一种黑曲霉生产2，3-2巯基-苯酸的方法
【专利摘要】一种微生物生产2，3?2巯基?苯酸的方法，具体是一种黑曲霉生物催化制备医药中间体2，3?2巯基?苯酸的方法，微生物发酵液中加入底物，进行生物催化反应，产品收率高，反应条件温和，常温、常压操作，解决了现有方法生产条件苛刻的困难。
【专利说明】
一种黑曲霉生产2,3-2巯基-苯酸的方法
技术领域
[0001] 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到黑曲霉生物催化制备医药中间体2,3_ 2巯基-苯酸的技术。
【背景技术】
[0002] 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点，是可持续 发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸 引力的应用领域之一，在工业生物催化中一直扮演着重要角色。
[0003] 芳烃的羧化反应是一类重要的反应，其产物为芳烃羟基羧酸，是重要的药物合成 起始原料。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳烃与C0 2反应，反应压力高达lOMPa， 温度高达140-380°C，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变这种状况。采 用微生物催化，可以在常温、常压下反应生产芳烃羟基羧酸，条件温和，选择性高，副反应 少，产率高。
[0004] 本发明将采用微生物催化反应，生产芳烃羟基羧酸:2，3-2巯基-苯酸。
【发明内容】
[0005] 本发明采用黑曲霉催化制备2，3-2巯基-苯酸，反应式如下：
底物1，2-2巯苯(1)经黑曲霉催化反应，得到产物2，3-2巯基-苯酸(2 )。有多种微生物可 以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用黑曲霉作为催化剂，因为其催化反应的效 果最好，副产物极少，反应收率高。
[0006] 许多霉菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发 明选用黑曲霉菌株为DSM-11167，其催化反应效果最佳。
[0007] 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。尽管表面活性 剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质 为反应的限制环节，所以，还需采取措施，以提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是 提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后，在强烈搅拌下，反应液成为乳液，使 得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须 生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。 大量实验表明，对于本反应，加入吐温80 21-23g/L是最佳的。
[0008] 反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可以破乳，包括盐析法： 加入氯化钠、硫酸铵或氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸镁;凝聚法:加入聚合氯化铝、明矾等； 或者将上述2类混合加入;加热等。不同产物，所用的方法不同，实验表明，对于本反应，加入 1.7%的硫酸镁+0.1%的聚合氯化铝是最佳的。
[0009] 羧化反应中，采用NaHC〇3提供C02,实际上，有多种物质可以提供C02,但是，通过大 量实验，结果表明，对于本发明，使用NaHC0 3是最佳的。由于加入NaHC03会使反应液的pH升 高，而适宜的PH，对微生物催化反应致关重要，所以，不能一次加入，必须采用流加方式加入 NaHC03。然而，即使流加 NaHC03，反应液的pH仍然升高，所以，还必须采取措施，维持反应液处 于适宜的PH，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液是 适宜的方法，调节NaHC0 3与盐酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH处于最佳范围，使生物 催化反应正常进行。
[0010] 可以明显看出，本发明所涉及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、 C02供体选择，还有反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众 多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反 应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所以，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催 化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。
[0011] 培养介质： 1、种子培养基成份为：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，麦芽浸膏 25-30 g，硫酸铵0.5-0.7g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。
[0012] 2、培养液成份:玉米浆（以干物质计)含量为22-25g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄 糖24-26 g/L，麦芽浸膏20-22g，硫酸铵0 · 5-0 · 7g/L，硫酸镁0 · 3-0 · 4g/L，磷酸二氧钾1 · 8-2.3g/L，碳酸钙 0.7 g/L，硫酸亚铁 0.18 g/L，硫酸锰 0.025 g/L;pH 6.6。
[0013] 3、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。
[0014]微生物发酵液制备。黑曲霉DSM-11167经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵 罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121°C高压灭菌30分钟冷却至30-31°C，将黑曲霉菌种 子液接种至发酵罐，接种比例为8-9 %，通气比为1.5-1.7V/V ·分钟，30-31°C培养42-46小 时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-94g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
[0015] 用HPLC测产品收率及纯度，C18柱，紫外检测器，波长254nm，流动相为pH3的磷酸缓 冲液：甲醇=90:10。
[0016] 生物催化反应:发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1，2_ 2巯苯，使浓度为94-96g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 2l-23g/L，葡萄糖20-23g/L、 小麦麸皮粉18-22 g/L、麦芽糖35-38g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至34-36°C时，搅拌乳 化，进行生物催化反应，反应时间为40-45小时；反应开始时，立即流加浓度为5%的NaHC0 3 水溶液，同时流加浓度为1 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶液的流加速率，维持 pH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.5V/V·分钟，即每分钟通气量为 0.4-0.5倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液萃取3 次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3-2巯基-苯酸，反应转化率98-99.5 %， 产品收率96-97.5%。
[0017] 实施例！ 培养液成份:玉米浆（以干物质计)含量为22-25g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖24-26 g/L，麦芽浸膏20-22g，硫酸铵0 · 5-0 · 7g/L，硫酸镁0 · 3-0 · 4g/L，磷酸二氧钾 1 · 8-2 · 3g/L， 碳酸钙0.7 g/L，硫酸亚铁0.18 g/L，硫酸锰0.025 g/L;pH 6.6。
