水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明属于生物基因工程技术领域，具体为一种水稻组蛋白赖氨酸甲基化修饰识别蛋白及其编码基因与应用。该识别蛋白是下述氨基酸残基序列之一：1）序列表中的SEQ ID No：1；2）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。该水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的功能缺失突变体株系生长矮小。本发明为植物品种改良提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
【专利说明】
水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白及其编码基因与应用
技术领域
[0001]本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种与水稻表观遗传学调控相关的组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]与其它真核生物一样，植物的转录调节也是以染色质为基础的。染色质的结构能够被动态调节，而这种调节是通过几种不同的机制来完成的，组蛋白翻译后修饰作为其中的一种目前被研究的十分广泛。组蛋白翻译后修饰的种类有很多，而组蛋白赖氨酸甲基化修饰是我们实验室主要关注的一种修饰。组蛋白甲基化修饰通常发生在组蛋白H3 N末端第
4、9、27、36位赖氨酸残基(H3K4、H3K9、H3K27和H3K36)上，同时甲基化修饰也有不同程度之分(单、双、三甲基化)ο通常认为H3K4、H3K36甲基化修饰与转录的激活相关，H3K9、H3K27的甲基化修饰与转录的抑制相关。
[0003]负责组蛋白甲基化修饰的酶我们称之为组蛋白甲基转移酶。在水稻中共有三种负责H3K36甲基化修饰的酶被报道:SDG708，SDG725以及306724。.《^^似基因被RNAi干扰后的突变体具有明显的晚花表型，这与开花基因勒⑴，Hd3a认及RFT_下调相关，而且这三个基因染色质区段的H3K36mel/2/3甲基化修饰均有不同程度的降低(Liu et al, New Phytol2016，210(2): 577-588X57^^^5的下调将导致水稻呈现油菜素内酯(BR)缺陷以及晚花表型，进一步研究表明这分别与油菜素内酯合及成传导途径中仍人份?以及开花途径中Ehd3, Ehd2, 0sMADS50, 0sMADS51, Ehdl,从《a以及的下调相关，同时在一些关键基因上的H3K36me2/3甲基化水平均有所降低(Sui et al, Plant J 2012, 70(2): 340-347; Sui wt al, Mol Plant 2013，6(3): 975-977)JDG724也通过介导H3K36的甲基化修饰从而影响水稻的开花。57^^4功能缺失突变体在长短日条件下也呈现晚花表型，这与成花素基因斯Π和/??的下调相关。有趣的是，尽管这两个成花素基因仅仅相距11.5kb，在57W7況突变体中仅有7?尸Π上H3K36me2/3甲基化修饰水平降低(Sun et al，Plant Cell2012丄24(8): 3235-3247)。
[0004]现有的研究表明H3K36甲基化修饰在水稻生长和开花调控中发挥了重要的作用。尽管一系列负责水稻中H3K36甲基化修饰的酶已被报道，这些酶所建立的修饰如何被解读，如何调控特定基因的表达，目前在植物中还知之甚少。最近我们实验室报道了水稻中的Morf Related Gene(MRG)702蛋白作为一种H3K4me3以及H3K36me3甲基化识别蛋白，它的下调突变体呈现出与甲基转移酶突变体相似的晚花以及BR途径缺陷的表型。MRG702通过特异性地结合水稻开花基因以及BR相关基因上SDG725建立的H3K36me3甲基化修饰从而调控BR途径和开花(Jin et al, Plant Phys1l 2015，168(4): 1275-1285)。
[0005]然而水稻中含有多个H3K36甲基转移酶，其H3K36甲基化的修饰具有功能多样性，探索其他的结合蛋白将帮助我们更好地理解识别蛋白识别H3K36甲基化修饰的机制。MRG701是水稻中MRG702的同源蛋白，但其功能却与MRG702大相径庭，它的基因缺失突变体开花正常却生长矮小。水稻作为一种重要的单子叶模式生物，全球一半以上的人口以其为食。对于MRG701的研究能够帮助我们深入理解水稻H3K36甲基化修饰建立，识别和传递的分子机制，同时也为我国水稻分子育种方面提供有利的分子基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一个来源于水稻的组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白及其编码基因与应用。
[0007]本发明所提供的组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白，名称为MRG701，来源于水稻(Oryza sativa ssp.japonica)，是下述氨基酸残基序列之一:
1)序列表中的SEQID No:1；
2)将序列表中的SEQID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
[0008]序列表中的SEQ ID No:1由316个氨基酸残基组成。
[0009]编码本发明组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白的基因(#7^7仍)，是下述核苷酸序列之
1)序列表中的SEQID No:2的核苷酸序列；
2)编码序列表中的SEQID No:1蛋白质序列的DNA;
