一种增强cik细胞活性的方法与cik细胞及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及细胞工程领域，公开了一种增强CIK细胞活性的方法，包括将CIK细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。本发明还公开了一种CIK细胞及其制备方法，该方法包括将外周血单个核细胞在细胞因子的存在下培养9-11天，再在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。本发明还公开了所述CIK细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。此外，本发明还公开了DNA去甲基化药物作为刺激因子在增强CIK细胞活性中的应用。本发明通过使用DNA去甲基化药物，显著提升了CIK细胞中效用细胞的比例，使CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增强，而且能够促进CIK细胞的增殖活力，临床安全性好，无毒副作用，整体抗肿瘤效果可观，具有巨大的临床应用价值。
【专利说明】
一种増强CIK细胞活性的方法与CIK细胞及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及细胞工程领域，具体地，涉及一种增强CIK细胞活性的方法、CIK细胞及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]CIK(cytokine induced killer)细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是经多种细胞因子共同培养刺激后所获得的一类异质细胞群，同时表达NK细胞表面标志(CD56分子)和T细胞表面标志(CD3分子)，故又称为NKT细胞(自然杀伤T细胞)；兼具T细胞强大的抗瘤活性，以及NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点，已成为肿瘤过继免疫治疗的重要方案。目前制备的用于过继免疫治疗的CIK细胞实际上是体外扩增出的以CD3+CD56+和CD3 +CD8+为主的异质性细胞群，主要效用细胞为CD3+CD56+的NKT细胞。NKT细胞能够识别和杀伤突变的肿瘤细胞和病毒感染细胞，而对自身正常细胞无细胞毒作用。作为固有免疫与获得性免疫的桥梁，NKT细胞参与介导抗感染、抗肿瘤、抑制自身免疫性疾病以及移植免疫耐受等多种免疫反应。与经典MHC I/II类分子提呈抗原肽不同，NKT细胞识别由细胞表面CDld分子提呈的脂类抗原。NKT细胞活化后，迅速产生大量Thl型和Th2型细胞因子，比如IFN- γ和IL-4等，进而发挥重要的免疫调节作用。
[0003]CIK细胞在患者体内半衰期较短，一般为2周，而且由于CIK细胞抗肿瘤特异性较差，一定程度上限制了其在肿瘤治疗中的应用。如何提高CIK细胞在患者体内的杀瘤活性及存活能力是免疫细胞治疗领域的重要科学问题。尽管一些化学修饰的CIK细胞(如CART等)完善了 CIK细胞缺乏肿瘤抗原特异性的缺陷，然而引入了病毒感染体系，增加了 CIK细胞治疗的风险。研究发现α -半乳糖神经酰胺(a -GalCer)具有直接激活NKT细胞的能力，但此强大的NKT细胞激活剂会引起较大的副作用。因此，探索NKT细胞新的调控模式具有重大应用前景。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种新的增强CIK细胞活性的方法、CIK细胞及其制备方法与应用。
[0005]本发明的发明人发现，低剂量DNA去甲基化药物能够促进T细胞的增殖与激活。因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种增强CIK细胞活性的方法，该方法包括将CIK细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。
[0006]第二方面，本发明提供了一种制备CIK细胞的方法，该方法包括将外周血单个核细胞在细胞因子的存在下培养9-11天，再在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。
[0007]第三方面，本发明提供了由第二方面所述的方法制得的CIK细胞。
