一种中性低温木聚糖酶CaXyn10A及其基因和应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中性低温木聚糖酶CaXyn10A及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的木聚糖酶的具有以下性质：最适pH6.0?6.5，最适温度40℃，在0℃保持20％以上的酶活，比活为453U/mg；具有木聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶的活性；且易于工业化发酵生产。做为一种新型的广谱酶制剂,可广泛用于水产饲料、食品、造纸、能源工业等。
【专利说明】
一种中性低温木聚糖酶CaXynl 0A及其基因和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中性低温木聚糖酶CaXynlOA 及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 木聚糖(xylan)是植物生物质的主要成分，在自然界中的含量仅次于纤维素 (Lynd et al .Microbiology and Molecular Biology Review 2002,66:506-577)，在生物能源方 面有潜在的利用价值。现有生物技术可以高效降解植物中的纤维素成分并转化成可发酵的 葡萄糖，后者在酵母作用下生成生物乙醇。高组分的木聚糖不但限制了纤维素酶与纤维素 的结合反应，抑制催化反应，而且作为副产品排入自然界可引起营养富集化从而破坏生态 系统（Polizeli et al.Applied Microbiology and Biotechnology.2005,67:577_591)〇 因此在生物质生物转化过程中，通常要添加木聚糖酶，一方面去除木聚糖的物理屏障，促进 纤维素酶与纤维素的结合(Hu et al .Biotechnology for Biofuels，2011，4:14;Qing and Wyman CE.Biotechnology for Biofuels，2011，4:18)，另一方面生成的木寡糖也可以进一 步降解成可发酵的木糖，为生物乙醇的生产提供10-25%的原料物质(Ho et al. 1998,64: 1852-1859;Jin et al.Applied and Environmental Microbiology,2004,70:6816-6825) 〇
[0003] 基于氨基酸序列和催化域的结构，大部分木聚糖酶(EC 3.2.1.8)划分在糖苷水解 酶第10和11家族。与专一降解木聚糖的第11家族木聚糖酶相比，第10家族的木聚糖酶具有 宽泛的底物特异性，除了作用于木聚糖外，还可催化纤维素、葡聚糖等多种底物的降解，因 此在工业领域中具有更广泛的应用前景。
[0004] 丝状真菌易于培养、可以大量分泌木聚糖酶而成为木聚糖酶的理想来源(Tanaka et al.Journal of Bioscience and Bioengineering,2005,100:623-630)。大多数丝状真 菌来源的木聚糖酶都是中温或高温酶，在环境温度或低温条件下丧失酶活。现有的生物乙 醇加工工艺包括木质纤维素的酸碱预处理、长时间高温酶反应，从而消耗大量的能量和酸 碱化学试剂，造成成本的大幅度提升和严重的环境污染。因此开发中性低温的木质纤维素 降解酶系在节约能源、保护环境、易于催化反应等方面具有重要的意义（Ji et al .Biotechnology for Biofuels,2014,7:130)。截至目前，只有一个低温木聚糖酶系被报 道(Del-Cid A et al.Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，172:524-532)， 没有真菌来源的低温第10家族木聚糖酶的报道。
[0005] 尽管真菌来源的木聚糖酶已广泛应用于不同的工业领域，获得新型具有优良特性 的中性低温木聚糖酶仍具有重大的研究意义与应用价值。克隆和异源表达低温木聚糖酶， 为生物降解、饲料、食品和造纸工业提供经济有效、环境友好的候补酶，是木聚糖酶应用于 工业化生产所必需的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能高效应用的中性低温木聚糖酶。
[0007] 本发明的再一目的是提供编码上述中性低温木聚糖酶的基因。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0009] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0010] 本发明的另一目的是提供一种制备上述中性低温木聚糖酶的基因工程方法。
[0011] 本发明的另一目的提供上述中性低温木聚糖酶的应用。
[0012] 本发明从枝孢菌(Cladosporium acalyphae SL-16)中分离得到一种新的中性低 温木聚糖酶CaXy η 10 A。
[0013] 本发明提供了一种中性低温木聚糖酶CaXynlOA，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所 不。
[0016] 其中，该酶基因编码3 3 2个氨基酸，N端1 8个氨基酸为其信号肽序列 "mlisnaiaalsvlslasa"（SEQ ID NO.3)。
[0017] 因此，成熟的中性低温木聚糖酶CaXynlOA的理论分子量为34.5kDa，其氨基酸序列 如SEQ ID N0.2所示：
[0019] 本发明的木聚糖酶CaXynlOA在中性(pH 6.0-6.5)和中低温(20-45)范围内均具有 高活性的特性。Cladosporium acalyphae SL-16所产生的木聚糖酶CaXynlOA，其最适pH值 为6.5，在pH6.0~7.2的范围内维持80%以上的酶活性;最适温度为40°C，在20-45°C间均具 有70%以上的酶活力;在0°C条件下还有20%酶活;且对多种木聚糖、葡聚糖、纤维素具有降 解作用。这种性质的中性低温木聚糖酶还未曾有过报道。
[0020] 本发明提供了编码上述中性低温木聚糖酶CaxynlOA。具体地，该基因的基因组序 列如SEQ ID N0.4所示：
