性。TRAE-R1通过聚集成三聚体以上来诱导细胞凋亡，因此为了使TRAE-R1活化，上 述融合蛋白质如上所述特别优选含有3个以上、4个以上、5个以上或6个以上例如3个、4个、5 个或6个的抗TRAIL-R1单链抗体。
[0093]作为本发明的一个方式，可举出⑶R1含有由序列号22表示的氨基酸序列、CDR2含 有由序列号23表示的氨基酸序列和CDR3含有由序列号24表示的氨基酸序列的抗TRAIL-R1 抗体。该抗体的框架区的序列没有特别限定，但例如可以使用上述的Maass D.R的文献中记 载的序列，因此，FR1可以含有由序列号18表示的氨基酸序列，FR2可以含有由序列号19表示 的氨基酸序列，FR3可以含有由序列号20表示的氨基酸序列和FR4可以含有由序列号21表示 的氨基酸序列。为了使TRAIL-R1活化，优选该抗体为3价以上。另外，该抗体可以为如上所述 的人工抗体，例如嵌合抗体或人源化抗体。
[0094] 对TRAIL-R1的激动性抗体介由TRAIL-R1诱导细胞凋亡，因此本发明的抗体可以用 作细胞凋亡诱导剂。
[0095] (ii)抗TRAIL-R2 抗体
[0096] 本发明中，"抗TRAIL-R2单链抗体"是指针对TRAIL-R2(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 2，TRAIL受体2)的单链抗体。本发明中使用的抗TRAIL-R2单链 抗体只要与TRAIL-R2特异性结合，就没有特别限定。作为本发明中使用的抗TRAIL-R2单链 抗体，例如，可举出上述文献W02011 /098520中记载的4E6。4E6为美洲驼单链VHH抗体，其 CDR1含有由序列号15表示的氨基酸序列，CDR2含有由序列号16表示的氨基酸序列和CDR3含 有由序列号17表示的氨基酸序列。
[0097] 本发明中使用的融合蛋白质特别优选具有与TRAIL-R2结合而诱导细胞凋亡的激 动剂活性。TRAIL-R2通过聚集成三聚体以上来诱导细胞凋亡，因此为了使TRAIL-R2活化，上 述融合蛋白质如上所述特别优选含有3个以上、4个以上、5个以上或6个以上例如3个、4个、5 个或6个的抗TRAIL-R2单链抗体。
[0098] 针对TRAIL-R2的激动性抗体介由TRAIL-R2诱导细胞凋亡，因此本发明的抗体可以 用作细胞凋亡诱导剂。
[0099] (3)功能性肽
[0100]上述融合蛋白质中任意含有功能性肽。本说明书中"功能性肽"是指在生物体内或 细胞内具有特定的生物活性例如酶活性、催化活性、作为底物的功能或生物学抑制或增强 功能（例如，细胞毒活性）的肽。具体而言，例如可举出荧光蛋白质或发光蛋白质、酶或外毒 素。
[0101 ]功能性肽的来源生物物种不限。另外，功能性肽可以为天然型或非天然型中的任 一种。天然型的功能性多肽是指自然界中存在的肽。另一方面，非天然型的功能性多肽是指 基于天然型的功能性多肽的氨基酸序列，在不丧失该功能性肽具所有的特有的功能的范围 内，在氨基酸序列中导入了适当变异(进行了氨基酸的添加、缺失、取代的变异)的修饰肽。
[0102] 上述融合蛋白质中可以含有2个以上功能性肽。但是，含有多个功能性肽的情况 下，由于融合蛋白质整体的分子量过大，因此可以将功能性肽的总分子量设为80kDa以下， 优选设为40kDa以下。包含2个以上功能性肽的情况下，各个功能性肽的种类可以相同也可 以不同。例如可举出将外毒素与酶或者外毒素与荧光蛋白质或发光蛋白质组合而成的功能 性肽。包含2个以上功能性肽的情况下，各个功能性肽可以直接连接，但优选以各个功能性 肽能够有效地发挥独自的功能的方式用适当的连接肽连接。连接肽的长度、氨基酸序列只 要不阻碍功能性肽的功能，就没有特别限定。通过在1个融合蛋白质中包含2个以上的不同 的功能性肽，能够对单链抗体所识别的靶物质赋予不同的功能。
[0103] 功能性肽只要在融合蛋白质中在信号肽的C末端侧，就没有特别限制，但优选配置 于上述单链抗体的C末端侧。
[0104] 以下，对在本发明的重组细菌中可以作为功能性肽起作用的上述的荧光蛋白质或 发光蛋白质、酶、或者外毒素进行具体说明。
[0105] (i)焚光蛋白质或发光蛋白质(标记蛋白质）
[0106] 对于作为功能性肽的荧光蛋白质的种类，只要碱基序列已知，就没有特别限定。可 以为上述天然型和非天然型中的任一种。但是，出于上述理由优选氨基酸长度短的荧光蛋 白质。另外，激发波长、荧光波长也没有特别限定。这些波长根据情况和需要而适当地选择 即可。作为具体的荧光蛋白质，例如可举出CFP、RFP、DsRed、YFP、PE、PerCP、APC、GFP等。
[0107] 另外，对于发光蛋白质，也是只要碱基序列已知，其种类就没有特别限定。与上述 荧光蛋白质同样，可以为天然型和非天然型中的任一种，但优选氨基酸长度短的发光蛋白 质。作为具体的发光蛋白质，例如可举出水母发光蛋白等。
[0108] (ii)酶
[0109] 对于作为功能性肽的酶的种类，只要碱基序列已知，就没有特别限定。可以为与靶 物质直接作用的酶，也可以是不与靶物质直接作用而在其周边发挥功能的酶。作为后者的 具体例，可举出有助于发光的荧光素酶、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)等。在上述单 链抗体上连接有酶的融合蛋白质可以作为免疫酶(Immunoenzyme)发挥功能。
[0110] (iii)外毒素
[0111] "外毒素"（Exotoxin)是指细菌分泌到菌体外的毒性蛋白质。外毒素只要具有细胞 毒活性且其碱基序列已知，则其种类不限。例如可举出绿脓杆菌毒素 (Pseudomonas toxin; PT)及其衍生物例如从PT除去了细胞粘接结构域的外毒素 A、白喉毒素 (Diphtheria toxin: DT)及其衍生物以及蓖麻毒素（Ricin)及其衍生物（Brinkmann U.&Pastan 1.,1994, Biochimica et Biophysica Acta，1198(l):27_45)。已知绿胺杆菌外毒素 A被摄入到癌细 胞内后，通过对EF-2进行ADP核糖基化而失活来抑制蛋白质合成，发挥较强的杀灭细胞效 果。在上述单链抗体上连接有外毒素的融合蛋白质可以作为免疫毒素（Immunotoxin)发挥 功能。
[0112] 1-2-2.表达盒的构成
[0113] 本说明书中"表达盒"是指含有上述融合基因并处于能够将该融合基因作为融合 蛋白质表达的状态的表达系统。本说明书中，"能表达的状态"是指以该表达盒中含有的融 合基因能够在重组细菌内表达的方式配置在基因表达所需要的元件的控制下的状态。基因 表达中需要的元件可举出启动子和终止子。
[0114] 启动子只要是能够在重组细菌内工作的启动子，就没有特别限制，但优选来自使 用的专性厌氧革兰氏阳性菌的启动子。例如，专性厌氧革兰氏阳性菌使用双歧杆菌的长双 歧杆菌的情况下，可举出长双歧杆菌的hup基因启动子(序列号25)。另外，启动子中根据其 表达控制的性质，已知有过表达型启动子、组成型启动子、位点特异性启动子、阶段特异性 启动子或诱导型启动子等。本发明中的表达盒中使用的启动子是哪一种启动子，没有特别 限定。根据需要适当地选择即可。优选为过表达型启动子或组成型启动子。在上述表达盒 中，启动子配置在上述融合基因的起始密码子的上游的5'侧。
[0115] 终止子只要是能够在重组细菌内终结由上述启动子转录的基因的转录的序列，就 没有特别限定。例如，可举出组蛋白那样的蛋白质终止子(HUT)(序列号26)。优选来自与启 动子相同的生物物种的终止子，更优选在启动子的来源生物物种的基因组的基础上与该启 动子成组的终止子。在上述表达盒中，终止子配置在上述融合基因的终止密码子的下游的 3,侧。
[0116] 为了使上述融合蛋白质在重组细菌内稳定地表达，可以将包含表达盒的载体作为 表达载体导入该菌体内。或者，也可以介由同源性重组而插入到该菌的基因组内。使用表达 载体的情况下，载体可以使用质粒等。载体使用含有能够在本发明的重组细菌内复制且在 菌体内稳定地保持的适当的选择标记基因的载体。载体可以是在大肠杆菌等其他细菌内也 能够复制的穿梭载体。例如可举出pKKT427、pBESAF2、pPSABl等。插入到重组细菌的基因组 内的情况下，可以仅将融合基因以成为可表达状态的方式插入到重组细菌的基因组中。即， 可以在重组细菌的内源性的启动子、终止子的控制下插入融合基因。
[0117] 表达盒可以是在1个表达盒内含有1个融合基因的单顺反子，也可以是含有2个以 上融合基因的多顺反子。
[0118] 1-3.重组专性厌氧革兰氏阳性菌的制造方法
[0119] 本发明的重组细菌可以使用该领域中公知的分子遗传学的方法来制造。例如，如 果为上述融合基因，则使用例如Green and Sambrook,Molecular Cloning,4th Ed(2012), Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubelet al. , Short Protocols in Molecular Biology，3rd Ed·，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology( 1995)，John Wiley&Sons所记载的方法构建分别编码信号肽和单链抗 体的核酸即可。
[0120] 为了取得上述单链抗体，可以使用编码与TRAIL-R1或TRAIL-R2结合的抗体的基因 的碱基序列信息。该抗体的碱基序列信息例如可以参照前述的CDR和FR的碱基序列。
