角膜缘干细胞及其培养方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种角膜缘干细胞及其培养方法和应用，其中，该角膜缘干细胞的培养方法包括步骤如下：获取可增殖角膜缘组织；将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L。本发明角膜缘干细胞的培养方法可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，保证培养得到的角膜缘干细胞的纯度，降低分化程度，从而提高了移植角膜缘干细胞治疗相应眼部疾病的疗效。
【专利说明】
角膜缘干细胞及其培养方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种角膜缘干细胞及其培养方法和应用。
【背景技术】
[0002]角膜由外而内依次包括：上皮层、前弹力层（Bowman膜）、基质层、后弹力层 (Decemet膜)和内皮层。角膜上皮层具有多层细胞，包括与前弹力层连接的基底层细胞。角 膜上皮层具有保护眼球，稳定泪膜，维持角膜透明性等功能，是一种不断自我更新的组织， 而且，角膜上皮层的完整性的维持依赖于表浅细胞不断脱落和基底层细胞不断增殖以取代 脱落细胞来实现，而上皮细胞持续不断的水平向心运动和垂直向上运动就源于角膜缘基底 层干细胞的增殖和分化。
[0003] 角膜缘是角膜和结膜的移行区，角膜缘上皮层多于10层，干细胞存在于角膜缘上 皮层的基底层，在保持角膜的生理生化和角膜的营养及完整性的维持、免疫反应中占有重 要地位。角膜缘干细胞不仅可以分化、增殖为角膜上皮细胞，更重要的是干细胞像一道屏 障，阻止结膜上皮细胞移行至角膜表面，这对于保持角膜的透明性与正常生理功能有着重 要的意义。角膜病是我国第二位致盲眼部疾病。随着现代眼科学的发展，角膜缘干细胞缺乏 或功能障碍的疾病，如眼表泪液病、无虹膜、化学和热烧伤、福射损害、Stevens-Johnson综 合征、眼瘢痕性天疱疮等，可以通过角膜缘干细胞移植进行治疗。因此，角膜缘干细胞对于 上述眼部疾病的治疗起着至关重要的作用。
[0004] 然而，现有方法培养的角膜缘干细胞的纯度低，分化程度高，进而导致使用该角膜 缘干细胞进行移植时，对上述眼部疾病的治疗效果不佳。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于提供一种角膜缘干细胞的培养方法，旨在提高培养的角膜 缘干细胞的纯度，降低分化程度。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供一种角膜缘干细胞的培养方法，所述角膜缘干细胞 的培养方法包括步骤如下：
[0007] 获取可增殖角膜缘组织；
[0008] 将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；
[0009] 其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01~0.09mmol/L。
[0010]优选地，所述将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中的步骤之 后，还包括步骤如下：
[0011] 向所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，使所述碱性成 纤维细胞生长因子的浓度为1~l〇〇ng/ml。
[0012] 优选地，所述获取可增殖角膜缘组织的步骤，包括：
[0013] 获取角膜缘组织；
[0014] 将所述角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当所述角膜缘组织的上皮层的基 底层细胞和与所述基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去所述上层细胞，而获得可 增殖角膜缘组织。
[0015] 优选地，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.06mmol/L。
[0016] 优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10~60ng/ml。
[0017] 优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15ng/ml。
[0018] 优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子为重组牛碱性成纤维细胞生长因子。
[0019] 优选地，所述FBS在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的质量分数为1~14%。
[0020] 本发明还提供一种上述角膜缘干细胞的培养方法获得的角膜缘干细胞。
[0021 ]本发明还提供一种上述角膜缘干细胞在制备治疗角膜病药剂中的应用。
[0022] 本发明技术方案，通过采用低钙的MEM培养基对角膜缘组织进行培养而得到角膜 缘干细胞，同时可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞， 保证培养得到的角膜缘干细胞的纯度，降低分化程度，从而提高了移植角膜缘干细胞治疗 相应眼部疾病的疗效;进一步地，向MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，该碱性成 纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘 干细胞的活性。