[0021]
[0022]本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因 CaxynlOA，DNA全序列分析结果表 明，木聚糖酶CaXyn 10A结构基因 Caxyn 10A全长1224bp，含有4个内含子，cDNA长999bp，+132 ~+186bp，+518 ~+568bp，+815 ~+869bp 和+1074 ~+1137bp 为 55,51，55和6仙口的内含子序 列，其cDNA序列如SEQIDN0.5所示：
[0025] 成熟蛋白理论分子量为34.5kDa。将木聚糖酶基因 CaxynlOA cDNA序列及推导出的 氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。该基因与来源于Aspergillus fumigatus的木聚 糖酶氨基酸序列一致性为63%。说明CaXynlOA是一种新的木聚糖酶。
[0026]本发明还提供了包含上述中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA的重组载体，优选为 pET30-Caxynl0A。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案， 优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pET30(a)上的Ndel和EcoRI限制性酶切位点之 间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET30-Caxyn10A〇
[0027] 本发明还提供了包含上述中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA的重组菌株，优选所述 菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉，优选为重组菌株PET30/ CaxynlOA〇
[0028] 本发明还提供了一种制备中性低温木聚糖酶CaXynlOA的方法，包括以下步骤：
[0029] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0030] 2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及
[0031 ] 3)回收并纯化所表达的木聚糖酶CaXynlOA。
[0032] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆 菌细胞(Escherichia coli)BL21，得到重组菌株pET30/Caxynl0A。
[0033] 本发明还提供了上述中性低温木聚糖酶CaXynlOA的应用。
[0034] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，获得低温木聚糖酶的菌 物资源，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、工业中应用新的中性低温木聚糖酶。本 发明的木聚糖酶最适pH为6.0，在pH6.0~7.2都有较高的酶活性;pH稳定性好；比活力为 453U/mg;具有宽泛的底物特异性。其中性低温的特点，可降低木聚糖酶在工业生产上的能 源成本。pH适应范围提高水产饲料消化能和代谢能，降低配方成本，减少环境污染。其宽泛 的底物特异性可以提尚谷物加工副广品的营养价值，提升伺料广品品质。本木聚糖酶可应 用于酿酒工业，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉层，提高淀粉利用率，增加酒 精的产率。还可以在常温条件下，将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为木 寡糖，而木寡糖可以被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工 业中的应用也显示出其巨大的潜力。水解产物(木糖和低聚木糖)可应用在食品行业，作为 增稠剂、脂肪代替物、益生寡糖和抗冻食品添加剂;在制药工业中木聚糖与其它物质结合使 用，可以延缓药物成分的释放。木聚糖的水解产物还可以进一步转化为液体燃料、单细胞蛋 白、溶剂和低热量甜味剂。
【附图说明】
[0035]图1在大肠菌中表达的重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1:纯化的重组木聚糖 酶;Μ:低分子量蛋白质Marker。
[0036]图2重组木聚糖酶的最适pH。
[0037]图3重组木聚糖酶的pH稳定性。
[0038]图4重组木聚糖酶的最适温度。
[0039]图5重组木聚糖酶的热稳定性。
【具体实施方式】
[0040] 试验材料和试剂
[0041 ] 1、菌株及载体:本发明从枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16,保存于中国农 业科学院农业菌种保藏中心（北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业菌种 保藏中心，100081)，其保藏号为:ACCC32700。大肠杆菌表达载体pET30(a)及菌株BL21由本 实验室保藏。
[0042] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。榉 木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0043] 3、培养基：
[0044] (1 )Cladosporium acalyphae SL-16培养基为马铃薯汁培养基：lOOOmL马铃薯汁， l〇g葡萄糖，25g琼脂，ρΗ5·0。
[0045] (2)大肠杆菌培养基LB(1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、1 % NaCl，ρΗ7.0)。