[0008]第四方面，本发明提供了第三方面所述的CIK细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。
[0009]第五方面，本发明提供了 DNA去甲基化药物作为刺激因子在增强CIK细胞活性中的应用。
[0010]本发明通过使用DNA去甲基化药物，显著提升了 CIK细胞中效用细胞的比例(提高2-5倍)，使CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增强，而且能够促进CIK细胞的增殖活力，临床安全性好，无毒副作用，整体抗肿瘤效果可观，具有巨大的临床应用价值。
[0011]本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0012]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0013]图1为不同剂量地西他滨(DAC)处理的不同类型肿瘤患者来源的CIK细胞的表型统计分析结果，其中，图1A和图1B为卵巢癌患者来源的CIK细胞的表型统计分析结果，图1C、图1D和图1E分别为肺癌、结肠癌和胃癌患者来源的CIK细胞的表型统计分析结果；
[0014]图2为不同剂量地西他滨处理的CIK细胞的增殖活力分析结果，其中横坐标表示地西他滨的浓度(nM);
[0015]图3为不同剂量地西他滨处理的CIK细胞对卵巢癌细胞A2780杀伤作用分析结果，其中横坐标表示地西他滨的浓度(nM);
[0016]图4为不同剂量地西他滨处理的CIK细胞杀伤靶细胞脱颗粒的检测结果。
【具体实施方式】
[0017]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0018]在本发明中，在未作相反说明的情况下，涉及的培养等步骤均在体外进行。
[0019]在第一方面中，本发明提供的增强CIK细胞活性的方法包括将CIK细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。
[0020]其中，对所述DNA去甲基化药物的用量没有特别的要求，但是，优选情况下，相对于19个CIK细胞，所述DNA去甲基化药物的用量为20-120nmol (如20nmol、30nmol、40nmo1、45nmo1、50nmo1、55nmo1、60nmo1、65nmo1、7Onmo1、75nmo1、80nmo1、90nmo1、95nmo1、10nmol、105nmol、I1nmol、115nmol、120nmol或者上述任意两个数值之间的范围)。
[0021 ] 其中，所述DNA去甲基化药物可以为常规的用于DNA去甲基化的药物，如地西他滨和/或阿杂胞苷等。优选地，所述DNA去甲基化药物为地西他滨。
[0022]其中，只要将CIK细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养即可实现增强CIK细胞活性的目的，对具体的培养时间没有特别的限制。优选地，所述培养的时间为72-120h。
[0023]根据本发明的一种优选实施方式，培养过程中根据需要适时(如隔天)补加培养基、细胞因子(特别是白细胞介素-2)和DNA去甲基化药物。
[0024]所述CIK细胞可以为通过任意方法制得的任意CIK细胞，例如，将外周血单个核细胞在细胞因子的存在下培养一定时间而获得的细胞群。
[0025]在第二方面中，本发明提供的制备CIK细胞的方法包括将外周血单个核细胞在细胞因子的存在下培养9-11天，再在DNA去甲基化药物的存在下进行培养(优选72-120h)。
[0026]其中，所述细胞因子可以为常规的用于制备CIK细胞的各种刺激因子，优选为干扰素- γ、白细胞介素_2、CD3单克隆抗体、纤维连接蛋白和白细胞介素-1a中的至少一种。细胞因子的用量为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
[0027]所述DNA去甲基化药物的用量和种类如前所述。对于用量，希望进一步说明的是，相对于19个外周血单个核细胞在细胞因子的存在下培养后获得的细胞(CIK细胞)，所述DNA去甲基化药物的用量为20-120nmol。
[0028]其中，培养过程中应当根据需要适时补加培养基和细胞因子等(特别是白细胞介素-2或DNA去甲基化药物)。根据本发明的一种优选实施方式，本发明的制备CIK细胞的方法可以包括:将外周血单个核细胞在干扰素- γ、白细胞介素_2、CD3单克隆抗体和纤维连接蛋白的存在下培养2-3天；补充培养基和白细胞介素-2继续培养，之后隔天补充培养基和白细胞介素-2直至培养的总时间达9-11天；然后，加入DNA去甲基化药物并隔天补充培养基、白细胞介素-2和DNA去甲基化药物直至在DNA去甲基化药物的存在下培养的总时间达72-120h ;收集CIK细胞。本领域技术人员可以根据细胞的数量确定补加的培养基的量。
