生产亚油酸和亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法
【专利摘要】本发明公开一种生产亚油酸和亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法。本发明通过从高山被孢霉(Mortierella alpina)胞内克隆得到活性较高的Δ12脱饱和酶基因，连接至经过改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内并通过共培养将Δ12脱饱和酶基因结合至圆红冬孢酵母的基因组上，实现高山被孢霉Δ12脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而能够强化圆红冬孢酵母生产亚油酸和α?亚麻酸的能力。
【专利说明】
生产亚油酸和亚麻酸的圆红冬孢酵母及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及亚油酸和α-亚麻酸的生产领域，尤其涉及一种生产亚油酸和α-亚麻酸 的圆红冬孢酵母及其制备方法，以及同时生产亚油酸和亚麻酸的方法。
【背景技术】
[0002] 亚油酸(cisA 9,12)是人体的一种必需脂肪酸，人体自身不能合成，只能从食物中 摄取。亚油酸能够显著降低血液中胆固醇的含量，从而预防动脉粥样硬化的风险。亚油酸具 有特殊的降低血脂、血压、促进体内微循环的作用，可以预防或减少心血管病的发病率，特 别是对血管动脉粥样硬化、心绞痛、冠心病、老年性肥胖症等的防治极为有利。亚麻酸同时 能够防止人体血清胆固醇在血管壁的沉积，故常被称为"血管清道夫"，具有防治动脉粥样 硬化及心血管疾病的保健效果。
[0003] α-亚麻酸(Cis Δ 9,12,15,英文缩写ALA)属于ω-3系列多不饱和脂肪酸，为全顺式 9,12,15-十八碳三烯酸，它在人体内不能合成，必须从体外食物中获取，多以不饱和甘油酯 的形式存在于亚麻籽、沙棘籽、大豆等植物中。亚麻酸在人体内通过一系列的碳链延长和 脱饱和反应能够被转化为机体必需的二十碳五烯酸(ΕΡΑ)和二十二碳六烯酸(DHA)，然而， α-亚麻酸比ΕΡΑ和DHA的作用更好并且更安全。它是构成人体组织细胞的主要成分，如果人 体缺乏，便会引起机体脂质体代谢紊乱，会直接导致疲劳、健忘、视力减退、免疫力下降、动 脉粥样硬化等症状的发生。目前国内外已有明确报道，如果婴幼儿童或青少年缺乏亚麻 酸，会严重影响智力的正常发育。美国国家食品药品监督管理局的研究证明，缺乏亚麻酸 将导致儿童大脑及视网膜发育迟缓，营养吸收不均衡或者不能被有效吸收，同时会导致注 意力不集中和智力发育迟缓、弱视、多动症、肥胖、厌食以及免疫力低下等多种症状和疾病。 成年人缺乏α_亚麻酸，体内的维生素、矿物质、氨基酸、蛋白质等物质不能被有效吸收和利 用，甚至会出现代谢紊乱症状。
[0004] 从自然界植物中提取α-亚麻酸的成本高且产率低，不适合工业化生产的需求。近 年来利用微生物生产多不饱和脂肪酸成为研究热点。利用微生物生产多不饱和脂肪酸具有 简单、过程可控、易放大、不受天气环境影响等优点。圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides)是自然界中为数不多的可以合成多不饱和脂肪酸的酵母，这种产油酵母具有 营养需求简单、易进行放大和高密度培养、遗传背景比较清楚等优势。圆红冬孢酵母胞内可 以合成并积累亚麻酸，然而产量并不高，因而强化圆红冬孢酵母生产亚麻酸具有重要 的研究和应用价值。目前利用培养和发酵优化的方法对于增加圆红冬孢酵母生产α-亚麻酸 的效果并不理想，所以必须从基因水平强化圆红冬孢酵母胞内亚麻酸的代谢途径，进而 达到增加 α-亚麻酸产量的目的。然而，圆红冬孢酵母属于粘红酵母菌，对于这类酵母的遗传 操作方法比较有限。
