西葫芦花叶病毒的全基因序列及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及西葫芦花叶病毒的全基因序列及其检测方法。所述西葫芦花叶病毒的基因组经反转录后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据病毒全基因序列设计出可快速检测西葫芦花叶病毒的特异性引物和探针，并在此基础上建立了荧光定量PCR检测方法，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境以及携带此病毒的棉蚜体内快速、准确地检测出西葫芦花叶病毒。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对西葫芦花叶病疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。
【专利说明】
西葫芦花叶病毒的全基因序列及其检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物学及分子生物学检测领域，具体地说，涉及西萌芦花叶病毒的 全基因序列及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 西萌芦病毒病又称花叶病，是萌芦科蔬菜的一个重要病害。据近几年调查，无论是 露地栽培还是保护地栽培均有发生，发病严重地块可以造成30%~40%减产。西萌芦病毒 病是由多种病毒单独或复合侵染所致。通常症状表现为花叶、皱缩、混合等3种类型。花叶型 表现为叶片上出现黄绿不匀的斑驳，可引起全株萎蔫。皱缩型表现为沿新叶叶脉出现浓绿 色隆起皱纹或叶片变小，出现蕨叶、裂片，在果面出现花斑或产生凹凸不平的瘤状物，果实 多畸形，严重时病株枯死。混合型表现为花叶、皱缩两种混合病症。
[0003] 棉姐(Aphis gossypii Glover)是广泛分布于世界各国的一种常见害虫，取食和 传播植物病毒，对农业生产造成严重影响。已报到的棉蚜传播病毒病种类包括小西萌芦黄 花叶病毒病(Zucchini yellow mosaic virus)等多种植物病毒。萌芦科瓜类为棉姐的主要 侨居寄主，这就使得棉蚜作为病毒传毒媒介造成的危害十分严重。棉蚜是西萌芦病毒病传 播的主要途径，尽早检测棉蚜携带病毒，对病毒病的防治具有重要的应用价值。
[0004] 对西萌芦病毒病检测鉴定，目前主要有生物学方法、电镜法、血清学方法和分子生 物学方法。其中血清学方法具有特异性好、操作简便、检测周期短的特点，但在准确性和灵 敏度方面还有一定的缺陷;分子生物学方法具有特异性强、灵敏度高的特点，能够弥补血清 学方法的缺点。分子生物学方法需要依据病毒的核酸序列信息。西萌芦花叶病毒基因信息 的获得为开发棉蚜带毒检测方法和西萌芦花叶病毒分子诊断技术的开发提供坚实的基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新的西萌芦花叶病毒及其全基因序列。
[0006] 本发明的另一目的是提供上述西萌芦花叶病毒的检测方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的西萌芦花叶病毒，该病毒基因组经反转录后得到 的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。含有3个读码框，0RF1、0RF2和0RF3大小分别为7140bp、 1416bp 和603bp(图1)。
[0008] 本发明还提供所述病毒的全基因序列。该病毒属于正链ssRNA病毒，无 DNA阶段，属 于浓核病毒属(Densovirus)类病毒，染病西萌芦表现为混合类型症状。
[0009] 本发明还提供用于检测所述西萌芦花叶病毒的特异性PCR引物，引物序列为15~ 45个，优选18-24个连续核苷酸，所述引物用于样品经反转录PCR后检测扩增产物。正向引物 和反向引物符合Tm值为55-65 °C，且二者Tm值相差不超过2 °C，GC含量为40 % -60 %。
[0010] 本发明还提供用于检测所述西萌芦花叶病毒的特异性探针，探针序列为15-45个， 优选20-30个连续核苷酸，所述探针针对RNA或DNA样品进行检测。
