酸碱指示剂的应用
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及酸碱指示剂的应用。本发明还提供了一种基于酸碱指示剂的细胞染色和pH鉴别成像以及快速识别肿瘤细胞的方法。包括：用pH指示剂分别对四种癌细胞和两种正常细胞进行染色，由于癌细胞和正常细胞具有不同的酸碱度，在pH指示剂存在的情况下会呈现不同的颜色。本申请将癌细胞与正常细胞进行混合培养，并用pH指示剂进行细胞染色和pH鉴别成像，可有效区分正常细胞与癌症细胞，该方法亦可用于早期癌症诊断和治疗制剂的研发。
【专利说明】
酸碱指示剂的应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，特别设及酸碱指示剂的应用。
【背景技术】
[0002] 细胞内的大多数活动都是抑敏感的，包括许多病理和生理过程、细胞器的功能W 及酶活性和蛋白质降解、细胞体积调节、细胞极化、囊泡运输、纤维收缩W及支架的建立等 等。破坏细胞内的抑可能会导致细胞器的功能障碍，从而影响细胞内的信号传递分子的活 动(如化h、cAMP)，进而影响细胞内信号的传导。通常在异常的细胞内，胞内pH值的改变是许 多常见疾病的典型特征，如阿尔茨海默氏症、中风和癌症等。
[0003] 近年来肿瘤的发病率逐年上升，并且呈现年轻化的趋势，成为当今社会严重危害 人类健康的杀手之一。尽管人类已经付出了巨大的努力去寻找有效的癌症诊断和治疗方 法，但到目前为止癌症仍然是全球公共卫生的一个重要的挑战。当前，癌症生物标记物的检 测技术在癌症的早期诊断中起到了很大的作用。在临床上，一般认为病理的免疫组织化学 方法是确诊癌症的最准确的方法，但是运种方法比较耗时，并且需要做浸入性手术取病理 组织，运对病人来说也是一种损伤。因此寻找一种更普适且简单的早期诊断肿瘤的方法显 得尤为重要，也是广大医务工作者研究的热口课题之一。
[0004] 众所周知，癌细胞的一般特点是不受控制的细胞分裂和异常酸性的胞内抑值。鉴 于癌细胞与正常细胞内部抑值的差异，人们很早就已经开始了对于细胞内pH值的测定方法 的研究，随着时代的进步，各种方法也在不断地改进和发展。到目前为止，细胞内pH值的测 定方法主要有弱酸弱碱分布法、核磁共振法、微电极法、各种功能化的纳米粒子W及广泛应 用的免疫巧光探针法等。但运些检测方法操作起来都比较复杂，即便是相对简单的巧光成 像方法也有不可避免的缺点，例如在活细胞成像中会出现不可忽略的背景信号、光漂白且 不易重复等。因此，我们仍然迫切的需要寻找一种简单而有效的方法，从而敏感的检测和监 测细胞内的抑值变化。运也是研究细胞新陈代谢，并进一步桐察pH依赖的生理和病理过程 的关键，是广大医务工作者研究的热口课题之一。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了酸碱指示剂的应用。本发明提供了一种基于pH指示剂的 细胞染色，抑鉴别成像W及快速识别肿瘤细胞的方法，最终有望实现在癌症早期诊断和治 疗制剂中的应用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供W下技术方案：
[0007] 本发明提供了酸碱指示剂在制备识别肿瘤细胞的制剂中的应用。
[000引在本发明的一些具体实施方案中，所述酸碱指示剂选自漠甲酪绿或漠百里香酪 蓝。
[0009]酸碱指示剂是一类在其特定的抑值范围内，随pH值改变而变色的化合物，通常是 有机弱酸和有机弱碱。在不同pH的溶液中，指示剂由于得到或者失去质子，致使其构型，构 象发生变化，从而显示出不同的颜色。通常其指示剂的酸式结构与碱式结构是一对共辆酸 碱。在运些指示剂中，漠甲酪绿和漠百里香酪蓝为两种较为常用的抑指示剂，它们所具有的 pH指示范围覆盖了细胞内部抑变化的范围，因此适用于细胞研究。漠甲酪绿常用于检测pH 值相对偏酸性的物质（酸碱度范围：3.8-5.4)。图I(A)为漠甲酪绿结构式，图I(A)下方是漠 甲酪绿在不同pH值的PBS溶液中的数码照片图，从图中可W看出当漠甲酪绿/PBS溶液的pH 值从3.0增加到7.5时，溶液颜色逐渐由亮黄色变为深蓝色。另一种指示剂漠百里香酪蓝的 指示范围的pH值在6.0和7.6之间，适用于检测抑值相对偏中性的物质。图I(B)为漠百里香 酪蓝的结构式，图I(B)下方是漠百里香酪蓝在不同pH值的PBS溶液中的数码照片图，从图中 可W看出当漠百里香酪蓝/PBS溶液的pH值从4.0增加到7.5时，溶液颜色也逐渐由亮黄色变 为深蓝色。
[0010] 在本发明的一些具体实施方案中，待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈现亮黄色 为肿瘤细胞。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈现蓝色为 正常细胞。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述待测细胞选自4T1细胞、A549细胞、肥PG2细 胞、HeLa细胞、HL7702细胞或L929细胞。
