靶向grp78基因rna干扰重组慢病毒载体及其构建方法
【专利摘要】本发明涉及靶向GRP78基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术，针对GRP78基因的不同靶序列，构建了四个能在293细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体，干扰慢病毒是由pLv?GRP78shRNA、pMD2.G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养获得。本发明靶向GRP78基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效特异性的抑制GRP78基因表达，可用于制备治肿瘤相关性基因药物。
【专利说明】
靶向GRP78基因 RNA干扰重组慢病毒载体及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及革巴向葡萄糖调节蛋白78 ( glucose regulated protein 78，GRP78) 基因的RNA干扰重组慢病毒载体及其构建，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖调节蛋白78 ( glucose regulated protein 78，GRP78)，又称免疫球蛋白 重链结合蛋白，在内质网中蛋白质合成的质量控制、Ca2 +稳态的调节中扮演着极其重要的 角色。研究表明，当机体出现缺氧、氨基酸剥夺、蛋白质错误折叠、Ca2 +稳态失调、胆固醇合 成受限等多种异常情况时，细胞将启动内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS)反应，以应对异常的生存环境，而GRP78在ERS通路中扮演重要角色。同时，GRP78高表 达于多种肿瘤细胞中，对于肿瘤细胞逃离内质网应激和承受高负荷的生存环境和蛋白质合 成的压力有着重要的作用。既往研究[2-3]表明，腺苷（adenosine)为一种重要的细胞代谢 产物，对多种肿瘤细胞起着诱导凋亡的作用。且GRP78参与此信号过程然而，在上述凋亡通 路中GRP78的具体功能，目前尚知之甚少。 RNA干扰技术能特异性降解mRNA，沉默靶基因，在转录后水平抑制基因的表达，从而可 用来进行基因功能的研究和药物靶标的研究。RNA干扰机制研究表明，双链RNA分子首先被 细胞内RNA酶Dicer降解成21-23个喊基大小的小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNAXsiRNA被认为是RNA干扰的主要效应物。慢病毒载体作为常用的病毒载体之一，其特 点是免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能自身携带片段整合入宿主细胞基因组， 并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种靶向GRP78基因的RNA干扰重组病毒载体构建、筛选及其用途。
[0004] 本发明以RNA干扰技术为主，针对GRP78基因的不同靶序列，构建了四个能在293T 细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体pLv-GRP78shRNA，该载体是自身失活的慢病毒载 体，其示意图谱见图1，能特异性的抑制GRP78基因表达。
[0005] 本发明的技术方案如下： 一种靶向GRP78基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于肿瘤GRP78基因相关性治疗 性物质，慢病毒是由？1^_61^78此1?熟、？102.6和？3?4乂2载体共转染2931'细胞培养获得；其 中，所述的pLv_GRP78shRNA重组载体是在plv-shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片段 构建而得，酶切位点是BamHI和EcoRI，所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：
[0006] 根据本发明，所述的靶向GRP78基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建方法，包 括步骤如下： a. 根据GRP78 mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的61^78_ homo-Ul、GRP78-homo_U2、GRP78-homo_U3 及 GRP78-homo_U4 核酸序列中的一种； b. 然后将所述的双链DNA片段连接到plv-shRNA载体的多克隆位点中构建成pLv-GRP78shRNA重组载体； c. 再将所述的pLv-GRP78shRNA重组载体与pMD2. G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养， 得靶向GRP78基因 RNA干扰的重组慢病毒载体系统。
[0007] 为了对靶向GRP78基因 RNA干扰的重组慢病毒载体对GRP78基因的抑制效果进行鉴 定，将pLv-GRP78shRNA与包装质粒共转染293T细胞后进行荧光定量PCR检测目的基因表达 水平，筛选出有效干扰质粒。
【附图说明】
[0008] 图1为实施例中慢病毒表达载体plv-shRNA结果示意图。
[0009]图2 GRP78干扰RNA慢病毒载体瞬转293T细胞48h图片（荧光、可见光）。其中（a)为 普通光镜(l〇〇X);(b)为荧光光镜(100X)。
[0010] 图3不同干扰序列下的GRP78表达水平。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0012] 主要材料:293T细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所;大肠杆菌感受态DH5 α购自北京全式金生物技术有限公司；慢病毒载体plv-shRNA购自Clontech公司，含有人U6 启动子，编码绿色荧光蛋白报告基因；各种限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶及Taq DNA聚合 酶均为美国NEB公司产品；SYBR Green I q RT-PCR Mixs购与上海生工生物工程技术服务 公司；胎牛血清及DMEM培养液购自美国Gibico公司。