[0005] 另外，α-亚麻酸在圆红冬孢酵母胞内的合成途径是先由硬脂酸经过Δ 9脱饱和酶 (FAD9)催化生成油酸;再由Δ 12脱饱和酶(FAD12)催化油酸生成亚油酸;最后经过Δ 15脱饱 和酶(FAD15)催化生成α-亚麻酸。在这条合成途径中Δ 12和Δ 15脱饱和酶是主要的限速酶， 正是由于圆红冬胞酵母胞内A 12和△ 15脱饱和酶的低活性限制了亚油酸和α-亚麻酸的产 量，其中△ 12脱饱和酶是催化油酸到亚油酸的酶，在亚油酸和α-亚麻酸胞内合成过程中起 到关键作用。但是，如何增强A 12和△ 15脱饱和酶的活性，强化亚油酸合成，并进一步强化 α-亚麻酸的合成途径，进而增加圆红冬胞酵母合成α-亚麻酸的产量是长期以来一直面临的 重要难题。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术无法大幅度提高圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides A C C C 2 0 3 41 )生产亚油酸和α -亚麻酸的问题，本申请的发明人发现，从高山被孢霉 (Mortierella alpina)胞内克隆得到的Δ 12脱饱和酶基因在圆红冬孢酵母表达时显示出 高活性，将其连接至植物双元表达载体pCAMBIAl 300，转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)胞内，并通过共培养将Δ 12脱饱和酶基因转化至圆红冬孢酵母，实 现具有高活性的高山被孢霉△ 12脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的过表达，从而能够强化圆 红冬孢酵母生产亚油酸和α-亚麻酸的能力。具体地，本发明提供以下内容。
[0007] 本发明的一方面，提供一种圆红冬孢酵母菌株，其包含高山被孢霉(Mortierella alpina)的△ 12脱饱和酶基因表达元件。在一个优选实施方案中，高山被孢霉的△ 12脱饱和 酶基因包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。在另一优选实施 方案中，本发明的圆红冬孢酵母菌株能够过表达具有高活性的高山被孢霉的A 12脱饱和 酶。在另一优选实施方案中，本发明的圆红冬孢酵母菌株具有强化亚油酸和亚麻酸生产 的能力。
[0008] 本发明的另一方面，提供一种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其包括:将表达高山 被孢霉的A 12脱饱和酶的基因或其片段引入圆红冬孢酵母菌株，从而强化所述圆红冬孢酵 母菌株的亚油酸和α-亚麻酸生产能力。优选地，所述表达高山被孢霉的△ 12脱饱和酶的基 因具有SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列。
[0009] 在一个优选的实施方案中，圆红冬孢酵母菌株的制备方法包括：
[0010] Δ 12脱饱和酶基因表达载体PCAMBIA-FAD12的构建，其中所述PCAMBIA-FAD12包含 SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的核苷酸序列；
[0011] 利用所述PCAMBIA-FAD12质粒转化根癌农杆菌；
[0012] 将所述转化的根癌农杆菌与所述圆红冬孢酵母共培养，从而将△ 12脱饱和酶基因 转化至所述圆红冬孢酵母。
[0013] 优选地，所述PCAMBIA-FAD12进一步包含潮霉素抗性基因（HYGR)表达元件。优选 地，所述潮霉素抗性基因表达元件由GPD基因的启动子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组 成。优选地，所述潮霉素抗性基因具SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列。
[0014] 本发明的再一方面，提供一种同时生产亚油酸和α-亚麻酸的方法，其包括培养本 发明所述的圆红冬孢酵母菌株的步骤。
[0015] 在优选地实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：
[0016] 1)利用YEro培养基培养活化的圆红冬孢酵母菌株；
[0017] 2)收集步骤1)培养而得到的圆红冬孢酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料 发酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持 在 100:0.7 ~1·5〇
[0018] 活化的圆红冬孢酵母菌株可以直接采用活化状态的菌株，也可由保藏状态的菌株 活化而来。