【附图说明】
[0023] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图示出的内容获得其他的附图。
[0024] 图1为本发明实施例1培养的角膜缘干细胞进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意 图，图中箭头标示了染色的细胞膜；
[0025] 图2为本发明实施例2培养的角膜缘干细胞进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意 图；
[0026] 图3为本发明实施例3培养的角膜缘干细胞进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意 图，图中箭头标示了染色的细胞膜。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0028] 本发明提供一种角膜缘干细胞的培养方法，该角膜缘干细胞的培养方法包括步骤 如下：
[0029] S1、获取可增殖角膜缘组织；
[0030] S2、将该可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养;其中，Ca2+在该 含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01~0.09mmo 1/L。
[0031]本发明培养方法通过采用低钙的MEM培养基对角膜缘组织进行培养而得到角膜缘 干细胞，可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，保证培 养得到的角膜缘干细胞的纯度，降低了分化程度，从而提高了移植角膜缘干细胞治疗相应 眼部疾病的疗效。
[0032]进一步地，在步骤S2之后，该角膜缘干细胞的培养方法还包括步骤如下：
[0033] S3、向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，使碱性成纤维 细胞生长因子的浓度为1~l〇〇ng/ml。
[0034] 该碱性成纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，增加干细胞的数量， 且可以保证角膜缘干细胞的活性。需要说明的是，根据本领域技术人员的常识，该碱性成纤 维细胞生长因子的浓度仅为向MEM培养基中刚刚加入完时混合均匀的浓度，由于角膜缘组 织具有活性，因此，不能理解为培养一段时间后的浓度。
[0035] 进一步地，该步骤S1具体包括如下步骤：
[0036] S10、获取角膜缘组织；
[0037] S11、将该角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当该角膜缘组织的上皮层的基 底层细胞和与基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去上层细胞，而获得可增殖角膜 缘组织。
[0038]该可增殖角膜缘组织的获取方法简单，只需将角膜缘组织培养一段时间，上层细 胞和基底层细胞即可自行脱离。需要说明的是，本发明角膜缘组织的上皮层具有多层细胞， 其中，角膜缘干细胞产生于角膜缘组织的上皮层的基底层细胞，而基底层细胞以上的上层 细胞会随着基底层细胞的生长而脱落。
[0039] 进一步地，该碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10~60ng/ml。
[0040]当碱性成纤维细胞生长因子浓度保持在10~60ng/ml可以保持对干细胞较高的增 殖促进作用，且保持干细胞较高的活性。
[0041 ] 进一步地，FBS(胎牛血清)在含FBS和Ca2+的MEM培养基中的质量分数为1~14 %。
[0042]该胎牛血清可以为角膜缘组织提供细胞生长必须的营养成份，同时起酸碱度缓冲 液作用。
[0043]本发明还提供一种上述角膜缘干细胞的培养方法获得的角膜缘干细胞。
[0044] 该角膜缘干细胞可以通过施行角膜缘干细胞移植，改善或重建眼表结构，有效地 治疗因角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病，同时提高疗效。
[0045] 本发明还提供一种上述角膜缘干细胞在制备治疗角膜病药剂中的应用。
[0046] 将该角膜缘干细胞应用于制备治疗角膜病药剂中，如角膜片或干细胞制剂等等， 方便角膜缘干细胞的存储和活性保持，同时不影响疗效。
[0047] 现通过实施例对本发明角膜缘干细胞及其培养方法和应用做进一步解释，以详细 说明其技术方案及带来的技术效果。
[0048] 实施例1
[0049] -、获取角膜缘组织：
[0050] 取因各种原因死亡的婴幼儿及儿童的眼球，均无眼部疾患，于死后24h内取材；
[0051] 将人眼球置于洁净工作台上，严格无菌下操作，沿角巩膜缘灰白交界后1mm处剪 切，取下包括角膜缘在内的眼前段组织，将眼前段组织小心移至另一盛有培养液的平皿中， 解剖显微镜下去除虹膜、晶状体等附属组织，再撕去角膜内皮层及后弹力层；
[0052]然后，沿透明角膜内1mm环状剪取约2.0~2.5mm宽的角膜缘组织，并将其分成2mm X2_X2mm的组织块。整个操作中注意尽量避免钳夹培养组织块。
[0053]二、获取可增殖角膜缘组织：