[0018] 微生物发酵液制备。黑曲霉DSM-11167经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵 罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121°C高压灭菌30分钟冷却至30-31°C，将黑曲霉菌种 子液接种至发酵罐，接种比例为8-9 %，通气比为1.5-1.7V/V ·分钟，30-31°C培养42-46小 时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-94g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。
[0019] 生物催化反应：15L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 1，2-2巯苯，使浓度为94-96g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 21-23g/L，葡萄糖20-23g/L、麦芽糖35-38g/L、小麦麸皮粉18-22 g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至34-36°C时， 搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为40-45小时;反应开始时，立即流加浓度为5%的 NaHC03水溶液，同时流加浓度为1 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶液的流加速率，维 持pH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.5V/V ·分钟，即每分钟通气量 为0.4-0.5倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液萃取 3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2,3-2巯基-苯酸，反应转化率98.5%，产 品收率96.5%。
[0020] 实施例2 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0021 ]生物催化反应:150L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 1，2-2巯苯，使浓度为94-96g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 21-23g/L，葡萄糖20-23g/L、麦芽糖35-38g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至34-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催 化反应，反应时间为40-45小时；反应开始时，立即流加浓度为5%的NaHC03水溶液，同时流 加浓度为1 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.4-6.6，所加入 的物料均经过灭菌处理;通气比为〇. 4-0.5V/V·分钟，即每分钟通气量为0.4-0.5倍反应液 体积，反应结束后，破乳，分别用〇. 2倍、0.15倍、0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各 萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3-2巯基-苯酸，反应转化率98-99.5 %，产 品收率96-97.5%。
[0022] 实施例3 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0023]生物催化反应：1000L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底 物1，2-2巯苯，使浓度为94-96g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 21-23g/L，葡萄糖20-23g/L、麦芽糖35-38g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至34-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催 化反应，反应时间为40-45小时；反应开始时，立即流加浓度为5%的NaHC03水溶液，同时流 加浓度为1 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.4-6.6，所加入 的物料均经过灭菌处理;通气比为〇. 4-0.5V/V·分钟，即每分钟通气量为0.4-0.5倍反应液 体积，反应结束后，破乳，分别用〇. 2倍、0.15倍、0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各 萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物2,3-2巯基-苯酸，反应转化率98%，产品收 率 96.1%。
[0024] 实施例4 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。
[0025]生物催化反应:15000L发酵罐，即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底 物1，2-2巯苯，使浓度为94-96g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 21-23g/L，葡萄糖20-23g/L、麦芽糖35-38g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至34-36 °C时，搅拌乳化，进行生物催 化反应，反应时间为40-45小时；反应开始时，立即流加浓度为5%的NaHC03水溶液，同时流 加浓度为1 %的盐酸水溶液，调节NaHC03与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.4-6.6，所加入 的物料均经过灭菌处理;通气比为〇. 4-0.5V/V·分钟，即每分钟通气量为0.4-0.5倍反应液 体积，反应结束后，破乳，用逆流萃取机萃取，萃取液为乙酸乙酯，蒸出有机相的乙酸乙酯， 蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3-2巯基-苯酸，反应转化率99.5 %，产品收率97.5 %。
【主权项】
1. 一种黑曲霉生物催化制备2，3-2巯基-苯酸的方法，其特征在于黑曲霉发酵液中加入 底物1，2-2巯苯，使浓度为94-96g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 21-23g/L，葡萄糖 20-23g/L、麦芽糖35-38g/L、小麦麸皮粉18-22 g/L，121°C高压灭菌30分钟;冷却至34-36°C 时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为40-45小时;反应开始时，立即流加浓度为5% 的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1 %的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率， 维持pH6.4-6.6，所加入的物料均经过灭菌处理;通气比为0.4-0.5V/V·分钟，即每分钟通气 量为0.4-0.5倍反应液体积，反应结束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相蒸出乙酸乙 酯，得到产物2，3-2巯基-苯酸，反应转化率98-99.5 %，产品收率96-97.5 % ;所述发酵液由 培养液发酵微生物得到。2. 权利要求1所述的方法，其特征在于黑曲霉发酵液制备过程如下：黑曲霉DSM-11167 经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液;发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121°C高压 灭菌30分钟冷却至30-31°C，将黑曲霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9%，通气比为 1.5-1.7V/V ·分钟，30-31°C培养42-46小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-94g/L，此发酵 液用作生物催化反应催化剂；发酵罐中培养液成份为：玉米浆（以干物质计）含量为22-25g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖24-26 g/L，麦芽浸膏20-22g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸 镁0.3-0.48/1，磷酸二氧钾1.8-2.38/1，碳酸钙0.7 8/1，硫酸亚铁0.18 8/1，硫酸锰 0.025 g/L;pH 6.6。
【文档编号】C12P11/00GK105950675SQ201610464880
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】张媛媛, 刘均洪
【申请人】青岛科技大学