[0011]所述探针可以与上述引物配合使用。探针的Tm值为65-70°C，通常比引物Tm值高5- 10 °C (至少高5 °C)，GC含量为40 % -70 %，探针的5 '端应避免使用鸟嘌呤。
[0012] 本发明还提供用于荧光定量PCR检测所述西萌芦花叶病毒的特异性引物和探针， 包括：
[0013] Primer-F:5 '-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3 '
[0014] Primer-R:5 '-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3 '
[0015] Probe:5，-CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3 '
[0016] 其中，探针5'端带有荧光基团，3'端带有荧光淬灭基团。
[0017] 本发明还提供基于荧光定量PCR技术检测所述西萌芦花叶病毒的方法，即利用上 述引物F、R和探针进行荧光定量PCR检测。
[0018] 具体地，所述方法包括以下步骤：
[0019] 1)提取样品中的总RNA，反转录合成cDNA;
[0020] 2)以步骤1)的cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应；
[0021] 3)分析扩增产物。
[0022]其中，荧光定量PCR反应体系为： 模板 cDNA 2μ1 lOmMdNTPs 2μ! ΙΟμΜ 引物F 1μ! ΙΟμΜ 引物R ΙμL
[0023] ΙΟμΜ 探针 0.5μ1 5υ/μΙ Γ叫 DMA聚合酶 0.2μΙ 10 x PCR反应缓冲液（含Mg2 ) 2,5μ1 ddH20 补足至25μ1
[0024] 荧光定量PCR反应程序为：94 °C3min;然后98 °C 10s，68 °C 60s，40个循环，并且在第2 步时收集荧光。
[0025]本发明进一步提供含有所述引物和/或探针的检测试剂盒。
[0026] 本发明公开了西萌芦花叶病毒的全基因序列，并根据全基因序列设计出可快速检 测该病毒的特异性引物和探针，并在此基础上建立了荧光定量PCR检测方法，可从发病植物 组织及土壤中复杂的病原菌环境以及携带此病毒的棉蚜体内快速、准确地检测出西萌芦花 叶病毒。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对西萌芦花叶病疫 情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明西萌芦花叶病毒基因组序列中含有的3个读码框。
[0028]图2为本发明实施例1中构建的西萌芦花叶病毒的系统进化树。
[0029]图3为本发明实施例2中荧光定量PCR扩增情况，其中浓度1-8分别代表1、10、100、 200、400、800、1600 和 3200倍稀释的 cDNA样品。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0031] 实施例1西萌芦花叶病毒全基因序列的获得
[0032] 棉姐于2011年6月12日采自于中国农业科学院棉花研究所东试验农场棉田（36° 5 ' 34.8'%114°31'47.191)。采集后挑选无翅成蚜，置于液氮中速冻，随即进行总1?^提取。利 用II lumina的Solexa高通量测序平台构建Paired-End片段库进行表达谱测序。对测得原始 数据进行质量控制，步骤为采用滑动窗口法去除低质量片段，切除原始序列中含N部分序 列。然后使用软件abyssl · 3 ·0进行Denovo拼接，得到Unigenes。使用Blastn将Unigenes与 661113&111<：中核酸数据库1^1(111^口：//\￥?^.11(313；[.111111.11；[11.80￥/)进行比对化-￥&1116<10-5)，同 时使用BlastX工具将Unigenes与GenBank中核酸数据库NR进行比对，挑选与病毒有同源关 系的序列进行分析。
[0033] 结果获得一条大小为9235bp的病毒基因组序列，不含3'端polyA尾巴。该基因组序 列含有3个读码框，0RF1、0RF2和0RF3大小分别为7140bp、1416bp和603bp(图1)。通过摩擦接 种试验证明该病毒是一种西萌芦花叶病毒。