[0054]用无钙MEM培养基培养角膜缘组织14h，可见角膜缘组织的上皮层的基底层细胞与 其上方的上层细胞出现间隙，除去上层细胞，获得可增殖角膜缘组织；
[0055] 三、细胞培养：
[0056]将可增殖角膜缘组织置于20ml含FBS和Ca2+的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙 离子的浓度为〇. 01mm〇l/ml;
[0057] 向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入300ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠 海东大生物制药有限公司），培养至第15天。
[0058] 实施例2
[0059] 本实施例2的获取角膜缘组织、获取可增殖角膜缘组织的步骤与实施例1相同，不 同之处在于：
[0060] 三、细胞培养：
[00611将可增殖角膜缘组织置于20ml含FBS和Ca2+的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙 离子的浓度为0.06mmol/ml;
[0062] 向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入300ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠 海东大生物制药有限公司），培养至第15天。
[0063] 实施例3
[0064] 本实施例3的获取角膜缘组织、获取可增殖角膜缘组织的步骤与实施例1相同，不 同之处在于：
[0065] 三、细胞培养：
[0066]将可增殖角膜缘组织置于20ml含FBS和Ca2+的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙 离子的浓度为〇. 〇9mmol/ml;
[0067] 向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入300ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠 海东大生物制药有限公司），培养至第15天。
[0068] 实施例4
[0069] 本实施例4的获取角膜缘组织、获取可增殖角膜缘组织的步骤与实施例1相同，不 同之处在于：
[0070] 三、细胞培养：
[0071] 将可增殖角膜缘组织置于20ml含FBS和Ca2+的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙 离子的浓度为0.06mmol/ml;
[0072] 向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入200ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子(珠 海东大生物制药有限公司），培养至第15天。
[0073] 实施例5
[0074]本实施例5的获取角膜缘组织、获取可增殖角膜缘组织的步骤与实施例1相同，不 同之处在于：
[0075] 三、细胞培养：
[0076]将可增殖角膜缘组织置于20ml含FBS和Ca2+的MEM培养基中，其中，胎牛血清2g，钙 离子的浓度为0.06mmol/ml;
[0077]向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入1200ng的重组牛碱性成纤维细胞生长因子 (珠海东大生物制药有限公司），培养至第15天。
[0078] 验证例1
[0079] 上皮性钙粘附蛋白（E-cadherin)在人角膜上皮层的分化与增殖过程中发挥着重 要的作用，是角膜缘干细胞及短暂扩充细胞不断分化、迀移，并最终成为终末分化细胞过程 的一个关键角色，它的大量表达起着促进干细胞分化的作用。
[0080] 针对实施例1、实施例2和实施例3培养的角膜缘干细胞，分别采用小鼠抗人单克隆 抗体E-cadherin(北京中山）进行免疫细胞化学染色，染色后，通过扫描电镜进行观察，分别 得到对应的图1、图2、图3;由图1、图3可知，只有极其少量细胞的细胞膜着色，即只有少量表 达了的E-cadherin被染色，大部分细胞未见着色；由图2可知，没有细胞的细胞膜着色，即没 有 E-cadherin 表达。
[0081 ]根据细胞免疫学可知，实施例1和实施例3培养的角膜缘干细胞进行免疫染色时， 只有少量的E-cadherin表达，而实施例2没有E-cadherin表达，进而证明了本发明培养方法 采用低钙MEM培养基对角膜缘组织进行培养，培养得到的角膜缘干细胞较纯，分化程度低， 因此，低钙MEM培养基可以有效地抑制角膜缘干细胞的分化，提高角膜缘干细胞的纯度。显 然，实施例2采用钙离子浓度为0.06mmol/ml的MEM培养基培养角膜缘组织，培养得到的角膜 缘干细胞未分化，纯度最高，即该浓度的低钙培养基的抑制分化效果最好。
[0082] 验证例2
[0083]采用数码照相机拍摄，存储图像数字信息，应用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图 文分析系统，进行计算机图像分析，根据软件设计，测量实施例2、实施例4和实施例5中可增 殖角膜缘组织块的面积/细胞增殖面积。其中，每个实施例重复测量3次，取其均值，且分别 测量培养15天、20天和25天的细胞增殖面积，进而得到如下表1，表1为不同碱性成纤维细胞 生长因子下可增殖角膜缘组织块的面积/细胞增殖面积的比值。