[0019] 所述YEPD培养基或称为YPD培养基，即，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)，按照常规配方配置即可。优选地，按照如下配方配 置:8~12g/L酵母粉，8~20g/L蛋白胨，15~25g/L葡萄糖，pH为5.8~6.0。若制固体培养基， 加入10~20g/L琼脂粉，优选为15g/L琼脂粉。在本发明的一个优选实施方式中，YEH)培养基 按照如下配方配置:l〇g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，pH=5.8~6.0。
[0020] 步骤1)和步骤2)可以在发酵罐中进行。步骤2)中，补料发酵是指，通过补料流加所 述碳源维持所需的碳氮比。
[0021] 根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，所述碳源为含有葡萄糖和木糖的混合 碳源，所述氮源为谷氨酸钠或蛋白胨，所述无机盐含有钾元素、镁元素和磷元素。
[0022]根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，碳源为含有15~25g/L葡萄糖和25~ 35g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8~6.5g/L的谷氨酸钠或4.6~5.5g/L的蛋白胨，所述无机 盐包括0 · 3~0 · 7wt %的ΚΗ2Ρ〇4、0 · 1~0 · 3wt %的K2HPO4和0 · 3~0 · 7wt %的MgCh。以上各成分 的含量是指各成分在补料发酵培养基中的含量。补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水 溶液（即，通过流加含有15~25g/L的葡萄糖和25~35g/L的木糖的混合碳源水溶液），使总 碳氮比始终维持在100: 〇. 8~1.2。更优选地，步骤2)中，碳源为含有18~22g/L葡萄糖和28 ~32g/L木糖的混合碳源，氮源为5.8~6.2g/L的谷氨酸钠或4.6~5.2g/L的蛋白胨，所述无 机盐包括0 · 4~0 · 6wt %的ΚΗ2Ρ〇4、0 · 1~0 · 2wt %的K2HPO4和0 · 4~0 · 6wt %的MgCh，补料发酵 过程中，通过流加所述混合碳源的水溶液（即，通过流加含有18~22g/L的葡萄糖和28~ 32g/L的木糖的混合碳源水溶液），使总碳氮比始终维持在100:0.9~1.1。根据本发明的一 个优选实施方式，步骤2)中，碳源为含20g/L葡萄糖和30g/L木糖的混合碳源，氮源为6.2g/L 的谷氨酸钠或4.6g/L的蛋白胨，所述无机盐包括0.52wt %的KH2P〇4、0.16wt %的K2HP〇4和 0.48wt%的MgCl2,补料发酵过程中，通过流加所述碳源的水溶液（即，通过流加含有18~ 22g/L的葡萄糖和28~32g/L的木糖的混合碳源水溶液），使总碳氮比始终维持在100:1。 [0023]根据本发明所述的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬孢酵母菌株在YEro培养基培养 至0D 6QQ为10以上。更优选地，培养至0D6QQ为12~15。
[0024]根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，补料发酵的时间为80~150h。更优选 地，补料发酵的时间为1 〇〇~140h。
[0025] 根据本发明所述的方法，优选地，步骤1)中，圆红冬孢酵母菌株在YEro液体培养基 中培养，培养条件为28~30°C，180~230rpm，培养40~60h;步骤2)中，补料发酵的时间为 100~130h。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤1)中，圆红冬孢酵母在YEPD液体培养 基中培养，培养条件为30°C，200rpm，培养48h;步骤2)中，补料发酵的时间为120h。
[0026] 根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)中，收集步骤1)培养而得的圆红冬孢酵母 菌体的方法为:7000~9000rpm离心，收集菌体，用浓度为15~25mM，pH=6.5~7的磷酸盐缓 冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤2)中，收集步 骤1)培养而得的圆红冬孢酵母菌体的方法为:8000rpm离心，收集菌体，用20mM，pH = 6.8的 磷酸盐缓冲液洗涤菌体，再次离心收集菌体。