[0013]实施例1靶向GRP78基因的慢病毒载体构建 1.寡聚核酸的设计与合成 设计靶向GRP78基因(NM_005347)的4个干扰序列(见表1)，并合成相应的单链DNA 表1靶向GRP78基因 RNA干扰序列
shRNA寡核苷酸的3 '末端是TTTTT，作为RNA聚合酶ΙΠ 型启动子U6的终止信号，其5 '和3 ' 末端分别是BamHI和EcoRI的限制性酶切位点，plv-shRNA模板中的loop结构选用了 CTCGAG。 各自单链DNA合成片段如下：
[0014] 2.寡聚核酸退火 将合成的寡聚核酸分别用无酶水溶解，浓度为20μΜ。取相应正义链和反义链溶液，按照 如下配比配制退火反应体系
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95°C 5min; 85°C 5min; 75°C 5min; 70 °C5 min; 4。。保存。
[0015] 3.pl-shRNA 载体线性化 取2yg plv-shRNA载体，按照如下体系进行酶切处理：
37°C酶切1小时，1.5%琼脂糖电泳，使用DNA纯化试剂盒回收，核酸蛋白浓度测定仪测定 回收质量。
[0016] 4.plv-GRP78-shRNA 载体的构建 利用T4DNA连接酶，按照如下体系进行载体连接反应：
20 °C连接过夜，转化质大抽杆菌感受态DH5a，挑选阳性克隆送去测序。本步骤得到的产 物是 plv-GRP78-shRNA。
[0017] 实施例2 RNA干扰慢病毒瞬转293T细胞 将4种干扰慢病毒质粒，采用瞬时转染的方法转染293T细胞。293T细胞采用含10%FBS的 高糖DMEM培养基，置于37°C，5%C02培养箱内培养。转染前1天消化293T细胞，计数，将细胞接 种至35mm培养皿内，每个培养皿接种6 X 105个细胞;次日用不含FBS的DMEM培养基分别配制 钙转试剂和RNA干扰质粒，每84μ1培养基内加入16μ1钙转试剂，每100μΙ培养基内加入4yg质 粒，分别混匀后将钙转溶液和质粒溶液轻轻混匀，室温静置10分钟，逐滴加入培养皿内，在 37°C，5%C02培养箱内培养24h，更换新鲜的含10% FBS的高糖DMEM培养基继续培养48h，收集 细胞，提取细胞RNA。
[0018] 实施例3总RNA的提取、CDNA的合成及RNA干扰效应的RT-PCR检测 分别取lyg RNA反转录cDNA，采用荧光定量PCR法检测GRP78的表达水平，以beta-actin 作为内参，荧光定量PCR所采用的引物序列见表2,采用2-AACT相对定量方法计算不同RNA 干扰序列样品的GRP78表达水平。筛选出表达水平最低的RNA干扰序列。检测结果(见图3)表 明U4序列的GRP78基因表达水平最低，说明U4序列的RNA干扰效果最好。
[0019] 表2.GRP78和beta-actin引物探针设计
【主权项】
1. 一种靶向GRP78基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于肿瘤GRP78基因相关治疗 性物质，干扰慢病毒是由卩1^-61^78此1?熟、?1?2.6和?3?4乂2载体共转染2931'细胞培养获得； 其中， 所述的pLv_GRP78shRNA重组载体是在pLv-shRNA载体的多克隆位点中连接双链DNA片 段构建而得，酶切位点是BamHI和EcoRI;所述的双链DNA片段为以下序列中的一种： (1) GRP78-homo_Ul寡核昔酸序列1: 正义链： 5. GATCCCTTGTTGGTGGCTCGACTCGACTCGAGTCGAGTCGAGCCACCAACAAGTTTTTG3 ' 反义链： 5. AATTCAAAAACTTGTTGGTGGCTCGACTCGACTCGAGTCGAGTCGAGCCACCAACAAGG3 ' (2) GRP78-homo_U2寡核苷酸序列2: 正义链：GATCCAGATTCAGCAACTGGTTAAAGCTCGAGCTTTAACCAGTTGCTGAATCTTTTTTG 反义链：AATTCAAAAAAGATTCAGCAACTGGTTAAAGCTCGAGCTTTAACCAGTTGCTGAATCTG (3) GRP78-homo_U3寡核苷酸序列3: 正义链：GATCCGAAATCGAAAGGATGGTTAATCTCGAGATTAACCATCCTTTCGATTTCTTTTTG 反义链：AATTCAAAAAGAAATCGAAAGGATGGTTAATCTCGAGATTAACCATCCTTTCGATTTCG (4) GRP78-homo_S4寡核苷酸序列4: 正义链：链：GATCCGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCTTTTTG 反义链：AATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTCG。2. 根据权利要求1所述的靶向GRP78基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建方法， 包括步骤如下： a. 根据GRP78 mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的61^78_ homo-Ul、GRP78-homo_U2、GRP78-homo_U3 及 GRP78-homo_U4 核算序列中的一种； b. 然后将所述的双链DNA片段连接到plv-shRNA载体的多克隆位点中构建成pLv-GRP78shRNA重组载体； c. 再将所述的pLv-GRP78shRNA重组载体与pMD2. G和pSPAX2载体共转染293T细胞培养， 得靶向GRP78基因 RNA干扰的重组慢病毒载体系统。3. 权利要求1所述的靶向GRP78基因的siRNA重组慢病毒表达载体在制备治疗肿瘤相关 性基因药物中的应用。
【文档编号】A61K31/713GK105936917SQ201610254023
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年4月23日
【发明人】郭佳, 蒋明, 于丽华, 蒋韵, 徐月
【申请人】同济大学苏州研究院