[0029]本发明中，所述培养的温度等条件为常规的培养CIK细胞的条件(如37°C、5%二氧化碳)，在此不再详述。本发明培养外周血单个核细胞或CIK细胞所使用的培养基为常规的培养基(可以补加有血清)，且可以商购获得，如购自TAKORA公司的CIK细胞培养基GT-T551。
[0030]在第三方面中，本发明提供了由第二方面所述的方法制得的CIK细胞。本发明方法制得的CIK细胞中CD3+CD56+双阳性效应细胞的数量为仅在细胞因子的存在下培养获得的相应细胞的数量的1.5倍以上(优选1.5-2.5倍，在细胞起始数量和培养条件等完全相同的条件下测得)。将本发明的CIK细胞回输(如静脉输注)至肿瘤患者可以有效抑制或治疗肿瘤。
[0031]在第四方面中，本发明提供了第三方面所述的CIK细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。其中，所述肿瘤可以为各种常见的实体肿瘤，优选为卵巢癌、结直肠癌、食管癌及肝癌中的至少一种。
[0032]在第五方面中，本发明提供了 DNA去甲基化药物作为刺激因子在增强CIK细胞活性中的应用。如前所述，本发明的发明人发现采用DNA去甲基化药物处理CIK细胞能够显著增强CIK细胞的活性。
[0033]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0034]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均通过商购得到。
[0035]本发明的实施例中所用的一些试剂和仪器如下:
[0036]淋巴细胞分离液购自TBD公司；CIK细胞培养基GT-T551、⑶3单克隆抗体和RetroNectin购自TAKORA公司；人蛋白干扰素-γ和人白细胞介素_2购自Protech公司；实验涉及的血液从签署了知情同意书的志愿者体内抽取；流式细胞仪为BD FACS Calibur流式细胞仪。
[0037]实施例1
[0038]本实施例用来说明本发明的CIK细胞的制备。
[0039](I)取癌症(卵巢癌、肺癌、结肠癌和胃癌)患者的静脉血于含肝素的真空管中，采用淋巴细胞分离液，密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。
[0040](2) PBMCs用生理盐水洗三次后，置于含有0.6体积％自体血清的CIK细胞培养基GT-T551中，并调整细胞终浓度为2 X 16个细胞/ml ;将细胞接种于预先经过终浓度为5 μ g/ml的⑶3单克隆抗体及终浓度为10 μ g/ml的RetroNectin包被的75厘米细胞培养瓶中。培养基中加入终浓度为1000U/ml的人蛋白干扰素-γ和1000U/ml的人白细胞介素-2，于37°C、5% CO2的培养箱中进行培养。
[0041](3)第四天，向瓶中补加10ml含有0.6体积％自体血清的CIK细胞培养基GT-T551，加入终浓度为1000U/ml的人白细胞介素_2。于37°C、5% 0)2培养箱中培养。此后，隔天加倍补充培养基GT-T551以及白细胞介素_2。
[0042](4)待CIK细胞培养至第10天，取2X 16个CIK细胞置于6孔板中(2ml)，设置为如下4组:分别按照终浓度0、1nM, 10nM, 100nM的剂量加入地西他滨，于37°C、5% CO2培养箱中培养。
[0043](5)隔天补加新鲜的培养基，并相应加入地西他滨及白细胞介素_2。于37°C、5%CO2培养箱中继续培养。
[0044](6)待地西他滨处理3天后，收集CIK细胞。计数，待进行后续功能分析。
[0045]实施例2
[0046]本实施例用来说明本发明的CIK细胞的表型分析。
[0047]采用流式细胞仪对实施例1中不同剂量地西他滨处理后的CIK细胞进行表型检测，统计分析CD3+CD56\ CD8+CD56+以及CD3 +⑶8+细胞的比例。
[0048]如图1A和图1B所示，随着地西他滨剂量的增加，卵巢癌患者来源的CIK细胞中CD3+⑶56+细胞的比例随之增加，分别为4.52%,4.81%,8.04%和19.45% ;CD8 +CD56+细胞的比例也随之增加，分别为3.55%,4.08%,6.89%和16.4% ;而CD3+CD8+细胞的比例没有显著性差异。此外，肺癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤类型患者CIK细胞中CD3/CD56双阳性效应细胞的比例都有一定升高(分别如图1C、图1D和图1E所示)。