[001引在本发明的一些具体实施方案中，所述待测细胞的密度为1.5 X 10%L~5 X IO6/ ITlL O
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述酸碱指示剂的浓度为Img/mL。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，所述鉴定方法包括倒置显微镜检测、抑染色呈 像或MlT测定。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，所述待测细胞用含有10%胎牛血清的DMEM (Gibco)和1640(G化CO)培养，每毫升培养基中加入200U青霉素和链霉素（Invitrogen),在 37°C，5%C02条件下培养。
[0017] 本发明还提供了一种基于酸碱指示剂的细胞染色和pH鉴别成像快速识别肿瘤细 胞的方法，取酸碱指示剂对待测细胞进行染色，鉴定；
[0018] 待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈现亮黄色为肿瘤细胞；
[0019] 待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈现蓝色为正常细胞。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述酸碱指示剂选自漠甲酪绿或漠 百里香酪蓝。
[0021] 本申请提供了酸碱指示剂的应用，包括:用两种抑指示剂分别对六种细胞(包括四 种癌细胞和两种正常细胞)进行染色，因为癌细胞和正常细胞内的不同抑会呈现不同的颜 色。在上述过程中，由于细胞的内吞作用可将抑指示剂导入细胞内部，从而达到对细胞内环 境pH值的指示效果。本申请亦可W在癌细胞与正常细胞进行混合培养的情况下，利用pH指 示剂进行细胞染色和抑鉴别成像技术，有效区分正常细胞与癌症细胞。
[0022] 本发明提供了一种基于酸碱指示剂的细胞染色和pH鉴别成像W及快速识别肿瘤 细胞的方法。包括:用抑指示剂(漠甲酪绿和漠百里香酪蓝)分别对六种细胞（四种癌细胞和 两种正常细胞)进行染色，由于癌细胞和正常细胞具有不同的酸碱度，在抑指示剂存在的情 况下会呈现不同的颜色。本申请将癌细胞与正常细胞进行混合培养，并用抑指示剂进行细 胞染色和pH鉴别成像，可有效区分正常细胞与癌症细胞，该方法亦可用于早期癌症诊断和 治疗制剂的研发。
【附图说明】
[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0024] 图1示PH指示剂;其中图I(A)示漠甲酪绿的结构式和其在不同抑值的PBS溶液中的 呈色；图1 (B)示漠百里香酪蓝的结构式和其在不同pH值的PBS溶液中的呈色；
[002引图2中，A示A549细胞在用漠甲酪绿染色前的明场显微镜图片，比例尺：20WI1; B示 A549细胞在用漠甲酪绿染色后的明场显微镜图片，比例尺:20皿;C示A549、HeLa、HL7702和 L929细胞对漠甲酪绿和漠百里香酪蓝的细胞毒性试验;X轴下方的A、B、C、D分别代表:A549、 HeLa、HL7702 和 L929细胞；
[00%] 图3中，A-F分别为癌细胞皿PG2、化La和A549在用漠甲酪绿染色之前(A-C)和染色 之后(D-F)的明场显微镜图片;G-L分别为癌细胞4T1，正常细胞化7702，L929用漠甲酪绿染 色之前(G-I)和染色之后(J-L)的光学显微图片，比例尺:20皿；
[0027] 图4中，A-D分别为肥PG2、化La、A549和4T1细胞在用漠百里香酪蓝染色后的明场显 微镜图片;E-F分别为正常细胞化7702和L929用漠百里香酪蓝染色后的明场显微镜图片，比 例尺:20皿；
[00%]图5示可视化鉴定和筛选癌细胞;其中A-C分别为形貌不同的癌细胞4T1，正常细胞 化7702和它们的混合培养的明场显微镜图片，比例尺:50曲i;D示混合培养的4T1和化7702细 胞在用漠甲酪绿染色后的明场显微镜图片，虚线内标注细胞为化7702细胞，比例尺:15皿；
[0029] 图6示化La细胞染色前(A)和用甲基红(B)和百里香酪蓝(C)染色后的明场显微镜 图片，比例尺:50皿。
【具体实施方式】
