一种谷子粒黑穗病菌快速检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，属于生物检测技术领域。本发明通过提取粒黑穗病菌孢子基因组DNA，根据谷子黑穗病病原菌ITS序列与NCBI上其他黑粉菌属的ITS序列差异，设计PCR特异性引物，应用设计的谷子黑穗病菌特异性引物进行PCR扩增，扩增产物于1％的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统照相，与标准分子量进行对照，来检测样品中是否存在黑穗病菌。经检测验证，本发明的检测体系具有操作简单、快速、检测结果准确的优点。
【专利说明】
-种谷子粒黑穗病菌快速检测方法
技术领域：
[0001] 本发明属于农作物病害防治及植物检疫领域，具体设及一种谷子粒黑穗病菌分子 快速检测方法与应用，即利用聚合酶链式反应(PCR)分子生物学技术对谷子粒黑穗病原菌 进行高灵敏度快速检测，用于谷子黑穗病菌侵染的检测。
【背景技术】：
[0002] 谷子粒黑穗病病原菌为粟黑粉菌化Stilago crameri)，属担子菌亚口黑粉菌科黑 粉菌属。该病原菌W种子传染为主，在植株营养生长过程中表现不明显，在灌浆后期才开始 表现出来，发病部位主要为穗部，多为全穗巧粒受害。在谷子收获脱粒时，污染其他谷子，造 成来年发病，待播种后病原菌的冬抱子萌发随生长点在植株体内蔓延，进而侵入子房，到达 穗部形成冬抱子，最后生成黑穗。该病害在我国的主要产区均有不同程度的发生，严重影响 谷子的产量和品质。
[0003] W往的研究发现，谷子黑穗病的控制是困难的，成功的管理主要依赖于使用抗病 品种或无病原种子和谷子检疫。传统的检测和鉴定病原体的方法常常依赖于可在选择性培 养基中分离到的病原体，或通过生化、化学和免疫学分析。运些是诊断植物病原体存在的基 本方法，然而它们依赖于耗时耗力的实验室技术及熟练的分类知识，比较费时，因而不利于 及时控制病害的传播。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种谷子粒黑穗病菌快速检测 方法。
[0005] 本发明通过下述技术方案实现：
[0006] 一种引物，其中上游引物尸1序列为5'-464〔6661'口'4〇：4(：1'〔44(：-3'（569 10^:1)， 下游引物Rl序列为5'-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3'（沈Q ID N0:2)。
[0007] -种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，包括W下步骤：
[000引（1)提取谷子植株组织基因组DNA，并W其为模板与所述的引物进行PCR反应；
[0009] (2)用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，当出现特异条带时，即样本中含有谷子 粒黑穗病原困。
[0010] 所述步骤(1)中的谷子植株组织为谷子的穗梗或旗叶。
[0011] 所述步骤(1)中提取谷子植株组织基因组DNA的方法为CTAB法。
[0012] 所述步骤（1)中的PCR反应条件:94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火Imin, 72°C 延伸 1111111，30个循环，最后72°(：延伸1〇111111。
[0013]与现有技术相比本发明的有益效果:本发明的检测体系具有操作简单、快速，特异 性高的优点，有利于及时控制病害的传播。
【附图说明】：
[0014] 图I为谷子黑穗病菌PCR检测方法特异性实验结果图，其中1-Marker2000、2-谷子 粒黑穗病菌冬抱子、3-谷攝病菌、4-谷子白发病菌抱子、5-玉米黑粉菌抱子、6-对照组谷子 叶片、7-dd出0。
[0015] 图2为本发明灵敏度的检测结果图，其中1-7粒黑穗病菌基因组浓度分别为l(K)ng/ 化，1 OngAiL，1 ng/jiL，1 OOpg/jiL，1 Opg/jiL，1 pg/化和0.1 pg/jiL。
[0016] 图3为本发明所述方法对不同样品的检测结果图，其中：a为拌菌晋谷21未发病植 株的组织检测结果，b为拌菌长农35未发病植株的组织检测结果。
【具体实施方式】：
[0017]实施例1
[0018] PCR技术检测谷子黑穗病病原菌的方法：
[0019] 1.PCR特异性引物的设计:根据谷子黑穗病病原菌口 S序列与NCBI上其他黑粉菌属 的口S序列差异，运用软件Primer Premier 5.0设计PCR特异性引物，上游引物Fl序列为5'- AGACGGGTTTACCACTCAAC-3 '，下游引物Rl序列为5 ' -AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3 '，并由生物 工程(上海)股份有限公司合成。
[0020] 2.引物特异性检测：将黑穗病菌抱子和供试病原菌及对照组谷子叶片的基因组 DNA进行引物特异性检测。供试病原菌有谷子白发病菌抱子，玉米黑粉菌抱子，谷攝病菌菌 丝。