[0121] 重新制作针对TRAIL-R1或TRAIL-R2的抗体的情况下，针对TRAIL-R1或TRAIL-R2的 单克隆抗体的制作根据在该领域内公知的方法进行即可。以下例示该制作例。
[0122] 将作为靶的TRAIL-R1或TRAIL-R2的细胞外结构域作为免疫原，给予骆驼科的动物 而进行免疫。如果需要，可以添加佐剂以有效地进行免疫。作为佐剂的例子，可举出市售的 弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)等，可以将它们单独使用或混合使用。免疫原溶 液的1次给药量是相当于每1只上述动物含有约50~200yg的免疫原即可。免疫的间隔没有 特别限定，初次免疫后，以几天到几周间隔、优选以1~4周间隔进行2~10次、优选5~7次追 加免疫。初次免疫之后，利用ELISA(Enzyme_Linked Immuno Sorbent Assay)法等反复进行 免疫动物的血清中的抗体效价的测定。接着，从免疫的动物采取抗体产生细胞。作为抗体产 生细胞，可举出脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞等，优选末梢血细胞。接下来，从末梢血 细胞提取RNA，使用寡聚dT引物和无规6mer引物合成cDNA。从该cDNA通过PCR扩增骆驼科单 链抗体的可变区（V.区域）的基因，在pCANTAB6(McCafferty J.，et al.，1994， Appl.Biochem.Biotech. ,47,157-173)等噬菌粒载体上整合上述基因，用电穿孔法导入到 大肠杆菌TG1中。使M13K07辅助噬菌体感染上述的大肠杆菌TG1，回收噬菌体，由此取得骆驼 科单链抗体可变区(Vhh区域)表达噬菌体文库。标准地成为1 X 107pfu种以上的文库。
[0123] 为了挑选表达针对靶抗原的抗体的噬菌体而进行生物淘选。上述生物淘选为如下 方法:使抗体噬菌体文库与固定化的靶抗原反应，通过清洗将未结合的噬菌体除去后，使结 合的噬菌体洗脱并感染大肠杆菌而增殖，将上述操作进行3次至5次，由此浓缩相对于靶抗 原为特异性的噬菌体。使淘选的噬菌体再次感染大肠杆菌TG1后，将含有插入有V HH的 pCANTAB噬菌粒载体的TG1克隆分离，在各个TG1克隆中感染K07辅助噬菌体，得到展示Vhh抗 体的克隆化噬菌体。从其中选择与抗原反应的克隆。可以从取得的噬菌体中得到抗体的碱 基序列。
[0124] 融合基因使用分子遗传学的方法以可表达的方式被插入上述表达盒内。表达盒根 据需要而整合到例如质粒等载体中。为了在载体中整合表达盒，可以采用以适当的限制酶 切割表达盒的5 '末端和3'末端，在载体内的多克隆位点等对应的限制部位插入的方法等。 另外，载体是在本发明的重组细菌内可表达的表达用载体的情况下，也可以通过将上述融 合基因插入到该表达用载体的表达控制区域内（载体内的启动子和终止子间的多克隆位点 等），与构建表达盒的同时构建目标表达载体。关于这些具体的方法，例如请参照上述Green and Sambrook(2012)中记载的方法。
[0125] 目标重组细菌可以通过将上述表达载体、表达盒或融合基因导入到作为药剂递送 载体的专性厌氧革兰氏阳性菌中来制造。将表达载体等向目标专性厌氧革兰氏阳性菌内导 入的方法使用该领域内公知的分子生物学方法即可。例如可以使用电穿孔法 (e 1 ectroporation法）、磷酸钙法这样的公知的方法。关于这些具体的方法，例如请参考上 述Green and Sambrook(2012)中记载的方法。
[0126] 2.抗肿瘤剂
[0127] 2-1.概要
[0128] 本发明的第2方式为抗肿瘤剂。本发明中"抗肿瘤剂"是指对肿瘤细胞具有细胞毒 活性，使该细胞达到细胞凋亡，结果能够抑制肿瘤细胞的增殖的药剂。但是，其药效只要能 够抑制肿瘤细胞的增殖即可，可以不根除肿瘤细胞。
[0129] 本发明的抗肿瘤剂的特征在于将第1方式的重组细菌作为有效成分。根据本发明 的抗肿瘤剂，通过作为有效成分的重组细菌仅在肿瘤内增殖，在肿瘤内分泌3个以上的抗 TRAIL-R1单链抗体和/或3个以上的抗TRAIL-R2单链抗体，能够有效地诱导肿瘤的细胞凋 亡，使肿瘤萎缩。
[0130] 2-2.构成
[0131] 本发明的抗肿瘤剂如上所述将第1方式的重组细菌作为有效成分。此时的重组细 菌的融合基因编码如下单链抗体，即识别并结合TRAIL-R1的单链抗体和/或识别并结合 TRAIL-R2的单链抗体，TRAIL-R1和TRAIL-R2都是作为靶细胞的肿瘤细胞的表面抗原中的一 种。因此，作为本发明的抗肿瘤剂的有效成分的重组细菌分泌细胞外分泌性抗肿瘤细胞融 合蛋白质。
[0132] 成为本发明的抗肿瘤剂的靶标的肿瘤只要是表达TRAIL-R1和/或TRAIL-R2的肿 瘤，无论良性、恶性，可以为任一种肿瘤。作为靶肿瘤，例如可举出脑肿瘤、甲状腺癌、口腔 癌、食道癌、胃癌、大肠癌、咽喉癌、肺癌、肝癌、肾癌、肾上腺癌、胰腺癌、胆道癌、子宫颈癌、 子宫体癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑色素瘤。
[0133] 本发明的重组细菌表达融合基因的情况下，作为其产物的细胞外分泌性抗肿瘤细 胞融合蛋白质被分泌到细胞外。分泌的融合蛋白质通过以单链抗体部分与作为靶物质的肿 瘤细胞结合，将TRAIL-R1和/或TRAIL-R2多聚化来诱导细胞凋亡。
[0134] 作为本发明的有效成分的重组细菌以活菌状态被包含在抗肿瘤剂中。本发明的第 1方式中记载的重组细菌在高浓度的氧存在下不能增殖，不久灭绝。因此，在生物体内，仅能 在氧分压低的部位增殖、生存。作为这样的部位的代表例，可举出在进行性癌中所看到的肿 瘤(实体癌）的中心部位或肠道内。因此，本发明的抗肿瘤剂通过注射等进行体内给药的情 况下，可以成为肿瘤选择递送性高的抗肿瘤剂。
[0135] 另外，本发明的抗肿瘤剂可以在不阻碍或抑制作为有效成分的重组细菌的生存、 增殖、融合蛋白质的表达和分泌的范围内与其他抗肿瘤剂并用。
[0136] 本发明的抗肿瘤剂，以在活菌状态下维持或保存重组细菌为前提，原则上可以用 该领域内公知的方法进行制剂化。例如，使用Remington's Pharmaceutical Sciences (Merck Publishing Co.，Easton，Pa.)中记载的方法即可。具体的制剂化的方法因给药方 法而不同。给药方法大致区分为口服给药和非口服给药，但本发明的抗肿瘤剂的情况下，更 优选非口服给药。
[0137] 对本发明的抗肿瘤剂进行非口服给药时，作为其具体例，可举出通过注射进行给 药。通过注射给予本发明的抗肿瘤剂时，可以制备成悬浮液剂的形式，即将重组细菌与制药 上可允许的溶剂混合，根据需要加入制药上可允许的担载体而成。
[0138] "制药上可允许的溶剂"可以为水或水以外的药学上可允许的水溶液或者油性液 体中的任一种。作为水溶液，例如可举出含有生理盐水、葡萄糖、其他辅助剂的等张液。作为 辅助剂，例如可举出D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠、另外还有低浓度的非离子型 表面活性剂（例如、聚山梨醇酯80(TM)、HC0-60)、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯类等。作 为油性液体，可举出芝麻油、大豆油，也可以与作为增溶剂的苯甲酸苄酯或苄醇并用。另外， 也可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、无痛化剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例 如苄醇、苯酚、抗氧化剂配合。
[0139] 注射剂通过与制药上允许的赋形剂、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、pH调节 剂等适当地组合，以一般认可的制药实施所要求的单位用量形态混和来进行制剂化即可。 [0140]注射可举出例如血管内注射、淋巴管内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射 等，但从作为本发明的抗肿瘤剂有效成分的重组细菌在肿瘤内增殖、抑制该肿瘤细胞的增 殖的机理考虑，在肿瘤灶的位置不明确的情况下，优选作为全身给药的血管内注射或淋巴 管内注射等循环系统内给药。血管内注射有静脉内注射和动脉内注射等，在给予本发明的 抗肿瘤剂时可以为任一种。另一方面，在肿瘤灶的位置确定的情况下，除上述全身给药以 外，也可以是对肿瘤直接给药的局部给药。
[0141] 将本发明的抗肿瘤剂口服给药的情况下，除了作为有效成分的重组细菌以外，可 以添加制药上可允许的担载体。
[0142] "制药上可允许的担载体"是指为了使药剂的制剂化、对生物体的适用容易，且维 持作为有效成分的重组细菌的生存，在不阻碍或不抑制该菌体的作用的范围内添加的物 质。例如可举出赋形剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、乳化剂、流动添加调节剂或润滑剂。
[0143] 作为"赋形剂"，例如可举出单糖、二糖类、环糊精和多糖类这样的糖(具体而言，没 有限定，包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、糊精、麦芽糊精、淀粉和 纤维素）、金属盐(例如，磷酸钠或磷酸钙、硫酸钙、硫酸镁）、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、低、中、 高分子量的聚乙二醇(PEG)、普朗尼克、或者它们的组合。