[0027]根据本发明所述的方法，优选地，步骤2)得到的发酵液用有机溶剂提取总油脂，所 述有机溶剂可以为本领域采用的各种提取微生物总油脂的有机溶剂。优选地，所述有机溶 剂为体积比为2~5:1的正己烷和乙醇，更优选为体积比为2.5~3.5:1的正己烷和乙醇。 [0028]根据本发明所述的方法，优选地，提取总油脂的方法为：7000~9000rpm离心所得 发酵液，用pH = 6.5~7的磷酸盐缓冲液洗涤离心的菌体，最后用浓度为5~7mol/L的盐酸重 悬，70~90°C水浴酸解30~lOOmin;加入所述有机溶剂萃取其中的油脂，重复萃取3~5次， 合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含亚油酸和亚麻酸的总油脂。根据本发明的一个 优选的实施方式，提取总油脂的方法为:8000rpm离心所得发酵液，用ρΗ=6.8的磷酸盐缓冲 液洗涤离心的菌体，最后用6mol/L的盐酸重悬，80 °C水浴酸解40min;加入所述有机溶剂萃 取其中的油脂，重复萃取3次，合并上清液，蒸发所述有机溶剂后即得含α-亚麻酸和亚油酸 的总油脂。
[0029]圆红冬孢酵母胞内油脂积累量能够达到细胞干重的60%以上，但是生产出来的油 脂一般用作生物柴油等能源用途。本发明的发酵培养方法强化了圆红冬孢酵母胞内油脂中 亚油酸和α-亚麻酸的产量，可用于保健品，提升了圆红冬孢酵母油脂的利用价值。此外，采 用本发明优选的方案中，亦即以葡萄糖和木糖作为混合碳源、以谷氨酸钠或蛋白胨为优化 氮源来发酵圆红冬孢酵母，并保持发酵过程的碳氮比，这样可以显著增加圆红冬孢酵母胞 内合成亚油酸和α-亚麻酸的量。
【附图说明】
[0030] 图1 PCAMBIA-FAD12表达载体的构建过程示意图。
[0031]图2利用重叠延伸PCR的方法得到Δ 12脱饱和酶基因表达框(MAP启动子+FAD12+ MAPK终止子），M是标记物(marker); 1、2分别是Δ 12脱饱和酶融合基因表达框(2802bp)。 [0032]图3利用重叠延伸PCR的方法得到潮霉素抗性基因表达框(GH)启动子+HYG R)。其中 Μ是标记物(marker); 1是潮霉素抗性基因 HYGR表达框(2111bp)。
【具体实施方式】
[0033]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于 此。
[0034]除非特别声明，本发明的"％"表示重量百分比wt%。本发明的"mM"表示mmol/L。本 发明实施例中未限定配方的YEH)培养基均按照如下配方配置：10g/L酵母粉，10g/L蛋白胨， 20g/L 葡萄糖，pH5 · 8 ~6 · 0。
[0035]本发明中，优选采用PCAMBIA1300载体来构建Δ 12脱饱和酶基因表达载体，因为能 够高效地转化根癌农杆菌。但是由于PCAMBIA1300载体上携带的CaMV 35S启动子是在植物 细胞中行使功能而在圆红冬孢酵母胞内无法发挥作用，所以要对表达A 12脱饱和酶基因的 载体pCAMB IA1300进行改造。为此，本申请的发明人创造性地将圆红冬孢酵母的保守基因丝 裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase ,ΜΑΡΚ)基因的启动子和终止子序 列与高山被孢霉△ 12脱饱和酶的开放阅读框连接在一起组成表达元件，用EcoRI和BamHI两 个酶切位点将其连接在PCAMBIA1300载体上的多克隆位点。结果表明这样的表达元件能够 在圆红冬孢酵母胞内高效表达具有高活性的△ 12脱饱和酶。
[0036]优选地，为了能够使潮霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中表达，本申请的发明人创 造性地构建了潮霉素抗性基因表达元件，并将该表达元件与PCAMBIA1300载体连接。优选 地，将圆红冬抱酵母3_磷酸甘油酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GPD)基因的启动子(SEQ ID NO: 15)与潮霉素抗性基因开放阅读框(SEQ ID NO: 10)连接在 一起组成表达元件，终止子可用pCAMBIAl 300载体自身携带的CaMV终止子。
[0037]接下来，将Δ 12脱饱和酶FAD12表达元件和潮霉素抗性基因表达元件与 pCAMBIAl 300载体的连接。连接方法包括：