[0021] 反应体系为20化，包括：10 XBuffer化L，dNTP 1.化L，引物各0.4化，DNA模板量 0.4-1化，Taq酶0.化L，余下的用灭菌双蒸水补足。PCR扩增程序如下:94°C预变性5min，94°C 变性1111111，55°(：退火1111111，72°(：延伸1111111，30个循环，最后72°(：延伸1〇111111。1%琼脂糖凝胶电 泳检测引物特异性。结果（图1)显示仅谷子粒黑粉菌冬抱子基因组DNA作模板时能扩增出1 条特异性条带，大小与目标片段(320bp)基本一致，其他供试菌株及对照组谷子叶片没有扩 增产物，说明设计的引物对谷子粒黑穗病菌具有良好的特异性。
[0022] 3. PCR检测谷子黑穗病病原菌的灵敏度:将粒黑穗病菌基因组DNA浓度分别调整为 lOOng/化，lOng/化，lng/化，lOOpg/化，lOpg/化，Ipg/化和0. lpg/化，作为PCR模板。结果（图 2)显示PCR能够检测到的谷子粒黑穗病菌基因组DNA最低浓度为lOpg/化。
[0023] 4.PCR检测方法的应用：谷子(晋谷21和长农35)于山西省长治市谷子研究所试验 地，各品种均设谷种拌菌组与不拌菌对照组，待谷子生长至灌浆后期，采集拌菌组与对照组 植株各5株，检测谷子植株组织黑穗病病原菌。
[0024] 采用CTAB法提取待测植株组织(穗梗和旗叶)基因组DNA。
[00巧]DNA提取步骤为:称取0.1 g组织，加入液氮研磨，立即转入2.0血离屯、管中，加入ImL CTAB预处理液（200mmol/L IYis-HCl 抑8.0,50mmol/L 抓TA P册.0,250mmol/L NaCl，2% e-琉基乙醇，3%PVP)，充分摇匀，100(K)r/min离屯、lOmin，弃上清，再向管中重复加入一次预 处理液。之后加入 〇.5mL 65°C预热的 CTAB 提取液（2 %CTAB，lmol/L Tris-HClpHS. 0， 250mmol/L 邸TA P册.0，1.4mol/L 化C1，1%0-琉基乙醇，1%PVP)，65°C水浴50min，期间每 隔IOmin摇动离屯、管。加入等体积的氯仿:异戊醇(V:V = 24:1)，混匀，静置5min，让其完全分 层，4°C lOOOOr/min离屯、IOmin。取上清，加入化L RNaseA，充分混匀，37°C水浴40min。再重复 加入一次氯仿:异戊醇。加入2倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20°C过夜。4°C 1000化/min离屯、 IOmin，去上清，用预冷的75 %乙醇漂洗2次，沉淀溶于20化TE溶液中。
[0026] W植株穗梗和旗叶基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳后用凝胶成像系统分析。
[0027] 检测结果所示（图3)，W拌菌未发病植株穗梗和旗叶基因组DNA为模板，用特异性 引物进行PCR扩增，扩增产物电泳分析发现，晋谷21的5颗植株中有1株的穗梗及旗叶中扩增 出特异性条带，有1株旗叶中扩增出条带穗梗中未扩增出条带，其余3颗植株的穗梗和旗叶 中没有扩增产物;长农35有4株的穗梗和旗叶中检测出特异性条带，1株穗梗和旗叶中没有 检出扩增产物，结果表明，长农35拌菌组植株中黑穗病菌检出率高于晋谷21。
[0028] 利用本发明得到的检测结果与田间发病率数据基本一致，本发明所述方法具有较 高的可行性。
【主权项】
1. 一种引物，其特征在于，上游引物？1序列为5'-六6六06661'17六〇^〇^六(：-3'，下游引物 Rl序列为5 ' -AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3 '。2. -种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取谷子植株组织基因组DNA，并以其为模板与权利要求1所述的引物进行PCR反 应； (2) 用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，当出现特异条带时，即样本中含有谷子粒黑 穗病原菌。3. 如权利要求2所述的一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤 (1)中的谷子植株组织为谷子的穗梗或旗叶。4. 如权利要求2所述的一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤 (1)中提取谷子植株组织基因组DNA的方法为CTAB法。5. 如权利要求2所述的一种谷子黑穗病害病原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤 (1)中的PCR反应条件:94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，30个 循环，最后72 °C延伸IOmin。
【文档编号】C12Q1/04GK105925710SQ201610481312
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】刘丽青, 仪慧兰
【申请人】山西大学