[0046] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0047] 实施例1 枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16产酶特性
[0048] 将枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16经马铃薯汁培养基培养后，制成孢子悬 液，接种于鼓皮液体培养基中（Luo et al .Enzyme Microbial Technology,2009,45:126-133)，15°C培养7d，以1%的榉木木聚糖为底物，在pH 6.0和30°C条件下反应10min，以DNS法 (Miller 1959)确定其具有木聚糖酶活性。
[0049] 实施例2枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木聚糖酶编码基因 CaxynlOA的克 隆
[0050] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16基因组DNA:
[0051 ]将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min， 然后将研磨液置于50mL离心管中，65°C水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次，在4°C下 lOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于 室温静置5min后，4 °C下lOOOOrpm离心10min。弃上清，沉淀用70 %的乙醇洗涤两次，真空干 燥，加入适量TE溶解，置于-20 °C备用。
[0052] 设计合成特异引物 CaxynlOA-F/CaxynlOA-F:
[0053] CaxynlOA-F：5'-atgctgatttccaacgccattgccg-3'；
[0054] CaxynlOA-R:5' -ttacaaagcgttgaggagagcagtgtaggc-3J；
[0055] 以枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16总DNA为模板进行PCR扩增DPCR反应参 数为：94°C变性5min;然后94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec，30个循环后72 °C保温10min。得到一约1224bp片段，将该片段回收后与PEASY-T3载体相连送三博生物技术 有限公司测序。
[0056] 实施例3枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木聚糖酶基因的RT-PCR分析
[0057] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的 一条链，然后以引物CaxynlOA-E-F/CaxynlOA-E-F扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序 列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。
[0058] CaxynlOA-E-F：5'-ccccatatgatgctgatttccaacgccattgcc-3'；
[0059] CaxynlOA-E-R:5 '-cccgaattcttagtggtggtggtggtggtgcaaagcgttgaggagagcagtg-3，；
[0060] 通过比较木聚糖酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因有4个内含子，cDNA长 999bp，编码332个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其信号肽序列。所测出的基 因 CaxynlOA的成熟蛋白部分核甘酸序列与GenBank上的木聚糖酶基因序列进行同源比较， 分离克隆得到的编码木聚糖酶的基因为新基因。
[0061]实施例4重组木聚糖酶的制备。
[0062] 将表达载体pET30(a)进行双酶切（Nedl+EcoRI)，同时将编码木聚糖酶的基因 CaxynlOA双酶切(Nedl+EcoRI)，切出编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET30(a)连 接，获得含有枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16木聚糖酶基因 CaxynlOA的重组质粒 pET30_Caxynl0A并转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌菌株pET30/Caxynl0A。
[0063]以同样的方法构建包含信号肽序列的重组表达载体，并获得重组菌株。
[0064] 取含有重组质粒的BL21菌株，接种于100mL LB培养液中，16°C150rpm振荡培养12h 后，加入0.6% IPTG诱导10h，收集细胞，超声波破碎，离心收集上清液。测定木聚糖酶的活 力。重组木聚糖酶的表达量为1. SAU/mkSDS-PAGE结果（图1)表明，重组木聚糖酶在大肠杆 菌中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的15%以 上。
[0065] 实施例5重组木聚糖酶CaXynlOA的性质测定
[0066] DNS法:具体方法如下：在pH6.5,40°C条件下，lmL的反应体系包括100yL适当的稀 释酶液，900yL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定0D 值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出Ιμπιο?还原糖的酶量。
[0067] 1、重组木聚糖酶CaXynlOA的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