[0038] 1)用EcoRI和BamHI双酶切连接的方法将Δ 12脱饱和酶FAD12表达元件连接在 pCAMBIAl 300载体上；
[0039] 2)用Xhol和Bstxl双酶切将潮霉素抗性基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上。
[0040]需要说明的是，对于连接步骤1)和2)的顺序没有特别限定，可优先进行步骤1)，然 后再进行步骤2)，反之亦可。可选地，可同时进行步骤1)和2)。
[0041 ]优选地，本发明的圆红冬孢酵母的制备方法中，包括pCAMBIA-FAD12质粒转化根癌 农杆菌。优选地，采用热击转化E.coil T1感受态细胞，富集培养后提取pCAMBIA-FAD12质 粒，然后进行根癌农杆菌转化。
[0042] 优选地，本发明的圆红冬孢酵母的制备方法中，包括根癌农杆菌转化圆红冬孢酵 母的步骤。优选地，转化方法包括将两种菌液混合，共培养从而进行转化的方法。
[0043] 优选地，本发明的圆红冬孢酵母的制备方法还包括根癌农杆菌转化圆红冬孢酵母 后得到的重组子的验证步骤。验证方法可采用本领域内通常使用的任何方法，包括但不限 于，PCR扩增验证法、酶切验证法、免疫验证法以及酶活性验证法等。从操作方法及成本节约 角度，优选PCR扩增验证法。具体地，提取共培养后的圆红冬孢酵母的基因组，并通过PCR扩 增来确认圆红冬孢酵母中是否存在高山被孢霉A 12脱饱和酶基因。
[0044] 实施例
[0045] 1.菌种与实验材料
[0046] 圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides ACCC 20341)和高山被抱霉 (Mortierella alpina)购自中国农业生物菌种保藏管理中心，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens LBA4404)购自普如汀生物技术(北京)有限公司。质粒、基因组提取试剂盒购 自TIANGEN公司，载体pCAMBIA1300购自Biovector公司，Easy Pfu DNA聚合酶购自全氏金公 司，尼龙膜Hybond-N+膜购自Amersham公司。限制性内切酶购自NEB公司。化学试剂购自国药 集团化学试剂有限公司，均为分析纯。
[0047] 2. Δ 12脱饱和酶基因表达载体pCAMBIA-FAD12的构建：
[0048] 1)高山被孢霉菌株和圆红冬孢酵母菌株分别接种在含YEPD培养基的50mL三角瓶 中过夜培养8h，离心收集菌体，分别提取两种菌的基因组；
[0049] 2)以高山被孢霉和圆红冬孢酵母的基因组为模板，使用引物pMAPK-F(SEQ ID N0: 4)和pMAPK-R(SEQ ID N0:5)、tMAPK-F(SEQ ID N0:8)和tMAPK-R(SEQ ID N0:9)、FAD12-F (SEQ ID N0:6)和FAD12-R(SEQ ID N0:7)分别克隆得到圆红冬孢酵母丝裂素活化蛋白激酶 MAPK的启动子(SEQ ID N0:1)和终止子序列（SEQ ID N0:3)以及高山被孢霉Δ12脱饱和酶 的开放阅读框(SEQ ID N0:2);
[0050] 3)使用重叠延伸PCR的方法将上述三段核苷酸序列进行拼接，重叠延伸PCR的方法 为:先将MAPK启动子和Δ 12脱饱和酶互为模板和引物进行扩增，条件为94 °C预变性5min，94 。(:变性40s，60 °C退火30s，72 °C延伸lmin，20个循环；然后将产物取出加入引物pMAPK-F和 FAD12-R再次进行上述条件的扩增，35个循环，即将得到MAPK启动子和Δ12脱饱和酶基因两 个片段的融合序列；
[0051 ] 4)再次使用步骤3)的方法，引物是pMAPK-F和tMAPK-R，将第三个片段MAPK的终止 子序列连接到前述融合片段的下游，获得A 12脱饱和酶基因表达框。用EcoRI和BamHI双酶 切连接的方法将三段序列融合片段，即A 12脱饱和酶基因表达框连接在PCAMBIA1300载体 上。
[0052] 3.潮霉素抗性基因表达载体的构建：