3)与序列表中的SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核昔酸序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0010]上述高严谨条件为:用0.I X SSPE(或0.1 X SSC)，0.1%SDS的溶液，在65°C下杂交并洗膜。
[0011]序列表中的SEQ ID No:2由951个碱基组成，其编码框为自5’端第1-951位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。
[0012]本发明还包括含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对。
[0013]本发明还提供上述的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因在调控植物生长发育中的应用。
[0014]在实际应用中，经鉴定获得的功能缺失突变体的表型为生长矮小，使植物的生长发育得到调控。
[0015]上述重组表达载体均可按照常规方法构建。
[0016]本发明的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因的功能缺失突变体植株株系生长矮小。本发明为植物品种的改良提供了一个优质基因，同时也对加深理解组蛋白赖氨酸甲基化修饰的生物学功能和生物学过程，进一步破译组蛋白密码和理解组蛋白密码在高等植物生长发育、遗传变异中的作用具有非常重要的意义。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。
【附图说明】
[0017]图1为水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白MRG701的蛋白活性测定结果。
[0018]图2为野生型水稻(WT)和遍^功能缺失突变体水稻(ffirg.7仍)的表型图。
[0019]图3为野生型水稻(WT )和量?； 7仍功能缺失突变体水稻(mrg 701)中MRG 7仍基因表达的实时荧光定量PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0020]下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物和测序工作由上海杰李生物科技有限公司完成。
[0021 ]实施例1.水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因#7^7仍的获得
对GenBank中公布的拟南芥的MRGl的基因序列(GenBank号:NC_003075.7)通过同源序列比较，从水稻基因组中获得同源序列，并根据该同源序列的5’和3’末端序列设计一对引物，引物序列分别为:
5，一 Atgggggggagctccaacacca—3，( SEQ ID No:3)，和5’一 CTATTTGGTCTTTATCCCATCA—3’ (SEQ ID No:4)。
[0022]提取水稻黄化苗总RNA(Promega，SVtotal RNA isolat1n system)，以水稻的总RNA为模板，用AMV反转录酶(TaKaRa)合成cDNA(依据Plant RT — PCR Kit 2.0l(TaKaRa)的用户手册进行)。以cDNA为模板，PCR扩增水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白基因量的全长cDNA序列。50ul PCR反应体系包含:模板2ul，高保真酶KOD plus(TOYOBO) Iul，10 X缓冲液5ul，2.5uM dNTP 8ul，20uM的5 ’和3 ’引物各Iul，水32ul。反应条件为:94°C预变性2分钟；940C变性30秒，55 °C退火30秒，68 °C延伸I分钟，共30个循环。反应结束后，将PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约951bp的扩增片段，将其克隆到载体pUC19(TaKaRa)中，得到含有回收片段的重组质粒，经测序表明仍全长cDNA具有序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID No: 2由951个碱基组成，其编码框为自5’端第1-951位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质，编码蛋白命名为MRG701。
[0023]实施例2.水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白MRG701的活性测定
以实施例1得到的pUC19- MRG701为模板，PCR扩增遍^7仍自5 ’端第I 一291位的核苷酸序列(包含组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白的活性中心--chromodomain结构域)，5 ’和3 ’引物分别为:
5’一 AGGATCCTCCTTCAAGGAGGGCGAGAGAG—3’( SEQ ID No:5)，和5’一 ACTCGAGTGCTTGGCTCTTTTCAAGCTCTTG—3’( SEQ ID No:6)。
[0024]在50μ1 PCR扩增体系中包含模版pUC19_ MRG701 200ng，5’和3’引物各20 pmol，1Xbuffer 5yl，dNTP 各20μΜ，高保真KOD plus(T0Y0B0)lul。按以下条件进行扩增:94°C预变性2分钟;94 0C变性30秒、55 °C退火30秒、68 °C延伸I分钟，共30个循环。PCR产物经BaMlI和ZAoI酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4Tl(GE life sciences)，测序验证其正确后得到大肠杆菌表达质粒PGEX-4T1-MRG701N。