[0084]表 1
[0086]由表1可知，该碱性成纤维细胞生长因子可以有效地促进角膜缘干细胞的增殖，极 大地增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘干细胞的活性。显然，实施例2采用浓度为15ng/ ml的碱性成纤维细胞生长因子对可增殖角膜缘组织进行培养，其促进角膜缘干细胞的增殖 效果非常显著，且远远优于实施例4和实施例5,该可增殖角膜缘组织块的面积/细胞增殖面 积的比值可以低于0.2000。
[0087] 验证例3
[0088] 首先，选取健康SD大鼠5只，分为五组进行验证，即组1、组2、组3、组4和对照组A，然 后对五组SD大鼠均采用陆眠宁5mg/kg、氯胺酮50mg/kg混合液肌肉注射麻醉。消毒结膜囊， 吸取5ul mol/L氢氧化钠溶液滴于已消毒的滤纸片上，待滤纸片中氢氧化钠达饱和状态时， 将滤纸片置于SD大鼠单侧角膜中央30s，弃去滤纸，立即用30ml的生理盐水冲洗烧伤区及结 膜囊；
[0089]其次，组1至组4的SD大鼠分别给予结膜下注射实施例2培养的角膜缘干细胞的PBS 溶液0. lml;对照组A的SD大鼠给予结膜下注射常规药物的PBS溶液0. lml;
[0090]最后，对五组SD大鼠用裂隙灯显微镜观察角膜透明度，并进行分级评价，其中，该 分级评价标准如下：
[0091 ] 0级:全角膜透明，眼内结构清楚可见；
[0092] I级:角膜轻度混浊，虹膜纹理不清，但能看清瞳孔缘，房水状态尚可看清；
[0093] Π 级:瞳孔缘模糊不清，房水状态无法看清，虹膜纹理不清；
[0094] m级:隐约看出虹膜颜色，余窥不清；
[0095] IV级:看不到任何前房结构。
[0096]请参见如下表2,表2为五组SD大鼠的角膜透明度随时间的变化关系。
[0097]表 2
[0099] 由上表2可知，实施例2培养的角膜缘干细胞可以有效地恢复SD大鼠因碱烧伤的角 膜，且角膜透明度可以达到I级，因此，证明了本发明实施例2培养的细胞为角膜缘干细胞， 且本发明实施例2培养的细胞可以有效地治疗各种因角膜缘干细胞缺失或功能障碍引起的 角膜疾病。
[0100] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本 发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效变换，或直接/间接运用在其 他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤如下： 获取可增殖角膜缘组织； 将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养； 其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为O.Ol~0.09mmol/L。2. 如权利要求1所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述将所述可增殖角膜 缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中的步骤之后，还包括步骤如下： 向所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，使所述碱性成纤维 细胞生长因子的浓度为1~l〇〇ng/ml。3. 如权利要求1或2所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述获取可增殖角 膜缘组织的步骤，包括： 获取角膜缘组织； 将所述角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当所述角膜缘组织的上皮层的基底层 细胞和与所述基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去所述上层细胞，而获得可增殖 角膜缘组织。4. 如权利要求1或2所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述Ca2+在所述含 FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.06mmol/L。5. 如权利要求2所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生 长因子的浓度为10~60ng/ml。6. 如权利要求5所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生 长因子的浓度为15ng/ml。7. 如权利要求6所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生 长因子为重组牛碱性成纤维细胞生长因子。8. 如权利要求1所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述FBS在所述含FBS和 Ca2+的MEM培养基中的质量分数为1~14 %。9. 一种如权利要求1至8任意一项所述的角膜缘干细胞的培养方法获得的角膜缘干细 胞。10. -种如权利要求9所述的角膜缘干细胞在制备治疗角膜病药剂中的应用。
【文档编号】C12N5/074GK105950545SQ201610356834
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司