[0030] 本发明公开了酸碱指示剂的应用，本领域技术人员可W借鉴本文内容，适当改进 工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而 易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031] 本申请提供了一种细胞染色的方法，包括:用两种抑指示剂分别对六种细胞(包括 四种癌细胞和两种正常细胞)进行染色，因为癌细胞和正常细胞内的不同抑会呈现不同的 颜色。在上述过程中，由于细胞的内吞作用可将抑指示剂导入细胞内部，从而达到对细胞内 环境pH值的指示效果。本申请亦可W在癌细胞与正常细胞进行混合培养的情况下，利用pH 指示剂进行细胞染色和抑鉴别成像技术，有效区分正常细胞与癌症细胞。
[0032] 本发明提供的额酸碱指示剂的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。其中， HeLa、H邱 62、4549、化7702、1^929和41'1细胞均购自美国410：公司。016]\1、1640购自6化(3〇，青 霉素和链霉素购自Invitrogen。
[0033] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0034] 实施例1 [00巧]1.细胞培养
[0036] 化1^曰、胎962、4549、化7702、1^929和41'1细胞均购自美国41〇：公司。用含有10%胎牛 血清的DMEM(Gibco)和1640(Gibco)培养，每毫升培养基中加入200U青霉素和链霉素 (Invitrogen)，在37°C，5%C02条件下培养。所有的细胞都培养在塑料培养皿中，密度约为5 Xl〇6/血。
[0037] 2.细胞活力测定
[0038] 为了考察漠甲酪绿和漠百里香酪蓝的细胞毒性，我们对其进行了 MlT分析，从而测 定作用后的细胞活力。首先我们将A549、HeLa、化7702和L929细胞分别接种到96孔板中 (5000细胞/孔），每个细胞均设6个复孔，同时各设置一组空白对照孔和调零孔。每种细胞 MlT分析均进行3次实验，然后取平均值。待将细胞培育12小时细胞贴壁后，我们首先将细胞 培养基从96孔板中吸出，再加入浓度为Img ml/i的漠甲酪绿或者漠百里香酪蓝指示剂作用 10分钟左右，然后将指示剂吸出，重新在每个孔中加入IOOmL细胞培养基并将细胞放入37 °C，5 % C〇2的培养箱中培养2地。然后向每孔中加入10化MTT试剂，充分混匀，地后，向每孔 中分别加入10化L甲琐溶液，低速振荡30min后用测量570nm吸光度值，根据每孔的吸光度值 计算出细胞活力，将未用纳米粒子处理的细胞的活力值视为100%。如图2所示，图2C为 A549，HeLa，化7702和L929细胞对漠甲酪绿和漠百里香酪蓝的细胞毒性试验结果。X轴下方 的A，B，C，D分别代表的是A549，HeLa，化7702和L929细胞。从图2及表1~表4中可W看出漠甲 酪绿和漠百里香酪蓝对运四种细胞均无明显的细胞毒性。
[0039] 酶标仪测得的原始数据见表1、表2:
[0040] 表 1
[0041]
[0042] 表1为漠百里酪蓝的细胞毒性实验原始数据，第2-4列（B-G行）分别为与漠百里酪 蓝作用后的A549，HeLa，化7702和L929细胞甲琐吸收值，7-10列(B-G行)分别为空白的L929， 化7702，胎La和A549细胞的甲琐吸收值，11列（B-G行）为只加入了培养基的空白样本。周围 空桐均用PBS填充，W维持整个样品板的湿度。
[0043] 表 2
[0044]
[(
[0046] 表2为漠甲酪绿的细胞毒性实验原始数据，第2-4列(B-G行)分别为与漠甲酪绿作 用后的A549，HeLa，HL7702和L929细胞甲琐吸收值，7-10列（B-G行）分别为空白的L929， 化7702，胎La和A549细胞的甲琐吸收值，11列（B-G行）为只加入了培养基的空白样本。周围 空桐均用PBS填充，W维持整个样品板的湿度。
[0047] 计算所得的原始数据见表3、表4:
[004引 表3
[00491
[(K)加]表3为根据图表1计算所得的A549 ,HeLa，化7702和L929细胞活力平均值与相对标 准偏差。
[0化1 ] 表4
[nncoI
[0化3] 表4为根据图表1计算所得的A549 ,HeLa，化7702和L929细胞活力平均值与相对标 准偏差。
[0054] 3.基于P巧旨示剂的细胞染色和pH鉴别成像
[0055] 在对细胞染色和pH鉴别成像之前，首先将细胞培养基从培养皿中吸出，并用20% 的乙醇溶液将细胞清洗S次。接下来在细胞培养皿中加入浓度为Img ml/i的pH指示剂，与细 胞作用5分钟后将其吸出。最后用20%的乙醇溶液对细胞进行清洗，从而除去残留的抑指示 剂。附图2(A-B)为A549细胞在用漠甲酪绿染色前(A)和染色后(B)的明场显微镜图片。从图 中可W看出，单纯的A549细胞在放大40倍的明场条件下，细胞的整体轮廓比较模糊。但当使 用漠甲酪绿对其进行染色后，细胞的边界和结构都清晰可见，可W轻易的区分细胞核和细 胞质。附图3 (A-F)分别为癌细胞皿PG2、化La和A549在用漠甲酪绿染色之前(A-C)和染色之 后(D-F)的明场显微镜图片。（G-L)分别为癌细胞4T1、正常细胞HL7702、L929用漠甲酪绿染 色之前(G-I)和染色之后(J-L)的光学显微图片。从图中可W看出，运六种细胞在染色前的 轮廓和结构均较为模糊。在使用漠甲酪绿对它们进行染色后，四种癌细胞肥PG2、化La、A549 和4T1由于内部酸性的环境均呈现亮黄色，且细胞结构清晰可见。而正常细胞化7702、L929 则由于其内部近中性的抑环境而呈现蓝色，因此我们可W根据癌细胞和正常细胞内部pH环 境的不同对其进行区分。