[0144] 作为"粘合剂"，例如可举出使用了玉米、小麦、稻米或马铃薯的淀粉而成的淀粉 糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷 酬等。
[0145] 作为"崩解剂"，例如可举出上述淀粉、羧甲基淀粉、交联聚乙烯基吡咯烷酮、琼脂、 海藻酸或海藻酸钠或者它们的盐。
[0146] 作为"填充剂"，例如可举出上述糖和/或磷酸钙(例如，磷酸三钙或磷酸氢钙）。
[0147] 作为"乳化剂"，例如可举出失水山梨糖醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸 酯、丙二醇脂肪酸酯。
[0148] 作为"流动添加调节剂"和"润滑剂"，例如可举出硅酸盐、滑石、硬脂酸盐或聚乙二 醇。
[0149] 此外，也可以根据需要含有矫味矫臭剂、悬浮剂、稀释剂、表面活性剂、增量剂、赋 湿剂、保湿剂(例如，甘油、淀粉等）、吸附剂(例如，淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶体状硅酸 等）、崩解抑制剂(例如，白糖、硬脂、可可脂、氢化油等）、涂布剂、着色剂、保存剂、抗氧化剂、 香料、调味剂、甜味剂、缓冲剂等。根据需要适当地使用上述的担载体的一种或二种以上即 可。
[0150] 作为经口疫苗剂的剂型，例如，可以举出固体剂型(包括片剂、丸剂、舌下剂、胶囊 剂、滴剂）、颗粒剂、粉剂、散剂、液剂等。此外，固体剂型可以根据需要制成实施了该领域内 公知的包衣的剂型，例如糖衣片、明胶包衣片、肠溶片、膜包衣片、双层片、多层片。剂型的具 体形状、大小只要都是各自的剂型在该领域内公知的剂型的范围内即可，没有特别限定。
[0151] 本发明的抗肿瘤剂中的重组细菌的含量原则上是按1次给药可达到该菌体能够在 靶肿瘤中生存且增殖的状态的量，且对应用该重组细菌的受试者几乎或完全没有有害的副 作用的量即可。这样的含量因抗肿瘤剂的靶细胞的种类、癌的进行度、肿瘤的大小、全身的 肿瘤灶数、抗肿瘤剂的剂型和给药方法而不同，因此考察各自的条件而适当地决定。
[0152] 本说明书的抗肿瘤剂的给药对象是具有肿瘤或具有肿瘤可能性高的受试者。本说 明书中"受试者"是指适用本发明的抗肿瘤剂的动物。例如哺乳动物，优选为人、狗、猫、马、 小鼠、大鼠、兔子、牛、猴子等，更优选为人。
[0153] 2-3.效果
[0154] 根据本发明的抗肿瘤剂，作为有效成分的重组细菌仅在氧分压低的肿瘤内生存和 增殖，分泌抗肿瘤细胞融合蛋白质。因此，可以将该融合蛋白质有效地传导到肿瘤细胞，且 继续起作用。另外，通过融合蛋白质的作用而抑制肿瘤细胞的增殖，肿瘤萎缩，由此组织中 的氧分压高时，属于专性厌氧革兰氏阳性菌的重组细菌无法生存，因此能够从生物体内自 动地排除。由此，能够提供一种与以往的细菌疗法相比，在利用非病原性的专性厌氧菌在不 对实体癌给予其他抗肿瘤药的情况下，通过单独向静脉内给药而能发挥抗肿瘤效果的安全 且简便的治疗方法。
[0155] 另外，本发明的抗肿瘤剂可以静脉内注射，因此具有对受试者的侵袭性也低的优 点。
[0156] 3.肿瘤检测用标记物
[0157] 3-1.概要
[0158] 本发明的第3方式为肿瘤检测用标记物。本发明中"肿瘤检测用标记物"是指能够 在生物体内检测肿瘤的标记物。
[0159] 本发明的肿瘤检测用标记物的特征在于将第1方式的重组细菌作为有效成分。根 据本发明的肿瘤检测用标记物，作为有效成分的重组细菌仅在肿瘤内增殖，在肿瘤内分泌 酶、荧光蛋白质或发光蛋白质，由此能够监控生物体内的肿瘤的位置、大小。
[0160] 3-2.构成
[0161] 基本的构成遵循第2方式的抗肿瘤剂。因此，这里主要对与上述抗肿瘤剂不同的方 面进行说明，对于重复的构成，原则上省略。
[0162] 本发明的肿瘤检测用标记物如上所述将第1方式的重组细菌作为有效成分。此时 的重组细菌的融合基因编码识别作为靶细胞的肿瘤细胞的表面抗原并与其结合的单链抗 体，编码功能性肽为标记蛋白质或诱导标记化的蛋白质。作为标记蛋白质，例如可举出前述 的荧光蛋白质或发光蛋白质。另外，作为诱导标记化的蛋白质，可举出以荧光素、鲁米诺这 样的发光素或荧光素为底物的酶(荧光素酶、过氧化物酶）。因此，作为本发明的肿瘤检测用 标记物的有效成分的重组细菌分泌细胞外分泌性抗肿瘤细胞免疫标记物(免疫标记物）。
[0163] 本发明的重组细菌表达融合基因时，作为其产物的细胞外分泌性抗肿瘤细胞免疫 标记物被分泌到细胞外。分泌的免疫标记物在单链抗体部分与作为靶物质的肿瘤细胞的细 胞膜上的TRAIL-R1或TRAIL-R2结合，该细胞被标记化。具体而言，功能性肽为发光蛋白质或 荧光蛋白质这样的标记蛋白质的情况下，肿瘤细胞被与单链抗体部分连接的这些标记蛋白 质直接标记。另一方面，功能性肽为酶的情况下，肿瘤细胞被与单链抗体部分连接的酶进行 酶标记。
[0164] 本发明的肿瘤检测用标记物可以与第2方式的抗肿瘤剂并用。此时，作为有效成分 的重组细菌可以是将肿瘤检测用标记物和抗肿瘤剂作为各自独立的分子进行分泌的、即分 泌含有识别相同靶物质的单链抗体的不同融合蛋白质的、相同的或不同的重组细菌，也可 以是分泌在功能性蛋白质部分含有外毒素和标记蛋白质或酶的1种融合蛋白质的重组细 菌。这些情况下，能够在对相同的肿瘤细胞标记化的同时，利用外毒素的作用来毒杀肿瘤细 胞。
[0165] 另外，也可以在不阻碍或抑制作为有效成分的重组细菌的生存、增殖、免疫标记物 的表达和分泌的范围内，与其他抗肿瘤剂并用。
[0166] 3-3.检测
[0167] 将本发明的肿瘤检测用标记物给予受试者的情况下，如果该个体具有肿瘤，则作 为有效成分的重组细菌在该肿瘤内增殖，分泌抗肿瘤细胞免疫标记物。分泌的免疫标记物 将肿瘤细胞标记化。对于标记化的肿瘤细胞的检测，在免疫标记物为发光蛋白质或荧光蛋 白质这样的标记蛋白质的情况下，检测该标记蛋白质自身发出的发光或荧光即可，另外，在 免疫标记物为酶标记的情况下，检测给予至生物体内的荧光素等底物的由酶反应产生的发 光或荧光即可。免疫标记物的检测方法没有特别限定。由于大多肿瘤存在于生物体内部，因 此可以在通过开腹等手术使肿瘤露出后检测免疫标记物，也可以从体外非侵袭地检测生物 体内的发光或荧光。优选为从体外检测的方法。作为从体外检测来自免疫标记物的发光或 焚光的方法，没有限定，但例如可以使用体内生物影像法。可以使用例如Ka t z，M. H. e t a 1.， 2003,Cancer Res .63:5521-5525, Schmitt,C.A.et al.,2002,Cancer Cell,1:289-298, Katz al · ,2003, J. Surg.Res · , 113:151-160等中记载的方法进行检测。可以利用市 售的IVIS Imaging System(Caliper)、与其类似的装置进行检测。
[0168] 3-4.效果
[0169] 根据本发明的肿瘤检测用标记物，可以基于免疫标记物从生物体外部监控生物体 内的肿瘤的位置和大小。另外，通过并用本发明的肿瘤检测用标记物和第2方式的抗肿瘤 剂，从而在利用免疫毒素抑制肿瘤细胞的增殖的同时，利用免疫标记物从生物体外部检测 生物体内的肿瘤，由此能够经时监控肿瘤的萎缩、治愈效果。
[0170] 实施例
[0171] <实施例1:双歧杆菌表达用抗人TRAIL-R2基因表达盒的制作>
[0172] (1)双歧杆菌表达用抗hTRAIL-R2VHH抗体4聚体(4E6四聚体)的基因表达盒 [0173]对以下基因进行DNA合成(序列号1)，即，使用来自长双歧杆菌hup基因的启动子区 域(序列号25)、来自长双歧杆菌的usp分泌信号序列（序列号29)、DTY(信号序列后插入序 列）、W0/2011/098520中记载的4E6的氨基酸序列、来自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2连接肽(序 列号28)和来自组蛋白样蛋白质的终止子(HUT)(序列号26)，在C末端添加编码His-Tag序列 的 DNA。
[0174] (2)双歧杆菌表达用抗hTRAIL-R2VHH抗体二聚体绿脓杆菌外毒素 A亚单位融合体 (4E6二聚体Toxin)的基因表达盒
[0175] 对以下基因进行DNA合成(序列号2)，即，使用来自长双歧杆菌hup基因的启动子区 域(序列号25)、来自长双歧杆菌的usp分泌信号序列（序列号29)、DTY(信号序列后插入序 列）、W0/2011/098520中记载的4E6的氨基酸序列、来自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2连接肽(序 列号28)、绿脓杆菌外毒素 A(被pJH8(从ATCC购入)编码的ExotoxinA的DNA序列）和来自组蛋 白样蛋白质的终止子(HUT)(序列号26)，在C末端添加编码His-Tag序列的DNA。
[0176] (3)双歧杆菌表达用抗hTRAIL-R2VHH抗体二聚体绿色荧光蛋白质融合体(4E6二聚 体EGFP)的基因表达盒
[0177] 使用来自长双歧杆菌hup基因的启动子区域(序列号25)、来自长双歧杆菌的usp分 泌信号序列（序列号29)、DTY(信号序列后插入序列）和来自组蛋白样蛋白质的终止子(HUT) (序列号26)，在4E6二聚体基因的3'末端添加编码来自8C7EGFP基因的（GGSGG) 2连接肽(序 列号28)+EGFP(Zhang G.et al.，1996，Biochem Biophys Res Commun,227(3) :707-711)基 因+His-Tag序列的DNA序列（序列号3)。