[0068] 将实施例4纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底 物木聚糖用不同pH的0.1m〇l/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中30°C下进行木聚糖酶活力测 定。结果（图2)表明，CaXyn 10A的最适pH为6.0，在pH6.0~7.2的范围内，酶活性均维持在最 大酶活性的80 %以上。木聚糖酶于上述各种不同pH的缓冲液中30 °C处理60min，再在pH6.0 缓冲液体系中40°C下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果（图3)表明木聚糖酶在pH 4.0-10.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70%以上，这说明此酶具有较 好的pH稳定性。
[0069] 2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
[0070] 木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(PH6.0)缓冲液体系 及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在 pH6.0、40°C下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图4)表明其最适温度为40°C。酶 的热稳定性性试验表明（图5)，重组酶在30°C时稳定性非常好。40°C下保温60min，完全失去 酶活。
[0071 ] 3、木聚糖酶的1(?值测定方法如下：
[0072] 用不同浓度的榉木木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体 系中，20 °C和40 °C下测定酶活性，计算出其在20 °C和40 °C下的Km、Vmax、kca4Pkcat/K m值。经测 定，此木聚糖酶在40°C下以木聚糖为底物的U直为1.87mg/mL，最大反应速度VmaA331.6μ mol/min · mg，kcat值为 190.7/s和kcat/Km值为 102.0ml/mg · s;在20°C下以木聚糖为底物的km 值为 12 · 23mg/mL，最大反应速度Vmax为322 · 9ymol/min · mg^c^t值为 185 · 7/s和kc^t/lUIS 15.2ml/mg · s
[0073] 4、不同金属离子化学试剂对CaXynlOA酶活的影响测定如下：
[0074] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为5mmo 1 /L。在40 °C、pH6.0条件下测定酶活性。结果(表1)表明，大 多数离子和化学试剂在浓度为5mmol时重组木聚糖酶的活力没有明显变化。但是Ag+强烈抑 制其活力，Pb2+，Zn2+，SDS和EDTA有部分抑制作用。Ni2+和Co 2+在5mmol时能使重组酶活力增加 到原来的1.27和1.16倍。
[0075] 表1.各种化学试剂对木聚糖酶CaXynlOA活力的影响
[0078] 5、CaXynlOA的底物特异性
[0079]在酶促反应体系中加入不同的底物，研究CaXynlOA的酶活性。在40°C、pH6.0条件 下测定酶活性。结果(表2)表明，CaXynlOA同时具有木聚糖酶、纤维素酶和葡聚糖酶的活性。 [0080] 表2. CaXynlOA的底物特异性
[0083] 6、CaXynlOA木聚糖酶降解榉木木聚糖产物的分析如下：
[0084] 在500yL 1 %的木聚糖中加入1 OOyL纯化的酶液，最适温度下保温12h。用无水乙醇 将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安培(HPAEC-PAD)检 测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：木聚糖酶CaXynlOA降解榉木木聚糖的产 物主要是木二糖，木三糖和木四糖。产物中木二糖含量为50.1 %，木三糖含量为45.9 %，和 木四糖含量为4.0%。
【主权项】
1. 一种中性低温木聚糖酶CaXynlOA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO .2所示。2. -种中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA，其特征在于，编码权利要求1所述的中性低温 木聚糖酶CaXynlOA。3. 如权利要求2所述的中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA，其特征在于，其碱基序列如 SEQ ID NO.4或5所示。4. 包含权利要求2所述中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA的重组载体。5. 包含权利要求2所述中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA的重组载体pET30-Caxynl0A。6. 包含权利要求2所述中性低温木聚糖酶基因 CaxynlOA的重组菌株。7. 如权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、乳 酉支杆囷、曲霉或木霉。8. -种制备权利要求1所述中性低温木聚糖酶CaXynlOA的方法，其特征在于，包括以下 步骤： 1) 用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及 3) 回收并纯化所表达的中性低温木聚糖酶CaXynlOA。9. 权利要求1所述中性低温木聚糖酶CaXynlOA的应用。
【文档编号】C12N15/56GK105950591SQ201610343782
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】姚斌, 马锐, 柏映国, 黄火清, 罗会颖, 苏小运, 王亚茹, 王苑, 师霞
【申请人】中国农业科学院饲料研究所