[0053] 1)将圆红冬孢酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶(GTO)基因的启动子(SEQ ID N0:15)与潮 霉素抗性基因开放阅读框连接（SEQ ID NO: 10)在一起组成表达元件，终止子使用 PCAMBIA1300载体自身携带的CaMV终止子。先以圆红冬孢酵母的基因组和载体pCAMBIA1300 为模板，用引物proGPD-F(SEQIDN0:ll)和proGPD-R(SEQIDN0:12)、Hyg-F(SEQIDN0: 13)和Hyg-R(SEQ ID从):14)分别扩增出6^)启动子和潮霉素抗性序列；
[0054] 2)潮霉素抗性基因表达元件的构建使用重叠延伸PCR法:先将GH)启动子和潮霉素 抗性基因开放阅读框互为模板和引物进行扩增，条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，58 。(:退火20s，72°C延伸4〇8,20个循环;然后将产物取出加入引物?仰6?04和办8-1?再次进行 上述条件的扩增，35个循环，即将得到GH)启动子和△ 12潮霉素抗性基因两个片段的融合序 列；
[0055] 3)与△ 12脱饱和酶基因表达载体的构建过程相似，GPD启动子和潮霉素抗性基因 重叠延伸的引物分别为proGH)-F和proGPD-R、Hyg-F和Hyg-R。经过重叠延伸PCR的方法融合 成为潮霉素抗性基因 HYGR表达框。结果参见图3。潮霉素抗性基因与pCAMBIA1300载体连接 的酶切位点为Xhol和Bstxl。
[0056] 4. pCAMBIA_FAD12质粒转化根癌农杆菌
[0057] 1)将构建好的载体pCAMBIA-FAD12在42°C热击转化E.coil T1感受态细胞，富集培 养后提取PCAMBIA-FAD12质粒进行根癌农杆菌转化；
[0058] 2)首先进行根癌农杆菌感受态细胞的制备:挑取单菌落，接种于5ml LB培养基中， 28°C、220rpm，过夜培养。将1:50的菌液接种到100ml LB培养基中，培养至0D6Q() = 0.5左右。4 °〇、5000印111、10111；[11，弃上清。用40111110%甘油重悬，冰浴30111；[11。4°0、5000印111、10111；[11，弃上 清。加入2ml 10%的甘油重悬，分装成每管100μ1。在超净工作台中，将感受态与pCAMBIA-FAD12质粒混合液转入到预冷的0.2cm电击杯中，放入电转仪进行电转化。电转化条件为：电 压2400V、电容25yF、电阻200Ω ;电击后立即向电击杯中加入900μ1 LB培养基并置于冰中 2min。将菌液转入到1.5ml ΕΡ管，28°C、150rpm孵育2h，涂布在含有50μg/ml卡纳霉素的LB固 体培养基上，30 °C培养2~3d。
[0059] 5.根癌农杆菌转化圆红冬孢酵母
[0060]分别挑取根癌农杆菌和圆红冬孢酵母单菌落于50μg/ml含卡纳霉素的LB培养基和 YH)培养基中，28 °C，220rpm培养24h。5000rpm，5min收集菌体，以頂培养基（50μg/ml卡纳霉 素)重悬菌体，稀释至〇D 6Q() = 0 · 2，继续培养6h，至0D6Q() = 0 · 6。以1: 5稀释圆红冬孢酵母于新 鲜YTO培养基中，继续培养6h，收集菌体，再次用頂培养基重悬，稀释至0D6QQ = 0.6。两种菌液 各取50μ1混合，将全部菌液涂于带有尼龙膜Hybond_N+膜(Amersham公司，美国）的IM平板 上，25 °C暗培养48h。将Hybond-N+膜转移至YPD (100μg/ml头孢霉素 +200μg/ml潮霉素)上，30 °C培养2-3d。挑取初筛的转化子，在新的YPD(150μg/ml头孢霉素 +300μg/ml潮霉素)上划线， 培养2-3d，挑取转化子，提取基因组进行PCR验证重组子。
[0061] 通过PCR验证得到5株本发明的圆红冬孢酵母，分别命名为1号-5号菌株。
[0062] (IM培养基成分：基本培养基（MM):(K2HP〇4 2g/L，KH2P〇4 1.45g/L，MgS〇4 · 7H20 0.6g/L，NaCl 0.3g/L，CaCl2.2H20 0.01g/L，葡萄糖2g/L，FeS〇4 0.001g/L，ZnS〇4.7H2〇 0.005g/L，CuS〇4 · 5H20 0.005g/L，H3B03 0.005g/L，MnS〇4 · H20 0.005g/L，Na2Mo〇4 · 2H20 0.005g/L，NH4N03 0.5g/L)，2-吗啉乙磺酸(MES)40mM，乙酰丁香酮(AS)200yM，甘油0.5%)。
[0063] 6.圆红冬孢酵母总油脂的检测