[0049]实施例3
[0050]本实施例用来说明DNA去甲基化药物对CIK细胞增殖活力的影响。
[0051]按照实施例1的方法制备CIK细胞，通过细胞计数仪对不同组别CIK细胞进行计数，统计结果如图2所示。从图2可以看出，DNA去甲基化药物能够增强CIK细胞的增殖活力。
[0052]实施例4
[0053]本实施例用来说明本发明的CIK细胞对人肿瘤细胞的杀伤活性。
[0054]96孔板中预先接种人卵巢癌细胞A2780，次日分别取实施例1中制备的CIK细胞，以效靶比20:1比率与A2780细胞进行共培养，经过24小时的共培养后，去除CIK细胞，对A2780细胞进行CCK8细胞活力检测，计算CIK细胞对靶细胞的杀伤率。根据下面的公式计算:杀伤率=(对照-样品)/对照X 100%，对照为未加CIK细胞的肿瘤细胞的0D450值；样品为加入不同剂量处理的CIK细胞的肿瘤细胞0D450值，结果见图3。结果表明，地西他滨处理后的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性有所增强。
[0055]实施例5
[0056]本实施例用来说明本发明的CIK细胞杀伤靶细胞脱颗粒的检测。
[0057]分别取实施例1中制备的CIK细胞，以效靶比10:1比率与A2780细胞进行共培养，同时加入蛋白转运抑制剂，经过6小时共培养后，收集CIK细胞，使用⑶3-PerCP和Granzyme B-APC流式抗体进行染色，通过流式细胞仪检测分析CIK细胞中表达颗粒酶B (Granzyme B)的细胞比例来反映CIK细胞脱颗粒程度。如图4所示，经过低剂量地西他滨预处理的不同肿瘤患者来源的CIK细胞，其⑶3/Granzyme B双阳性CIK细胞比例明显提高，进一步说明CIK细胞的杀伤活性增强。
[0058]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0059]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0060]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1.一种增强CIK细胞活性的方法，其特征在于，该方法包括将CIK细胞在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。2.一种制备CIK细胞的方法，其特征在于，该方法包括将外周血单个核细胞在细胞因子的存在下培养9-11天，再在DNA去甲基化药物的存在下进行培养。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述细胞因子为干扰素-γ、白细胞介素_2、CD3单克隆抗体、纤维连接蛋白和白细胞介素-1a中的至少一种。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，在DNA去甲基化药物的存在下进行培养的时间为72-120h。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，相对于109个CIK细胞，所述DNA去甲基化药物的用量为20-120nmol。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述DNA去甲基化药物为地西他滨和/或阿杂胞苷。7.权利要求2-6中任意一项所述的方法制得的CIK细胞。8.根据权利要求7所述的CIK细胞，其中，所述CIK细胞中⑶3+⑶56+双阳性效应细胞的数量为仅在细胞因子的存在下培养获得的相应细胞的数量的1.5倍以上。9.权利要求7或8所述的CIK细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述肿瘤为卵巢癌、结直肠癌、食管癌及肝癌中的至少一种。11.DNA去甲基化药物作为刺激因子在增强CIK细胞活性中的应用。
【文档编号】A61K35/17GK105925526SQ201510578314
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2015年9月11日
【发明人】聂晶, 韩为东, 吕海燕, 刘传杰, 李祥, 陈美霞, 张燕
【申请人】中国人民解放军总医院