[0034] 利用本发明病毒基因组0RF1编码的氨基酸序列（SEQ ID N0: 2)，并在GenBank数据 库(WWW.ncbi .nlm.nih.gov/genbank/)搜索与其同源性较高的病毒氨基酸序列，获得8种与 其相似度较高的病毒氨基酸序列，使用MEGA6.0软件构建系统进化树。结果显示，由病毒基 因组序列推导的氨基酸序列与Loreto病毒、Negev病毒等聚在一起，而与已报道的植物病毒 有一定的距离（图2)。
[0035] 实施例2荧光定量PCR检测
[0036] 1、特异性引物和探针的设计与合成：
[0037]根据西萌芦花叶病毒基因组经反转录后得到的核苷酸序列（SEQ ID N0:1)，使用 Beacon Designer7.7软件设计用于焚光定量PCR(Taqman)检测该病毒的特异性引物和探 针，包括：
[0038] Primer-F:5 '-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3 '
[0039] Primer-R:5 '-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3 '
[0040] Probe: 5 ' -CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3 '，5 ' 标记FAM荧光，3 ' 标记TAMRA。
[0041] 引物及探针的合成由上海英骏生物技术有限公司完成。
[0042] 2、病毒RNA的提取
[0043] 2014年6月18日，将采集自中国农业科学院棉花研究所试验农场发病西萌芦叶片 和寄生于其上的棉蚜，带回实验室加入液氮进行组织研磨，然后以体积比1:50加入无菌水。 于4°C，6000rpm离心30min，取上清。将上清过0.45μΜ滤膜，然后提取上清中的总RNAANA的 提取按照Promega公司的RNA gents Total RNA Isolation System Kit说明进行。
[0044] 3、反转录合成cDNA
[0045] 使用Promega公司反转录试剂盒（货号:A3500)，取5yg总RNA反转录获得cDNA的第 一链，反应体系如下：总RNA 10yL(5yg)、01 igo(dT) (20ymol/L) 1 · 5yL、10 X buffer 2 · 5yL、 dNTP 111丨叉（2.51111]1〇1/1^)241^、灭菌水84匕）
[0046]将上述反应体系含各成分的混合物在42°C水浴lmin后，向其中加入lyL(200U) Superscript? II RT，轻轻混合，42°C保温50min;70°C水浴15min，终止该反应；获得cDNA第 一链。
[0047] 4、荧光定量PCR扩增反应
[0048] 将制备的cDNA样品分为8组，分别按如下倍数稀释：1、10、100、200、400、800、1600 和3200。然后配制如下反应体系。
[0049] 荧光定量PCR反应体系为： 模板 cDNA 2li! lOmMdNTPs 2μΙ ΙΟμΜ 引物F ΙμL ΙΟμΜ引物R ΙμL
[0050] ΙΟμΜ 探针 0 5μΙ 5υ/μ1 DNA聚合酶 0.2μ:1 10 χ PCR反应缓冲液（含Mg2+) 2.5μ1 ddH20 补足至25μ1
[0051 ] 用Ependorf公司的Mastercycler ep realplex 4仪器，按照下列反应条件进行实 时荧光定量PCR: 94°C 3min;然后98 °C 10s，68 °C60s，40个循环，第2步时收集荧光。反应结束 后收集每组样品的CT值。
[0052]结果显示（图3)，该试剂盒能检测出稀释1600倍的样品。以CT值为Y轴，样品浓度为 X构建标准曲线，根据公式Ε= α〇_1/#$5-1) X 100%计算扩增效率，得到扩增效率为99.5%， 灵敏度高，能较好地满足生产需要。
[0053]利用上述荧光定量PCR反应体系，可对不同西萌芦花叶病毒染病样品进行定量分 子检测，应用该方法可准确预测大田西萌芦花叶病毒消长动态和疫情发展趋势，便于及时 确定病害最佳防控时期，达到高效治理西萌芦花叶病害的目的。
[0054]实施例3田间棉蚜携带西萌芦花叶病毒检测