[0178] <实施例2: hTRAIL-Rl: Fc，hTRAIL-R2: Fc，mTRAIL-R2: Fc分泌表达果蝇培养细胞 的制作和重组蛋白质的纯化>
[0179] (1)基因表达盒的制作
[0180] (1-1)果蝇培养细胞表达用人TRAIL-R1:羊驼Fc(hTRAIL-Rl:Fc)的基因表达盒 [0181 ]合成由ΚρηΙ位点、翻译起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucleic Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信号（Life Technologies)、hTRAIL-Rl细胞外区域 (Accession No.AAC51226,109~239氨基酸）、IEGRMD接头（序列号27)、羊驼（alpaca) IgGlFc(Accession Ν〇·ΑΜ773729，102~335氨基酸）、His-Tag序列、终止密码子和Xhol位点 构成的DNAJ序列号4)
[0182] (1-2)果蝇培养细胞表达用人TRAIL-R2:羊驼Fc(hTRAIL-R2:Fc)的基因表达盒
[0183] 合成由ΚρηΙ位点、翻译起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucl ei c Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信号（Life Technologies)、hTRAIL-R2 细胞外区域 (Accession No.Q6FH58,54~182氨基酸）、IEGRMD接头（序列号27)，羊驼(alpaca)IgGIFc (Accession No.AM773729,102~335氨基酸）、His-Tag序列、终止密码子和Xhol位点构成的 DNAJ序列号5)
[0184] (1-3)果蝇培养细胞表达用小鼠 TRAIL-R2:羊驼Fc(mTRAIL-R2:Fc)的基因表达盒
[0185] 合成由ΚρηΙ位点、翻译起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucl ei c Acids Res. 15，1353-1361 )、Bip 分泌信号（Life Technologies)、mTRAIL-R2 细胞外区域 (Accession No.Q9QZM4,52~177氨基酸）、IEGRMD接头（序列号27)、羊驼(alpaca)IgGIFc (Accession No.AM773729,102~335氨基酸）、His-Tag序列、终止密码子和Xhol位点构成的 DNAJ序列号6)
[0186] (2)hTRAIL-Rl:Fc，hTRAIL-R2:Fc，mTRAIL-R2:Fc 分泌表达果蝇培养细胞的制作和 重组蛋白质的纯化
[0187] 为了得到融合了 hTRAIL-Rl、hTRAIL-R2、mTRAIL-R2的细胞外区域和羊驼IgGl的Fc 的蛋白质，制作在作为果蝇培养细胞的S2细胞中分泌表达这些重组蛋白质的载体pAc5.1/ 11丁1^11^-1?卟。、？厶。5.1/1^1^11^-1?2卩。、？厶。5.1/11^1^11^-1?2卩。。在？厶。5.1八5-^8厶质粒（1^& Technologies)的Kpnl、XhoI位点插入重组蛋白质的S2分泌表达基因盒。通过磷酸f丐法，以 与含有潮霉素抗性基因的pCoHygro质粒(Life Technologies)为19:1的比例导入到S2细胞 中。细胞在含有300yg/mL潮霉素 （Life Technologies)、10%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的Schneider ' s果绳培养基(Life Technologies)中培养，得到耐药细胞。耐 药细胞（IX 107细胞/mL)在含有20mM谷氨酰胺的EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies) 中培养，第7天回收培养上清液。重组蛋白质使用TALON树脂(TAKARA BIO)进行纯化。具体而 言，在填充有TAL0N树脂的柱中添加培养上清液后，用清洗缓冲液(25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、5mM咪唑）清洗，用洗脱缓冲液（25mM HEPES pH7.4、0.3M NaCl、150mM咪唑）洗脱重组 蛋白质。纯化蛋白质进行SDS-聚丙稀酰胺电泳，用Coomassie Brilliant Blue (CBB)R_250 (Bio-Rad)染色，确认各蛋白质的纯化(图4)。
[0188] <实施例3:E.coli BL21(DE3)中的重组4E6单体蛋白质的表达?纯化和结合活性 >
[0189] (1)大肠杆菌表达用抗hTRAIL_R2VHH抗体/Myc-Tag(4E6单体)基因表达盒的制作
[0190] 根据W0/2011/098520中记载的4E6VHH单体的氨基酸序列信息，对大肠杆菌表达用 的基因进行DNA合成(序列号7)。
[0191] (2)4E6单体的利用大肠杆菌的表达?纯化
[0192] 表达4E6单体的载体插入到pET22b( + )的Nde和Notl部位。向E.coli BL21Star? (DE3)0ne Shot (Life technologies)中导入该表达载体质粒DNA。根据附属手册使用100mL 的加入了 l〇〇yg/mL安比西林(Sigma-Aldrich)的2YT培养基在37°C下培养重组大肠杆菌，达 到0D6q() = 0.4~0.5时，添加0.5mM IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C下培 养3小时。培养结束后，回收大肠杆菌，再次悬浮于10mL的提取缓冲液(50mM磷酸钠 pH7.8， 300mM NaCl，EDTA_Free蛋白酶抑制剂混合物（protease inhibitor cocktail)(Roche))。 在冰中使用Sonifier 250(Branson)，以Output Control 2、Duty cycle 80% 的条件进行2 次1分钟的超声波处理，粉碎菌体。以15000rpm在4°C对处理后的悬浮液离心20分钟，回收上 清液。融合蛋白质的纯化使用His Trap柱(GE Healthcare UK)。将超声波处理悬浮液的离 心上清液直接通过His Trap柱，用结合缓冲液(20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清 洗柱子后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗脱融合蛋白质。将纯化样品供于15%丙烯酰胺SDS 电泳，用CBB染色，确认纯化到约15KDa的4E6单体蛋白质，与BSA(牛血清白蛋白蛋白质）的染 色相比，计算4E6单体的浓度。其结果，4E6单体的浓度为~3ygAU(图5)。
[0193] (3)通过ELISA确认4E6单体对hTRAIL-R2:Fc抗原的结合活性
[0194] hTRAIL-R2:Fc像实施例2那样进行制备。在96孔免疫板(Nunc)中以50yL/孔添加 0.1Μ NaHC03(Blank)、或含有lyg/mL或 10yg/mL的BSA的0.1Μ NaHC03(BSA阴性抗原）、或含有 lyg/mL或 10yg/mL的hTRAIL-R2: Fc的0 · 1M NaHC03，在4°C放置一晚。向其中加入350yL/孔的 SuperBlock-PBS(Thermo 3(^611衍打(3)在室温下放置1小时。用40(^17孔的？85-1'(含有 0.05%Tween20的磷酸缓冲生理盐水）清洗后，加入40μL/孔的含有lμg/mL的4E6单体的 SuperBlock-roS，在室温下反应1小时。再次，用400yL/孔的roS-T清洗3次，加入40yL/孔的 以SuperBlock-PBS稀释了 500倍的抗Myc小鼠单克隆抗体9E10(Santa Cruz Biotechnology)，在室温下反应1小时。用400yL/孔的PBS-T清洗3次，以40yL/孔加入抗小鼠 IgG山羊抗体HRP，室温下放置1小时。其后，用400yL/孔的PBS-T清洗3次，以50yL/孔加入ΤΜΒ 试剂(和光纯药），反应10分钟左右后，用〇. 5Μ硫酸使反应停止。其后，测定450nm的吸光度， 计算以重复三次进行的测定的平均值和标准偏差。纯化的4E6单体蛋白质与hTRAIL-R2: Fc 特异性结合(图6)。
[0195] (4)4E6单体与hTRAIL_R2ECD(细胞外区域，extracellular domain)的解离常数 (KD)的测定
[0196] 通过使用了Biacore X_100(GE Healthcare)的表面等离子共振法对4E6单体与 hTRAIL-R2:Fc(参照实施例2)的结合亲和性进行解析。测定根据Biacore X-100所附的说明 书按照多循环动力学（7少于f彳夕少力彳氺于4夕只）法进行，在〇 · 919nM、1 · 838nM、 3 · 675nM、7 · 35nM、14 · 7nM、29 · 4nM、58 · 8nM 和117 · 6nM 对 4E6 单体进行测定。