[0025]将GST对照以及GST融合的MRG70 IN重组蛋白在大肠杆菌中的表达纯化依据Glutath1ne Sepharose 4 Fast FlowCGE life sciences)的用户手册进行。将连有GST或者GST-MRG701N蛋白的Glutath1ne-Sepharose beads经洗涤后直接用于结合实验。取含有20-25此蛋白的beads于ImL的PBS溶液中，同时加入lOOyg BSA以及一定量(蛋白与肽段的摩尔数之比为1:3)的甲基化修饰的组蛋白H3 N末端肽段(由北京中科亚光生物科技有限公司合成)，于4°C孵育2h。用PBS洗涤四次后，尽可能地去尽上清。加入30μ?的洗脱液，置于4°C中剧烈摇晃45min后，取5tiL上清用毛细管点样于PVDF膜上，同时取相应的0.1lIg肽段点膜作为对照。PVDF膜用特定的组蛋白修饰的抗体进行western blot检测。所用的组蛋白抗体ant1-monomethyl-H3K4 (07-436)， ant1-dimethyl_H3K4 (07-030)， ant1-trimethyl-H3K4 (07-473)购于Millipore公司(http://www.millipore.com); monomethyl-H3K36(ab9048), ant1-dimethyl_H3K36 (ab9049),和anti_trimethyl-H3K36 (ab9050)购于Abeam公司(http://www.abcam.com)。
[0026]实施例3.检测#7^7仍对水稻生长发育的调控一、#7^7仍功能缺失突变体的鉴定。
[0027]为了了解MRG701在水稻体内的功能，我们从水稻突变体库中订购了的T-DNA插入突变体mrg7⑴。T-DNA插入的位置在基因第6个和第7个外显子之间。我们首先利用PCR的方法进行了鉴定，在T-DNA插入的两侦煅计引物，所用引物为:
5’- TGCACCTCTGAAAGTTTACTCG -3， ( SEQ ID No:7)，和5’一 CCAAAGCACACTCCTCATTG —3’ ( SEQ ID No:8)；
经扩增后选取出不能够扩增出全长条带的植株进行下一步PCR鉴定；同时在T-DNA序列上设计一个引物，序列为5’- TTGGGGTTTCTACAGGACGTAAC -3，( SEQ ID No:9)与SEQ IDNo:8组合共同扩增T-DNA插入片段，选取出能够扩增出大小为750bp片段的植株即为量￠7仍纯和T-DNA插入突变体。将小苗移至室外网室种植，收种即得Tl代种子。
[0028]为了进一步确定突变体的性状是否稳定遗传，将后来得到得T2代种子在室外网室种植，结果如图2所示，遍^ 7仍纯合T-DNA插入突变体的水稻表现出明显的生长矮小表型。
[0029]二、荧光定量PCR检测#7^7仍功能缺失突变体水稻中#7^7仍的表达。
[0030]在相同条件下对仍功能缺失突变体水稻和野生型水稻进行培育。按实施例1中相同方法提取水稻总RNA并且反转录合成cDNA ο然后用荧光定量PCR检测遍^7仍功能缺失突变体水稻和野生型水稻中遍^的表达情况。检测#价^仍所用引物为:
5’一 CTCGTGCTCGTGCGTAAAAG—3’ (SEQ ID No:10)，
5’一 CCGATCCAGCTTGGGACATT —3’ (SEQ ID No: 11)。
[0031 ] 结果如图3所示，相对于野生型水稻，量￠7仍在遍^7仍突变体水稻中呈现明显的下降，进一步证明遍^突变体水稻的表型缺陷是由于遍^的表达下降而引起的。
【主权项】
1.水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白，其特征在于来源于水稻，名称为MRG701，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质: (1)SEQID No:1; (2)将SEQID No:1的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。2.编码权利要求1所述的组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是下述核苷酸序列之一: (1)SEQID No:2的核苷酸序列； (2)编码SEQID No:1蛋白质序列的DNA; (3)与SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列； (4)在高严谨条件下可与SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因的表达载体。5.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因的转基因细胞系。6.含有权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因的工程菌。7.扩增权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因中任一片段的引物对。8.权利要求2或3所述的水稻组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白基因在植物生长发育中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:经鉴定得到的水稻组蛋白赖氨酸修饰识别蛋白功能缺失突变体呈现出生长矮小的表型。
【文档编号】C12N15/29GK105936645SQ201610253063
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】俞瑜, 刘兵, 董爱武
【申请人】复旦大学