[0055]为了检测田间棉蚜携带西萌芦花叶病毒的情况，分别在2014年8月和9月分别采集 黄河流域河南安阳县西萌芦田、棉田、黄瓜田棉蚜，每地每时期各采集50头，单头提取总 RNA，按Promega公司的RNA gents Total RNA Isolation System Kit说明进行。按实施例3 的方法进行荧光定量PCR检测。
[0056]结果显示，8月份在西萌芦田采集棉蚜中有18头携带西萌芦花叶病毒，在棉田采集 棉蚜中有5头携带西萌芦花叶病毒，在黄瓜田采集棉蚜中有9头携带西萌芦花叶病毒。8月份 在西萌芦田采集棉蚜中有16头携带西萌芦花叶病毒，在棉田采集棉蚜中有3头携带西萌芦 花叶病毒，在黄瓜田采集棉蚜中有11头携带西萌芦花叶病毒。可见西萌芦花叶病毒是一类 棉蚜携带率较高的病毒。
[0057]实施例4西萌芦花叶病毒接种试验
[0058]为进一步了解确定西萌芦花叶病毒与西萌芦病毒病的关系，通过摩擦接种试验， 对健康西萌芦苗进行接种，每处理12株，3个重复，同时做清水摩擦对照。观察接种后发病情 况，并检测病毒的存在情况。按实施例3的方法进行荧光定量PCR检测。
[0059]结果显示（表1)，在接种后发病西萌芦植株中，全部检测到西萌芦花叶病毒的存 在。
[0060] 表1摩擦接种试验结果
[0061]
[0062] 进一步研究表明，未在萝卜蚜、麦二叉蚜、麦长管蚜、甘蓝蚜等非棉蚜的其他种类蚜 虫中检测到西萌芦花叶病毒的存在，说明西萌芦花叶病毒是专一侵染棉蚜的病毒种类。
[0063] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 西萌芦花叶病毒，该病毒基因组经反转录后得到的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 权利要求1所述病毒的全基因序列。3. 用于检测权利要求1所述病毒的特异性PCR引物，其特征在于，引物序列为15~45个， 优选18-24个连续核苷酸，所述引物用于样品经反转录PCR后检测扩增产物。4. 根据权利要求3所述的引物，其特征在于，正向引物和反向引物符合Tm值为55-65Γ， 且二者1'111值相差不超过2°(：，6(：含量为40%-60%。5. 用于检测权利要求1所述病毒的特异性探针，其特征在于，探针序列为15-45个，优选 20-30个连续核苷酸，所述探针针对RNA或DNA样品进行检测。6. 根据权利要求5所述的探针，其特征在于，所述探针与权利要求2或3所述引物配合使 用，其Tm值为65-70 °C，GC含量为40 % -70 %。7. 用于荧光定量PCR检测权利要求1所述病毒的特异性引物和探针，包括： Primer-F:5 '-TTAGGAACGATTCCATTCTT-3 ' Primer-R:5 '-TTCGATCTCACTTATGTAGC-3 ' Probe:5 '-CTCGTCAAGCACACTAAGGCA-3 ' 其中，探针5 '端带有荧光基团，3 '端带有荧光淬灭基团。8. 基于荧光定量PCR技术检测权利要求1所述病毒的方法，其特征在于，利用权利要求7 所述引物和探针进行荧光定量PCR检测。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品中的总RNA，反转录合成cDNA; 2) 以步骤1)的cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增反应； 3) 分析扩增产物； 其中，荧光定量PCR反应体系为： 模板 cDNA 2μ1 lOmMdNTPs 2μ1 1μ1 ΙΟμΜ 引物R ΙμL ΙΟμΜ 探针 0.5μ1 5υ/μ1 Γ叫 DNA聚合酶 0.2μΙ 含Mg2的+10 χ PCR反应缓冲液 2.5μ1 ddH?0 补足至25μ1 荧光定量PCR反应程序为:94°C3min;然后98°(：1〇8,681€6〇8,40个循环，并且在第2步时 收集荧光。10. 含有权利要求3-7所述引物和/或探针的检测试剂盒。
【文档编号】C12Q1/70GK105950781SQ201610319729
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】张帅, 崔金杰
【申请人】中国农业科学院棉花研究所