[0197] 将各浓度下的传感图和拟合曲线示于图7 3E6单体与重组人TRAIL-R2:Fc抗原的 Kd 值为7·5Χ10-ηΜ。
[0198] <实施例4:新型抗hTRAIL-RIVHH抗体(4Ρ6单体)的取得>
[0199] (1)新型抗hTRAIL-RIVHH抗体(4P6单体)基因的分离
[0200] 抗TRAIL-R1VHH抗体在此之前并不为人所知，因此通过以下方法制作。即，参考由 Maass等发表的文献（J Immunol Methods ·，2007，324，13-25)，通过菌体展示法对与 hTRAIL-Rl:人Fc(R&D Systems)结合的VHH抗体基因进行分离。将100yg的hTRAIL-Rl:羊驼 Fc每隔1~2周对羊驼免疫6次，8周后，回收白细胞，使用RNeasy(Qiagen，Venlo， Netherland)提取RNA。利用PrimeScriptll lststrand cDNA synthesis kit(TAKARA BIO) 由该RNA使用寡聚dT引物、无规6引物合成cDNAjHH抗体基因利用PrimeSTAR GXL DNA polymerase(TAKARA BIO)以将95°C1 分钟进行 1 个循环，将98°C10秒、55°C15秒、68°C1 分钟 进行25个循环的方式进行PCR而扩增。对于该扩增产物，以将95°C1分钟进行1个循环，将98 °C 10秒、60 °C 15秒、68 °C 1分钟进行20个循环的方式同样地进行PCR，扩增抗体基因。PCR使用 具有引物DNA序列1 (序列号8)和引物DNA序列2(序列号9)的DNA序列的引物。分离的抗体基 因的序列（4P6)使用BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies)，通过循环测序法确 定。其结果，分离的抗体的CDR1具有由序列号22表示的氨基酸序列，CDR2具有由序列号23表 示的氨基酸序列和CDR3具有由序列号24表示的氨基酸序列。
[0201 ] (2)果蝇培养细胞表达用4P6单体基因表达盒的制作
[0202] 合成由ΚρηΙ位点、翻译起始共有序列（Cavener D · R ·，1987，Nucleic Acids Res · 15，1353-1361)、Bip分泌信号（Life Technologies)、4P6基因、His_Tag序列、Myc-Tag 序列、终止密码子和Xhol位点构成的DNA。
[0203] (3)抗hTRAIL-RIVHH抗体单体(4P6单体)分泌表达果蝇培养细胞的制作和重组蛋 白质的纯化
[0204] 通过在pAc5· l/V5_HisA质粒(Life Technologies)的Kpnl、XhoI位点之间插入上 述（2)的基因表达盒，制成在作为果蝇培养细胞的S2细胞中分泌表达4P6单体的载体 pAc5.1/4P6单体。利用磷酸钙法将该质粒以与含有潮霉素抗性基因的pCoHygro质粒为19:1 的比例导入到S2细胞中。细胞在含有300yg/mL潮霉素 (Life Technologies)、10%胎牛血清 的Schneider ' s果绳培养基(Life Technologies)中培养，得到耐药细胞。耐药细胞在含有 20mM谷氨酰胺的EXPRESS FIVE SFM(Life Technologies)中培养，得到培养上清液。4P6单 体通过HisTrap柱(GE Healthcare)进行纯化。纯化蛋白质进行12.5%SDS-聚丙稀酰胺电 泳，用Oriο 1 e荧光凝胶染料(Bio-Rad)染色（图8)。
[0205] <实施例5:抗hTRAIL-RIVHH抗体单体(4P6单体)的结合特异性和与hTRAIL-Rl的 亲和性的测定>
[0206] (1 )4P6单体和4E6单体的由ELISA得到的结合特异性的解析
[0207] 通过ELISA研究4P6单体与TRAIL-R1选择性结合的情况。向96孔的Nunc免疫板 (Thermo Scientific)中加入 50yL 的溶解于 0· 1M NaHC03 的 lyg/mL 的 hTRAIL-Rl :Fc， hTRAIL_R2 :Fc、mTRAIL_R2 :Fc(参照实施例2)、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin)，在4 °(：放置一晚。加入300yL的SuperBlock(TBS)封闭缓冲液(Thermo Scientific)，室温下放置 1小时。除去各孔的溶液后，以50yL/孔加入以10yg/mL溶解于封闭缓冲液的4P6单体或4E6单 体，室温下放置1小时。用含有0 · 05 %TWeen20的PBS清洗3次后，加入50yL的以67ng/mL溶解 于封闭缓冲液的9E10抗Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology)，室温下放置1小时。清洗3次 后，加入50yL的溶解于封闭缓冲液的抗小鼠 IgG HRP，室温下放置1小时。清洗3次后，加入50 yL的TMB溶液(和光纯药），室温下放置10分钟。加入50yL的0.5M硫酸，测定450nm的吸光度。 每2个孔对各样品进行解析，计算测定值的平均值和误差。可以确认4P6单体与hTRAIL-Rl特 异性结合，4E6单体与hTRAIL-R2特异性结合(图9)。
[0208] (2)抗 hTRAIL-RIVHH 抗体单体（4P6 单体）与 hTRAIL-Rl ECD(细胞外区域， extracellular domain)的解离常数的测定
[0209] 通过使用了Biacore X_100(GE Healthcare)的表面等离子共振法对4P6单体与重 组人TRAIL-R1ECD的结合亲和性进行解析。将hTRAIL-Rl:Fc(hTRAIL-Rl:Fc，参照实施例2) 以约1000RU固定于传感芯片(CM5)。测定按照BiacoreX-100所附的说明书用单循环动力（シ ^夕、、少^'彳夕少力彳氺于彳夕只）法进行，按0 · ΙηΜ、0 · 5nM、2 · 5nM、12 · 5nM、62 · 5nM的顺序连 续添加4P6单体进行测定。将传感图和拟合曲线示于图HLKd值(解离常数)为3.4Χ10-ηΜ。 [0 210] ⑶4Ρ6单体和4Ε6单体的拮抗活性
[0211 ] 对4Ρ6单体是否与癌细胞的hTRAIL-Rl结合、对诱导细胞死亡的hTRAIL显示诘抗活 性进行解析。将人大肠癌Col〇205细胞悬浮在添加有10 %胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培养基（Sigma)中，以3X103cells/50yL培养基/孔向Falcon 96 孔培养板（Beeton Dickinson)中加入细胞。培养一晚，添加各50yL的终浓度100ng/mL的 TRAIL和以各种浓度含有4P6单体、抗hTRAIL-R2 VHH抗体(4E6单体)的培养基。再培养一晚， 加入10yL的活细胞数量测定试剂SF(Nacalai Tesque)，培养2小时后测定450nm的吸光度。 将未加入细胞的只是培养基的孔作为背景扣除。将仅有细胞的孔设为100%，将其相对值作 为数据。由各浓度3个孔的平均值+标准偏差表示。如图11所示，4P6单体、4E6单体单独无法 抑制由TRAIL所致的细胞死亡。但是，同时加入4P6单体和4E6单体时，用量依赖性地抑制细 胞死亡。由于hTRAIL、4P6单体、4E6单体的分子量几乎相等，因此VHH抗体100ng/mL与 hTRAIL100ng/mL的摩尔浓度几乎相等。根据以上结果，显示4P6单体、4E6单体不仅分别与细 胞表面的hTRAIL-Rl、hTRAIL-R2结合，还作为拮抗剂起作用。
[0212] 如此，能够取得与hTRAIL-Rl特异性结合、还可以作为拮抗剂起作用的新型抗体 4P6〇
[0213] <实施例6:4E6二聚体Toxin、4E6二聚体EGFP和4E6四聚体、重组E.coli BL21 (DE3)的制作和重组蛋白质的表达?纯化>
[0214] (1)基因表达盒的制作
[0215] (1-1)大肠杆菌表达用抗hTRAIL-R2VHH抗体二聚体绿脓杆菌外毒素 A亚单位融合 体(4E6二聚体Toxin)基因表达盒的制作
[0216] 大肠杆菌表达用4E6二聚体Toxin基因，以插入到pBluescriptII( + )质粒的双歧杆 菌表达用4E6二聚体Toxin基因表达盒(序列号2)作为模板，使用引物DNA序列5(序列号12) 和6(序列号13)进行PCR的扩增。PCR的条件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA BI0)作为DNA聚合酶以将95°C1分钟进行1个循环，将98°C10秒、60°C15秒、68°C2分钟进行25 个循环的方式实施。扩增产物使用MinElute柱(Qiagen)根据附加的协议进行纯化，用Ndel 和Notl进行限制酶消化后，用1.2%琼脂糖进行电泳，从凝胶中切出目标条带，使用DNA凝胶 提取试剂盒(Qiagen)根据附加的协议进行纯化分离。将其插入到pET_22b( + )(Novagen)的 Ndel和Notl部位，构建如下的4E6二聚体Toxin(图12a)，即，在N末端具有Strep Tag (Schmidt T.G.，Skerra A.，2007，Nat Protoc.2(6):1528-1535)，用（GGSGG)2连接肽（序列 号28)连接2个VHH单体彼此，介由Xbal序列（SerArg)使绿脓杆菌外毒素亚单位A(Toxin)与 4E6二聚体的C末端结合。