[0064] 取上述1号菌株及野生型菌株各10ml (5ml测生物量，5ml提油脂），离心收集菌体。 测生物量的菌放入65°C烘2~3d;提油脂的菌加入5ml浓盐酸和0.5ml H20,80°C水浴lh，然 后加入2ml正己烷和0.75ml无水乙醇，混合液来萃取其中的油脂，此步重复3次，合并上清 液，使用旋转蒸发仪将机溶剂蒸干即得微生物油脂。
[0065] 气相色谱质谱联用仪条件:安捷伦6890N-5975C，HP-INN0WAX极性毛细管柱，0.25μ mX250ymX30m;载气:氦气;载气流量：1 .OmL/min，恒定流量;上样分流比为20:1;进样量1μ L;进样口和检测器温度为280°C;升温程序：180°C保持lmin，10°C/min升温至220°C，2°C/ min升温至240°C，保持后运行3min，全扫描。
[0066]检测结果如表1所示，野生型圆红冬孢酵母在优化条件下α-亚麻酸的产量为 5.05 %，而经过Δ 12脱饱和酶强化过表达的圆红冬孢酵母α-亚麻酸的产量达到了6.82 % ; 野生型圆红冬孢酵母亚油酸产量为22.3 %，而经过Δ 12脱饱和酶强化过表达的圆红冬孢酵 母亚油酸产量为31.7%。经过改造的圆红冬孢酵母菌株亚油酸的产量得到了显著提升，同 时α-亚麻酸的产量也得到了提高。
[0067] 表1、1号圆红冬孢酵母的亚油酸和α-亚麻酸的产量对比
[0069] 表2、2至5号圆红冬孢酵母的亚油酸和α-亚麻酸的产量
[0071] 通过实验说明，高山被孢霉△ 12脱饱和酶在圆红冬孢酵母胞内的强化表达确实有 助于亚油酸和α-亚麻酸的产量的同步提高。
[0072] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技 术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
【主权项】
1. 一种圆红冬孢酵母菌株，其包含高山被孢霉A 12脱饱和酶基因表达元件。2. 根据权利要求1所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述高山被孢霉△ 12脱饱和酶基因 表达元件包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的圆红冬孢酵母菌株，其中圆红冬孢酵母菌株过表达具有活 性的高山被孢霉A 12脱饱和酶。4. 根据权利要求1或2所述的圆红冬孢酵母菌株，其中所述圆红冬孢酵母菌株具有强化 亚油酸和α-亚麻酸生产的能力。5. -种圆红冬孢酵母菌株的制备方法，其包括将SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列引入 圆红冬孢酵母菌株，从而使所述圆红冬孢酵母菌株过表达具有活性的高山被孢霉△ 12脱饱 和酶。6. 根据权利要求5所述的方法，其包括： A 12脱饱和酶基因表达载体的构建，其中所述表达载体包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； 利用所述表达载体转化根癌农杆菌以形成转化的根癌农杆菌； 将所述转化的根癌农杆菌与所述圆红冬孢酵母共培养，从而将A 12脱饱和酶基因转化 至所述圆红冬孢酵母。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述表达载体进一步包含潮霉素抗性基因表达元 件。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述潮霉素抗性基因表达元件由GPD基因的启动 子、潮霉素抗性基因和CaMV终止子组成。9. 一种同时生产亚油酸和α-亚麻酸的方法，其包括培养根据权利要求1至4任一项所述 的圆红冬孢酵母菌株的步骤。10. 根据权利要求9所述的方法，其包括以下步骤： 1) 培养活化的圆红冬孢酵母菌株； 2) 收集步骤1)培养而得到的圆红冬孢酵母菌株，接种至补料发酵培养基进行补料发 酵，所述补料发酵培养基含有碳源、氮源和无机盐，补料发酵过程中，总碳氮比始终维持在 100:0.7~1.5 〇
【文档编号】C12N1/19GK105950494SQ201610408131
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】祁峰, 张明亮, 孙磊, 江贤章, 黄建忠, 陈有为
【申请人】福建师范大学