[0056] 此外，我们还研究了另一种常用的抑指示剂漠百里香酪蓝对细胞的染色和抑鉴别 成像作用。附图4(A-D)分别为肥PG2、化La、A549和4T1细胞在用漠百里香酪蓝染色后的明场 显微镜图片，化-F)分别为正常细胞化7702和L929用漠百里香酪蓝染色后的明场显微镜图 片。从图中可W看出漠百里香酪蓝对细胞也有较好的染色和抑鉴别成像作用，癌细胞和正 常细胞在染色后也会由于内部抑环境的不用而呈现亮黄色和蓝色，从而达到辨别的效果。 当用漠甲酪绿对混合培养的癌细胞和正常细胞进行染色时，仍然可W获得较好的辨别效 果。图5(A-C)分别为形貌不同的癌细胞4T1，正常细胞化7702和它们的混合培养的明场显微 镜图片。图5 (D)为混合培养的4T1和化7702细胞在用漠甲酪绿染色后的明场显微镜图片，虚 线内标注细胞为化7702细胞。
[0化7]另外我们还附带使用了甲基红和百里香酪蓝对化La细胞进行了染色和抑鉴别成 像，但效果不佳。
[0化引4.表征方法
[0化9] 微观和明场图像是由DMI6000B倒置显微镜化eica)和DFC450数码彩色摄像机 (Leica)拍摄所得。对于MlT测定，甲琐的吸光度值是由Bio-Rad模型-680酶标仪在57化m测 得。
[0060] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行 若干改进和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
[0061] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对运些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可W在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的运些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 酸碱指示剂在制备识别肿瘤细胞的制剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酸碱指示剂选自溴甲酚绿或溴百里香 酚蓝。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈 现亮黄色为肿瘤细胞。4. 根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，待测细胞经所述酸碱指示剂染 色后呈现蓝色为正常细胞。5. 根据权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述待测细胞选自4T1细胞、 A549细胞、HEPG2细胞、HeLa细胞、HL7702细胞或L929细胞。6. 根据权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述待测细胞的密度为1.5 X 106/mL~5X106/mL〇7. 根据权利要求1至6任一项所述的应用，其特征在于，所述酸碱指示剂的浓度为lmg/ mL〇8. 根据权利要求1至7任一项所述的应用，其特征在于，所述鉴定方法包括倒置显微镜 检测、pH染色呈像或MTT测定。9. 根据权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于，所述待测细胞用含有10%胎牛 血清的DMEM和1640培养，每毫升培养基中加入200u青霉素和链霉素，在37°C，5 %CO2条件下 培养。10. -种基于酸碱指示剂的细胞染色和PH鉴别成像快速识别肿瘤细胞的方法，其特征 在于，取酸碱指示剂对待测细胞进行染色，鉴定； 待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈现亮黄色为肿瘤细胞； 待测细胞经所述酸碱指示剂染色后呈现蓝色为正常细胞。
【文档编号】G01N21/80GK105925659SQ201610289729
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】金永东, 侯慧
【申请人】中国科学院长春应用化学研究所