[0217] (1-2)大肠杆菌表达用抗hTRAIL-R2VHH抗体二聚体绿色荧光蛋白质融合体(4E6二 聚体EGFP)基因表达盒的制作
[0218] 大肠杆菌表达用4E6二聚体EGFP基因，以插入到pBluescriptII( + )质粒中的双歧 杆菌表达用4E6二聚体Toxin基因表达盒（序列号3)作为模板，使用引物DNA序列5(序列号 12)和7(序列号14)进行PCR的扩增。PCR的条件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TAKARA BIO)作为DNA聚合酶，以将95°C 1分钟进行1个循环，将98°C 10秒、60°C 15秒、68°C2 分钟进行25个循环的方式实施。扩增产物使用MinElute柱(Qiagen)根据附加的协议进行纯 化，用Ndel和Notl进行限制酶消化后，用1.2%琼脂糖进行电泳，从凝胶切出目标条带，使用 DNA凝胶提取试剂盒（Qiagen)根据附加的协议进行纯化分离。将其插入到pET-22b( + ) (Novagen)的Ndel和Notl部位，构建如下的4E6二聚体EGFP(图12b)，即，在N末端具有Strep Tag，用(GGSGG) 2连接肽(序列号28)连接2个VHH单体彼此，介由XbaI序列（SerArg)使在N末 端结合有(GGSGG) 2连接肽(序列号28)的绿色荧光蛋白质(EGFP)与4E6二聚体的C末端结合。 [0219] (1-3)大肠杆菌表达用抗hTRAIL-R2VHH抗体四聚体(4E6四聚体)基因表达盒的制 作
[0220] 大肠杆菌表达用4E6四聚体基因，以插入到pEX-K质粒的双歧杆菌表达用4E6四聚 体基因表达盒(序列号1)作为模板，使用引物DNA序列3(序列号10)和4(序列号11)进行PCR 的扩增。PCR的条件是使用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(TAKARA ΒΙ0)作为DNA聚合酶， 以将95 °C 1分钟进行1个循环，将98 °C 10秒、60 °C 15秒、68 °C 2分钟进行25个循环的方式实施。 扩增产物使用MinElute柱(Qiagen)根据附加的协议进行纯化，用Ndel和Notl进行限制酶消 化后，用1.2%琼脂糖进行电泳，从凝胶切出目标条带，使用DNA凝胶提取试剂盒(Qiagen)根 据附加的协议进行纯化分离。将其插入到pET-22b( + ) (Novagen)的Ndel和Notl部位，构建在 N末端具有Strep Tag、用3个(GGSGG)2连接肽(序列号28)连接4个VHH单体彼此的4E6四聚体 (图 12c)。
[0221] (2)大肠杆菌中的重组蛋白质的表达
[0222] 将如上所述制作的4E6四聚体、4E6二聚体Toxin和4E6二聚体EGFP基因插入到 pET22b( + )的Ndel和Notl部位。向E · coli RosettaGami (DE3)2(Novagen)导入该表达载体质 粒DNA，按照所附手册使用200mL的加入了 100yg/mL安比西林(Sigma-Aldri ch)的2YT培养基 在37°C培养重组大肠杆菌，达到0D6Q() = ().4~0.5时，添加 ImM IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖 苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C培养3小时。培养结束后，回收大肠杆菌，再次悬浮在20mL的提取缓 冲液（50mM磷酸钠 pH7.8、300mM NaCl、EDTA-Free蛋白酶抑制剂混合物（protease inhibitor cocktail)(Roche))中，在冰中使用Sonifier 250 (Branson)，以Output Control 2、Duty cycle 80%的条件进行2次1分钟的超声波处理，粉碎菌体。将处理后的悬 浮液以15000rpm在4°C离心20分钟，回收上清液。融合蛋白质的纯化使用HisTrap柱 (GEHealthcare)。将超声波处理悬浮液的离心上清液直接通过HisTrap柱，用结合缓冲液 (20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗脱融合 蛋白质。将纯化样品供于10%丙烯酰胺SDS电泳，用CBB染色，确认纯化的重组蛋白质，与BSA (牛血清白蛋白蛋白质）的染色相比，计算目标蛋白质带的浓度（图二聚体 Toxin、4E6二聚体EGFP、4E6四聚体的浓度分别计算为0.8mg/mL、l .2mg/mL、l .6mg/mL。
[0223] <实施例7:4E6二聚体Toxin和4E6四聚体的癌细胞死亡诱导活性的测定>
[0224] 研究4E6二聚体Toxin融合蛋白质是否对培养hTRAIL-R2表达人癌细胞(C〇1〇205， 由American Type Culture Collection得到）具有细胞死亡诱导作用。向Falcon 96孔培养 板(Becton Dickinson)以5 X 104cells/50yL培养基（含有0 · 2%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培养基)/孔加入细胞，培养2小时后，将如上所述纯化的4E6二聚 体 Toxin、4E6 二聚体 EGFP 以终浓度成为 2000、800、160、32、6.4、1.28、0.256、(h0512ng/mL 的 培养基（2 X终浓度)各添加50yL。在培养第2天加入10yL的MTT试剂(Nacalai Tesque)。再培 养2小时后以lOOyL/孔加入增溶剂，用吸量管将细胞溶解，测定OD57〇nm的吸光度。将无细胞 添加的培养基的孔的测定值作为背景值从总测定值中减去。将未添加抗体的空白对照的孔 设为100%，用其相对值表示。测定重复三次进行，取3个孔的平均值。如图14a所示，抗 TRAIL-R2VHH抗体二聚体和Toxin融合体、即免疫毒素完全不诱导细胞死亡。
[0225] 为了确认4E6二聚体与细胞结合的情况，进行了以下试验。即，对人大肠癌C〇1〇205 细胞、胰腺癌BxPC-3细胞，使各2 X 105细胞在50yL的含有10yg/mL 4E6二聚体EGFP和2%胎 牛血清的磷酸缓冲生理盐水(pH7.4)中进行30分钟冰上反应。用上述的加入血清的磷酸缓 冲生理盐水清洗2次，利用FACSVerse(BD Biosciences)解析细胞的荧光强度。2种细胞均被 4E6二聚体EGFP染色。另一方面，对于对照二聚体EGFP，任一细胞均未被染色（图15)。因此， 认为4E6二聚体与细胞结合。
[0226] 根据以上结果，认为4E6二聚体Toxin虽与细胞膜上的TRAIL-R2结合，但无法使 TRAIL-R2分子聚集为三聚体以上，且也不会被摄取到细胞内，因此无法对C〇1〇205细胞诱导 细胞死亡。
[0227] 接着，为了研究4E6单体和4E6四聚体是否具有细胞死亡诱导作用，将如上所述纯 化的4E6单体、4E6四聚体以终浓度成为25000、5000、1000、200、40、8、1.6、0.32pg/mL的培养 基(2 X终浓度)各添加50yL。其结果，4E6单体未引起细胞死亡，但具有使TRAIL-R2分子聚集 成三聚体以上的活性的4E6四聚体对C〇1〇205细胞强效诱导细胞死亡（图14b)。
[0228] 这些结果显示具有使TRAIL-R聚集成三聚体以上的活性的抗hTRAIL-R VHH抗体四 聚体与抗hTRAIL-R VHH抗体二聚体Toxin相比，能够有效地诱导癌细胞死亡。
[0229] <实施例8:大肠杆菌中表达的4E6四聚体对人大肠癌细胞和胰腺癌细胞的细胞死 亡诱导作用>
[0230] 研究4E6四聚体对人大肠癌细胞C〇1〇205和胰腺癌细胞BxPC-3(由American Type Culture Col lection得到）的癌细胞死亡诱导作用。细胞悬浮于添加有10 %胎牛血清 (Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培养基（Sigma)，向Falcon96孔培养板(Becton Dickinson)以3X10 3cells/50yL/孔加入细胞，培养一晚后，添加各50yL的含有4E6四聚体、 hTRAIL(和光纯药）的培养基。C〇1〇205细胞培养一晚，BxPC-3细胞培养两晚后，加入10yL的 活细胞数量测定试剂SF(Nacalai Tesque)，进一步培养4~6小时，测定450nm的吸光度。将 未加入细胞的只是培养基的孔作为背景扣除。将仅有细胞的孔设为1〇〇%，将其相对值作为 数据。用各浓度3个孔的平均值+标准偏差表示。如图16所示，4E6四聚体浓度依赖性地诱导 C〇1〇205细胞、BxPC-3细胞的细胞死亡，IC5Q分别为2pmol/L、8pmol/L。用大肠杆菌制作的 hTRAIL的IC5Q为400pmol/L，可知4E6四聚体能够以比hTRAIL低的浓度诱导细胞死亡。
[0231] <实施例9:4E6四聚体和4E6二聚体EGFP在双歧杆菌中的分泌表达和纯化>
[0232] (1)通过电穿孔制作重组双歧杆菌
[0233] 将用于在双歧杆菌中分泌表达4E6四聚体和4E6二聚体EGFP的载体基因盒(参照实 施例 1)插入PKKT427载体（Yasui K.，et al.，Nucleic Acids Res.2009)的Hindlll与Notl 之间，通过电穿孔法导入至长双歧杆菌105-A。电穿孔以2.41^、25以？、200〇的条件进行。
[0234] (2)由双歧杆菌分泌表达的4E6四聚体、4E6二聚体EGFP的纯化
[0235] 将（1)中得到的重组双歧杆菌加入到含有lOOyg/mL壮观霉素的MRS液体培养基 (Lactobacilli MRS Broth,Difco Laboratories，Detroit，MI)、50mM鹿糖、3·4mg/mL L_抗 坏血酸钠盐和〇.2mg/mL L-半胱氨酸盐酸盐中，进行一晚厌氧培养。厌氧培养使用加入了作 为脱氧剂的AnaeroPack-Kenki (三菱瓦斯化学，东京，日本)的密闭容器进行。测定培养一晚 的培养液的吸光度(600nm)，以吸光度变为0.1的方式加入到新的液体培养基中。厌氧培养6 ~7小时，以4°C、9400 X g离心10分钟，采取培养上清液。重组蛋白质的纯化用HisTrap柱(GE Healthcare)进行。将培养上清液通过HisTrap柱，用结合缓冲液(50mM磷酸钠、0.3M NaCl、 20mM咪唑pH7.8)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗脱蛋白质。将与由培养上清液lmL 纯化的量相当的纯化蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用Oriole荧光凝胶染料(Bio-Rad)染色 （图 17) JE6 四聚体、 4E6 二聚体 EGFP 都在推测分子量附近 （约 60kDa) 被检测到 。对 于培养上清液中的分泌量，4E6四聚体预计为400ng/mL，4E6二聚体EGFP预计为3.2ng/mL。根 据以上结果可知任一重组蛋白质均有分泌，4E6四聚体与4E6二聚体EGFP相比被效率良好地 分泌表达。
[0236] <实施例10:双歧杆菌中分泌表达的抗hTRAIL-R2VHH抗体四聚体(4E6四聚体）的 癌细胞死亡诱导活性>
[0237] 研究4E6四聚体对人大肠癌C〇1〇205细胞（American Type Culture Collection) 的癌细胞死亡诱导活性。细胞悬浮于添加有10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals) 的 RPMI1640 培养基（Sigma)，以3X103cells/50yl 培养基 / 孔向 Falcon96 孔培养板(Becton Dickinson)加入细胞。培养一晚，添加各50yL的以终浓度0.3pM~10nM含有4E6四聚体、 TRAIL的培养基。进一步培养一晚，加入10yL的活细胞数量测定试剂SF(Nacalai Tesque)， 培养6小时后测定450nm的吸光度。将未加入细胞的只是培养基的孔作为背景扣除。将仅有 细胞的孔作为100%，将其相对值作为数据。用各浓度3个孔的平均值+标准偏差表示。如图 18所示，4E6四聚体浓度依赖性地抑制增殖，IC 5Q为0.02nmol/L。另一方面，由大肠杆菌制作 的hTRAIL(和光纯药)的IC5Q为0.4nmol/L。因此，可知在双歧杆菌中分泌表达的4E6四聚体与 hTRAIL相比细胞死亡诱导活性高。
[0238] <实施例11:C〇1〇205细胞移植的异种移植模型(Xenograft model)中的重组长双 歧杆菌通过静脉内给药得到的抗肿瘤效果的研究>
[0239] 在向裸小鼠的皮下移植人大肠癌C〇1〇205细胞形成实体癌的异种移植模型中，研 究将分泌表达抗hTRAIL-R2VHH抗体四聚体(4E6四聚体)的重组长双歧杆菌105-A向静脉内 给药时的抗肿瘤效果。具体而言，对6周龄的雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2 X 106的C〇1〇205 细胞，9天后以各组（n = 6,未处置、4E6四聚体、4E6二聚体EGFP)的肿瘤块的体积成为约 280mm3的方式分组后，将按照实施例9制作的重组双歧杆菌以每1只1.5 X 109个向静脉内给 药。使用的长双歧杆菌105-A通过离心和在生理盐水中的再次悬浮进行制备。为了补充体内 的长双歧杆菌105-A的营养，每天将lmL的20%半乳糖苷果糖向腹腔内给药。对于肿瘤直径， 从双歧杆菌给药当天开始〇、2、4、7、11、14、18、21天后使用游标卡尺进行测量。肿瘤体积由 "(短径)2x(长径)/2"的计算公式计算。将结果示于图19。在双歧杆菌给药后第21天，分泌 表达4E6四聚体的重组双歧杆菌与未处置相比，抑制了 51%的肿瘤增殖。另一方面，作为阴 性对照的分泌4E6二聚体EGFP的双歧杆菌给药组中未发现肿瘤增殖抑制效果。
[0240]与肿瘤直径的测量同时，从双歧杆菌给药当天开始0、2、4、7、11、14、18、21天后测 量各组的体重。如图20所示，与未处置、4E6二聚体EGFP组相比，4E6四聚体组中未检测到体 重减少。根据这些结果，认为4E6四聚体不产生引起体重减少这样的副作用，通过细胞死亡 诱导活性抑制肿瘤增殖。
[0241] <实施例12: BxPC-3细胞移植的异种移植模型中的重组长双歧杆菌通过静脉内给 药产生的抗肿瘤效果的研究>
[0242] 在向裸小鼠的皮下移植人胰腺癌BxPC-3细胞形成实体癌的异种移植模型中，研究 将分泌表达抗hTRAI L-R2VHH抗体四聚体(4E6四聚体)的重组长双歧杆菌105-A向静脉内给 药时的抗肿瘤效果。具体而言，向8周龄的雌性KSN/Slc裸小鼠皮下移植2 X106的BxPC-3细 胞，8天后以各组(η = 6，未处置，4E6四聚体，4E6二聚体EGFP)的肿瘤块的体积成为约230mm3 的方式分组后，将按照实施例9制作的重组双歧杆菌以每1只1.5 X 109个向静脉内给药。使 用的长双歧杆菌105-A通过离心和在生理盐水中的再次悬浮进行制备。为了补充体内的长 双歧杆菌105-A的营养，每天将lmL的20 %半乳糖苷果糖向腹腔内给药。对于肿瘤直径，从双 歧杆菌给药当天开始0、3、6、10、13、17天后使用游标卡尺进行测量。肿瘤体积由"(短径) 2\ (长径)/2"的计算公式计算。将结果示于图21。在双歧杆菌给药后第17天，分泌表达4E6四聚 体的重组双歧杆菌与未处置相比，抑制了 52%的肿瘤增殖。另一方面，在作为阴性对照的分 泌4E6二聚体EGFP的双歧杆菌给药组中未发现肿瘤增殖抑制效果。
[0243] 与肿瘤直径的测量同时，从双歧杆菌给药当天开始0、3、6、10、13、17天后测量各组 的体重。如图22所示，与未处置、4E6二聚体EGFP组相比，4E6四聚体组中未检测到体重减少。 根据这些结果，认为4E6四聚体不产生引起体重减少这样的副作用，通过细胞死亡诱导活性 抑制肿瘤增殖。
[0244] <实施例13:4P6三聚体重组E.coli BL21(DE3)的制作和重组蛋白质的表达?纯 化>
[0245] (1)大肠杆菌表达用抗hTRAIL-RIVHH抗体三聚体(4P6三聚体)基因表达盒的制作
[0246] 将在N末端具有Strep Tag、在C末端具有His-Tag序列、按照实施例4(1)取得的抗 hTRAIL-RIVHH抗体的3个单体彼此用2个(GGSGG)2连接肽（序列号28)连接而形成4P6三聚 体，将编码该4P6三聚体的基因插入到pET-22b( + )(Novagen)的Ndel和Notl部位，构建大肠 杆菌表达用4P6三聚体基因表达盒(参照实施例6)。
[0247] (2)大肠杆菌中的重组蛋白质的表达
[0248] 将如上所述制作的质粒载体导入E.coli BL21Star?(DE3)0ne Shot(Life technologies)。根据随附手册使用200mL的加入了 100yg/mL安比西林（Sigma-Aldrich)的 2YT培养基在37°C培养重组大肠杆菌，达到0D6q() = 0.4~0.5时，添加 ImM IPTG(异丙基-β-硫 代半乳糖苷，TAKARA ΒΙ0)在30°C培养3小时。培养结束后，回收大肠杆菌，再次悬浮于20mL 的提取缓冲液(50mM磷酸钠 pH7.8、300mM NaCl、EDTA-Free蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail) (Roche))。在冰中使用Sonifier 250(Branson)以 Output Control 2、Duty cycle 80%的条件进行2次1分钟的超声波处理，粉碎菌体。将处理后的悬浮液以 9400 Xg在4 °C离心20分钟，回收上清液。融合蛋白质的纯化使用His Trap柱（GE Healthcare UK)。将超声波处理悬浮液的离心上清液直接通过His Trap柱，用结合缓冲液 (20mM磷酸钠、0.5M NaCl、20mM咪唑pH7.4)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗脱融合 蛋白质。进而，将洗脱组分添加于Strep-Tactin柱（IBA)，根据随附手册进行纯化。对相当于 50ng的BSA的纯化蛋白质进行SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳，用Oriole焚光凝胶染料(Bio-Rad) 染色（图23K4P6三聚体在推测分子量附近(约42kDa)被检测到。根据以上结果，可知4P6三 聚体可以在大肠杆菌中表达、纯化。
[0249] <实施例14:大肠杆菌中表达的4P6三聚体的癌细胞死亡诱导活性的测定>
[0250] 研究4P6三聚体对大肠癌C〇1〇205细胞（American Type Culture Collection)的 癌细胞死亡诱导活性。细胞悬浮于添加了10%胎牛血清(Tissue Culture Biologicals)的 RPMI1640培养基（Sigma)，以3X 103cells/50yl培养基/孔向Falcon96孔培养板（Becton Dickinson)加入细胞。培养一晚后，添加各50yL的以终浓度10pM~10nM含有4P6三聚体的培 养基。再培养两晚后，加入l〇yL的活细胞数量测定试剂SF(Nacalai Tesque)，培养4小时后 测定450nm的吸光度。将未加入细胞的只是培养基的孔作为背景扣除。将仅有细胞的孔设为 100 %，将其相对值作为数据。用各浓度3个孔的平均值+标准偏差表示。如图24所示，4P6三 聚体浓度依赖性地抑制C〇1〇205细胞的增殖，IC 5Q为0.4nmol/L。由大肠杆菌制作的hTRAIL (和光纯药）的IC5Q为0.4nmol/L，大肠杆菌中表达的4P6三聚体显示与hTRAE相同程度的细 胞死亡诱导活性。
[0251] <实施例15:抗hTRAIL-RIVHH抗体三聚体(4P6三聚体)在双歧杆菌中的分泌表达 和纯化>
[0252] (1)通过电穿孔制作重组双歧杆菌
[0253] 将实施例1 (1)中的表达盒的4E6四聚体的部分替换为按照实施例4(1)取得的4P6 的三聚体，将这样制作的用于在双歧杆菌中分泌表达4P6三聚体的载体基因盒插入到 pKKT427载体(Yasui K.，et al.，Nucleic Acids Res.2009)的Hindlll与Notl之间，通过电 穿孔法导入到长双歧杆菌105-A中。电穿孔以2.41^、25以？、200〇的条件进行。
[0254] (2)双歧杆菌中分泌表达的4P6三聚体的纯化
[0255] 将（1)中得到的重组双歧杆菌加入到含有lOOyg/mL壮观霉素的MRS液体培养基 (Lactobacilli MRS Broth,Difco Laboratories，Detroit，MI)、50mM鹿糖、3·4mg/mL L_抗 坏血酸钠盐和〇.2mg/mL L-半胱氨酸盐酸盐中，进行一晚厌氧培养。厌氧培养使用加入了作 为脱氧剂的AnaeroPack-Kenki (三菱气体化学，东京，日本)的密闭容器而进行。测定培养了 一晚的培养液的吸光度(600nm)，以吸光度变为0.1的方式加入到新的液体培养基中。厌氧 培养7小时，在4°C以9400 X g离心10分钟，采取培养上清液。重组蛋白质的纯化用HisTrap柱 (GE Healthcare)进行。将培养上清液通过HisTrap柱，用结合缓冲液（50mM磷酸钠、0.3M NaCl、20mM咪唑pH7.8)清洗柱后，用含有500mM咪唑的洗脱液洗脱蛋白质。将与由培养上清 液0.6mL纯化的量相当的纯化蛋白质进行SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳，用Or i ο 1 e焚光凝胶染料 (Bio-Rad)染色（图25) JP6三聚体在推测分子量附近（约42kDa)被检测到。使用BSA进行定 量，结果4P6三聚体的培养上清液中的分泌量估计为30ng/mL。根据以上结果可知4P6三聚体 在双歧杆菌中被分泌表达。
[0256] <实施例16:双歧杆菌中分泌表达的抗hTRAIL-RIVHH抗体三聚体(4P6三聚体）的 癌细胞死亡诱导活性>
[0257] 研究4P6三聚体对人大肠癌C〇1〇205细胞（American Type Culture Collection) 和胰腺癌BxPC-3细胞(American Type Culture Collection)的癌细胞死亡诱导活性。细胞 悬浮于添加有 10%胎牛血清（Tissue Culture Biologicals)的RPMI1640培养基（Sigma)， 以3 X 103cells/50yl培养基/孔向Falcon96孔培养板(Becton Dickinson)加入细胞。培养 一晚，添加各50yL的以终浓度0.3pM~10nM含有4P6三聚体的培养基。再培养两晚，加入10yL 的活细胞数量测定试剂SF(Nacalai Tesque)，培养2小时后测定450nm的吸光度。将未加入 细胞的只是培养基的孔作为背景扣除。将仅有细胞的孔设为1〇〇%，将其相对值作为数据。 用各浓度3个孔的平均值+标准偏差表示。如图26a所示，4P6三聚体浓度依赖性地抑制 C〇1〇205细胞的增殖，IC5Q为0.08nmol/L。由大肠杆菌制作的hTRAIL(和光纯药）的IC 50为 0.4nmol/L，可知双歧杆菌中分泌表达的4P6三聚体与hTRAIL相比细胞死亡诱导活性高。如 图26b所示，4P6三聚体也浓度依赖性地抑制BxPC-3细胞的增殖。
[0258] <实施例17:BxPC-3-Luc#2细胞移植的异种移植模型中的分泌表达4P6三聚体的 重组长双歧杆菌通过静脉内给药得到的抗肿瘤效果的研究>
[0259]在向裸小鼠的皮下移植人胰腺癌BxPC-3-Luc#2细胞（由JCRB细胞库得到）形成实 体癌的异种移植模型中，研究将分泌表达抗hTRAIL-RIVHH抗体三聚体(4P6三聚体）的重组 长双歧杆菌105-A向静脉内给药时的抗肿瘤效果。具体而言，对6周龄的雌性KSN/Slc裸小鼠 皮下移植3X10 6的BxPC-3-Luc#2细胞，15天后以各组(n = 5,未处置、4P6三聚体、仅pKKT427 载体）的肿瘤块的体积成为约135mm3的方式分组后，将按照实施例15制作的重组双歧杆菌 以每1只3 X108个向静脉内给药。使用的长双歧杆菌105-A通过离心和在生理盐水中的再次 悬浮而制备。为了补充体内的长双歧杆菌105-A的营养，每天将lmL的20 %半乳糖苷果糖向 腹腔内给药。对于肿瘤直径，从移植肿瘤当天开始15、19、21、24、28、31、35天后使用游标卡 尺进行测量。肿瘤体积由"(短径) 2X(长径)/2"的计算公式计算。将结果示于图27。在双歧 杆菌给药后第20天，分泌表达4P6三聚体的重组双歧杆菌与未处置相比，抑制了 65%的肿瘤 增殖。另一方面，在作为阴性对照的导入了 PKKT427的双歧杆菌给药组中未发现肿瘤增殖抑 制效果。
[0260] 在肿瘤直径的测量同时，从移植肿瘤当天开始15、19、21、24、28、31、35天后测量各 组的体重。如图28所示，与未处置、导入pKKT427的双歧杆菌组相比，4P6三聚体组中未检测 到体重减少。根据这些结果，认为4P6三聚体不产生引起体重减少这样的副作用，通过细胞 死亡诱导活性抑制肿瘤增殖。
[0261] 产业上的可利用性
[0262]根据本发明，能够减少对正常细胞的毒性，并且通过具有强效激动剂活性的抗 hTRAIL-Rl抗体和抗hTRAIL-R2抗体的肿瘤部位局部给药而有效地诱导癌细胞死亡。
[0263]将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请作为参考直接引入本说明书 中。
【主权项】
1. 一种重组专性厌氧革兰氏阳性菌，以可表达状态含有编码融合蛋白质的核酸，该融 合蛋白质含有信号肽以及3个以上的抗TRAIL-Rl单链抗体和/或3个以上的抗TRAIL-R2单链 抗体。2. 根据权利要求1所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，专性厌氧革兰氏阳性菌为 双歧杆菌属即Bif idobacterium。3. 根据权利要求1或2所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，对于抗TRAIL-Rl单链 抗体而言， CDRl含有由序列号22表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列号23表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列号24表示的氨基酸序列。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，对于抗 TRAIL-R2单链抗体而言， CDRl含有由序列号15表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列号16表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列号17表示的氨基酸序列。5. 根据权利要求1~4中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，所述融合蛋 白质进一步含有功能性肽。6. 根据权利要求5所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌，其中，功能性肽为标记蛋白质。7. -种抗肿瘤剂，将权利要求1~6中任一项所述的重组专性厌氧革兰氏阳性菌作为有 效成分。8. -种抗TRAIL-Rl抗体，其特征在于， CDRl含有由序列号22表示的氨基酸序列， CDR2含有由序列号23表示的氨基酸序列，和 CDR3含有由序列号24表示的氨基酸序列。
【文档编号】A61P35/00GK105916975SQ201480072570
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2014年12月24日
【发明人】西川毅, 平裕郎, 平裕一郎, 平郁子, 石田功
【申请人】学校法人帝京平成大学